一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法。


背景技术：

2.结直肠癌是常见的消化道肿瘤，其发病率仅次于肺癌和乳腺癌，在全世界居于第三位。预计到2030年，每年将有220万例新发病例和110万人死亡。手术切除是早期结直肠癌的主要治疗方式，但是多数患者首次确诊时已处于中晚期，或伴随远端转移，提示预后较差。化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等多学科协作治疗(multi-disciplinary treatment，mdt)模式一定程度上可提高结直肠癌患者的临床疗效。以奥沙利铂为基础的folfox(氟尿嘧啶+奥沙利铂+亚叶酸钙)和以伊立替康为基础的folfiri(氟尿嘧啶+伊立替康+亚叶酸钙)是结直肠癌患者常用的化疗方案，gercor研究中将两者互为一、二线治疗方式。folfoxiri(氟尿嘧啶+奥沙利铂+伊立替康+亚叶酸钙)较两药联合可显著改善患者预后，但相应的毒副作用增加。结直肠癌是一种高度异质性肿瘤，肿瘤间和肿瘤内的差异性严重影响肿瘤的生长、侵袭能力、对药物的敏感性以及预后。因此，标准的治疗方式并不能使每位患者最大程度获益，结合肿瘤病理特征、药物毒副作用以及患者的耐受程度，从传统治疗转化为个体化精准治疗模式是临床上提高患者获益、改善患者生存质量、减少过度用药的有效方式。
3.体外药敏检测是评估肿瘤对药物敏感性比较直观和有效的方式。目前，体外肿瘤模型主要有细胞系、类器官(organoids，pdo)和人源肿瘤异种移植(patient-derived tumor xenograft，pdx)模型，促进了对肿瘤发生发展、异质性、药理学及耐药机制的研究。但是，二维细胞类型单一，缺少肿瘤异质性，不能完全反应患者的肿瘤特征；pdo主要由肿瘤干细胞组成，3d培养依赖于matrigel基质胶，缺少必要的肿瘤微环境成分(如间质细胞等)，并且随着类器官的长期体外培养可能导致细胞发生变化；而pdx模型存在成瘤率低、培养周期长、花费较高等局限性，因此不能用于大规模的临床药物筛选。
4.源于患者的肿瘤样细胞簇(patient-derived tumor-like cell cluster，ptc)是一种新兴的体外药敏检测3d细胞模型。免疫荧光、流式细胞分析和转录组测序分析显示，ptc由肿瘤干细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等多种细胞组成，一定程度上模拟了肿瘤微环境，反应了患者体内肿瘤的客观情况。he染色，免疫组织化学(ihc)，免疫荧光(if)和全基因组测序(whole genome sequencing，wgs)分析表明，体外培养ptc与患者原位肿瘤在细胞形态结构，病理特点，细胞遗传变异方面均保持高度一致性。并且不同患者及同一患者不同病灶来源的ptc具有异质性。ptc体外药敏检测与临床治疗进行双盲验证，整体一致性达96.6％。因此，ptc在形态结构、病理特征以及遗传变异上与原位肿瘤相似，可以代替患者进行体外高通量药物筛选，在结直肠癌的精准化疗研究中具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明针对结直肠癌患者传统化疗标准不能使患者完全受益以及现有技术的不足，结合ptc模型，提供了一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法。该方法使用ptc模型，对folfox、folfiri、folfoxiri进行高通量药物筛选，培养周期短，成本低，药敏检测接近临床真实疗效，可为个体化精准医疗提供依据。
6.为了解决上述问题，本发明采用了如下方案：
7.步骤一，利用结直肠癌患者新鲜的肿瘤手术组织构建ptc.
8.步骤二，培养好的ptc分别与folfox、folfiri、folfoxiri方案药物共培养7天；
9.步骤三，培养完成后，使用微肿瘤图像分析系统检测加药前后ptc的面积变化；
10.步骤四，培养完成后，每孔加入celltiter-glo试剂，混匀，室温放置20min，置于酶标仪上，检测发光，评估细胞活力；
11.步骤五，比较同一患者ptc对folfox、folfiri、folfoxiri的药物敏感性，结合患者身体耐受性、药物毒副作用，辅助患者精准选择化疗方案。
12.进一步地，步骤一中构建结直肠癌ptc的具体方法包括如下步骤：
13.1.1将新鲜的结直肠癌肿瘤组织去除脂肪和坏死区域，使用消毒的医用剪剪碎成肉糜状，加入消化液重悬，37℃进行消化；
14.1.2消化终止后，用40μm-100μm过滤网过滤悬液，收集滤液，获得结直肠癌原代肿瘤细胞；
15.1.3离心步骤1.2中的滤液，弃上清，用肠癌ptc专用培养基重悬沉淀，接种到低吸附孔板中。
16.进一步地，步骤二中ptc与药物共培养的具体方法包括如下步骤：
17.2.1过滤、离心收集直径超过40μm的微肿瘤ptc，并用100μl的ptc培养基进行重悬，接种到低吸附96孔板中，与120μl含药物的培养液于37℃，5％co2培养箱共培养，每个处理重复3次；
18.2.2分别在共培养第1天和第7天通过微肿瘤图像分析系统，采集ptc面积，检测加药后与加药前ptc面积比pa，评估药物对ptc的杀伤效率。
19.进一步地，步骤五中氟尿嘧啶的副作用包括：胃肠道反应、骨髓抑制、局部刺激、神经系统刺激、脱发、皮炎等其它毒副作用；奥沙利铂的毒副作用包括：贫血、白细胞减少，粒细胞减少及血小板减少等血液学方面，恶心，呕吐、腹泻等非血液方面以及神经系统方面的刺激；伊立替康的副作用包括：胃肠道反应，中性粒细胞减少等血液学反应、急性胆碱能综合症以及呼吸困难、肌肉收缩、痉挛及感觉异常等其它毒副作用。
20.进一步地，步骤1.1中手术样本不少于20mg。
21.进一步地，步骤1.1中消化液为胶原酶i、ii、iv的混合液。
22.进一步地，步骤1.1中消化过程中每隔20min，吸打混匀一次以促进消化。
23.进一步地，步骤1.3中ptc接种密度为105cells/cm2。
24.进一步地，步骤2.1中的药物为folfox(氟尿嘧啶+奥沙利铂)，folfiri(氟尿嘧啶+伊立替康)，folfoxiri(氟尿嘧啶+奥沙利铂+伊立替康)。
25.进一步地，步骤2.1中氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的药物有效浓度分别为：2μm、4μm、1μm。
26.进一步地，步骤2.2中pa＜0.7，即药物杀伤效率不小于30％，认为ptc对该药物敏感，否则，则认为不敏感。
27.进一步地，步骤2.2中通过比较folfox、folfiri、folfoxiri对ptc的杀伤效率，结合患者身体耐受性、药物毒副作用，辅助患者精准选择化疗方案，减少无效治疗和过度用药。
28.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
29.本发明直接采用ptc体外肿瘤模型作为药物敏感性评估的手段，更接近体内药物对结直肠癌的治疗效果。通过同时评估ptc对肠癌常用化疗药物方案的敏感性，更加直观、客观、有效地比较三种化疗方案的优劣所在，综合患者身体耐受性、药物毒副作用，辅助患者精准选择化疗方案，对临床更具参考性。
附图说明
30.图一为本发明三例结直肠癌患者来源的肿瘤组织构建的ptc体外模型的生长图片；
31.图二为本发明中folfox、folfiri、folfoxiri分别对三例人源结直肠癌ptc的体外杀伤效率。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述。
33.实施例一
34.患者crc-01，女，53岁，结直肠腺癌术后
35.1.取患者临床剩余样本1.88g，去除坏死区域，使用消毒的手术剪刀剪碎成肉糜状，加入胶原酶i、ii、iv，37℃条件下进行酶解，期间每隔20min吸打混匀一次，消化1.5h左右，获得原始肿瘤细胞(图1)，加入消化终止液，混匀，用40μm过滤网过滤，滤液经1500rpm离心5min，沉淀用肠癌ptc专用培养基进行重悬，按照105cells/cm2的密度接种到低吸附孔板中，拍照观察。
36.2.ptc经过3天培养形成稳定的肿瘤样细胞簇(图1)，过滤、离心收集直径超过40μm的微肿瘤ptc，并用100μl的ptc培养基进行重悬，将30-50个ptc接种到低吸附96孔板中，分别与120μl含folfox、folfiri、folfoxiri方案药物的培养液于37℃，5％co 2培养箱共培养，每个处理重复3次，使用显微镜对每个孔进行拍照，氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的药物有效浓度分别为：2μm、4μm、1μm。
37.3.ptc与药物共孵育7天后，使用显微镜再次对每个孔进行拍照，通过微肿瘤图像分析系统计算加药后ptc面积与加药前ptc面积的比值pa，进而转化为药物杀伤效率。ptc体外药敏检测结果显示，folfox、folfiri、folfoxirir对ptc的杀伤效率分别为65％、14％、83％(图2)。
38.4.说明folfox与folfiri对ptc的杀伤效率差别较大，临床中不能简单依据群体大数据统计结果，对folfox和folfiri做出不科学的治疗选择，以避免无效治疗耽误患者宝贵的有效治疗时间。
39.实施例2
40.患者crc-02，女，54岁，结直肠腺癌术后
41.1.取患者临床剩余样本0.84g，去除坏死区域，使用消毒的手术剪刀剪碎成肉糜状，加入胶原酶i、ii、iv，37℃条件下进行酶解，期间每隔20min吸打混匀一次，消化1h左右，获得原始肿瘤细胞(图1)，加入消化终止液，混匀，用40μm过滤网过滤，滤液经1500rpm离心5min，沉淀用肠癌ptc专用培养基进行重悬，按照105cells/cm2的密度接种到低吸附孔板中，拍照观察。
42.2.ptc经过4天培养形成稳定的肿瘤样细胞簇(图1)，过滤、离心收集直径超过40μm的微肿瘤ptc，并用100μl的ptc培养基进行重悬，将30-50个ptc接种到低吸附96孔板中，分别与120μl含folfox、folfiri、folfoxiri方案药物的培养液于37℃，5％co2培养箱共培养，每个处理重复3次，使用显微镜对每个孔进行拍照，氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的药物有效浓度分别为：2μm、4μm、1μm。
43.3.ptc与药物共孵育7天后，使用显微镜再次对每个孔进行拍照，通过微肿瘤图像分析系统计算加药后ptc面积与加药前ptc面积的比值pa，进而转化为药物杀伤效率。ptc体外药敏检测结果显示，folfox、folfiri、folfoxirir对ptc的杀伤效率分别为80％、81％、95％(图2)。
44.4.说明该患者对folfox、folfiri、folfoxiri三种药物方案的敏感性相当，在这种情况下，依据患者是否具有神经性疾病或者消化道不良症状反应，优先适合个体的临床化疗方案，一方面，保证药物的治疗效果，另一方面，减少不必要的药物毒副作用。
45.实施例3
46.患者crc-02，男，45岁，结直肠腺癌术后
47.1.取患者临床剩余样本1.37g，去除坏死区域，使用消毒的手术剪刀剪碎成肉糜状，加入胶原酶i、ii、iv，37℃条件下进行酶解，期间每隔20min吸打混匀一次，消化1.5h左右，获得原始肿瘤细胞(图1)，加入消化终止液，混匀，用70μm过滤网过滤，滤液经1500rpm离心5min，沉淀用肠癌ptc专用培养基进行重悬，按照105cells/cm2的密度接种到低吸附孔板中，拍照观察。
48.2.ptc经过4天培养形成稳定的肿瘤样细胞簇(图1)，过滤、离心收集直径超过40μm的微肿瘤ptc，并用100μl的ptc培养基进行重悬，将30-50个ptc接种到低吸附96孔板中，分别与120μl含folfox、folfiri、folfoxiri方案药物的培养液于37℃，5％co2培养箱共培养，每个处理重复3次，使用显微镜对每个孔进行拍照，氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的药物有效浓度分别为：2μm、4μm、1μm。
49.3.ptc与药物共孵育7天后，使用显微镜再次对每个孔进行拍照，通过微肿瘤图像分析系统计算加药后ptc面积与加药前ptc面积的比值pa，进而转化为药物杀伤效率。ptc体外药敏检测结果显示，folfox、folfiri、folfoxirir对ptc的杀伤效率分别为20％、51％、65％(图2)。
50.4.说明该患者ptc对folfiri和folfoxiri的敏感性相当，而对folfox的敏感性较低，由于folfoxiri可能引起患者周围神经毒性、白细胞减少、骨髓抑制高发和腹泻，综合药物疗效与毒副作用而言，folfiri更加适合该患者，当然，临床中同时需综合患者对药物的耐受性，做出合理、精准的化疗方案。
51.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的等同替代或
变换，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，利用结直肠癌患者新鲜的肿瘤手术组织构建ptc；步骤二，培养好的ptc分别与folfox、folfiri、folfoxiri方案药物共培养7天；步骤三，培养完成后，使用微肿瘤图像分析系统检测加药前后ptc的面积变化；步骤四，培养完成后，每孔加入celltiter-glo试剂，混匀，室温放置20min，置于酶标仪上，检测发光，评估细胞活力；步骤五，比较同一患者ptc对folfox、folfiri、folfoxiri的药物敏感性，结合患者身体耐受性、药物毒副作用，辅助患者精准选择化疗方案，减少无效治疗或者过度治疗的可能性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤一中的可供实验标本，包括但不限于术后组织，也包括穿刺组织、活检组织以及胸腹水液体样本。3.根据权利要求1中所述的一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法，其特征在于，所述药物为folfox、folfiri、folfoxiri，有效浓度分别为：2μm、4μm、1μm。4.根据权利要求1所述的一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法，其特征在于，所述药物敏感性是基于加药前后ptc面积比值以及atp数值的综合结果。5.根据权利要求1所述的一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法，其特征在于，步骤一中所述构建肠癌ptc的具体方法包括如下步骤：(1)将新鲜的结直肠癌肿瘤组织不少于20mg，去除脂肪和坏死区域，使用消毒的医用剪剪碎成肉糜状，加入消化液重悬，37℃进行消化；(2)消化终止后，用40μm-100μm过滤网过滤悬液，收集滤液，获得结直肠癌原代肿瘤细胞；(3)离心步骤(2)中的滤液，弃上清，用肠癌ptc专用培养基重悬沉淀，按照105cells/cm2的密度接种到低吸附孔板中。6.根据权利要求1所述的一种辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法，其特征在于，步骤二中所述肠癌ptc体外药敏实验的具体方法包括如下步骤：(1)过滤、离心收集直径超过40μm的微肿瘤ptc，并用100μl的ptc培养基进行重悬，接种到低吸附96孔板中，与120μl含药物的培养液于37℃，5％co2培养箱共培养，每个处理重复3次；(2)分别在共培养第1天和第7天通过微肿瘤图像分析系统，采集ptc面积，检测加药后与加药前ptc面积比p
a
，评估药物对ptc的杀伤效率。

技术总结
本发明公开了一种使用源于患者的肿瘤样细胞簇(patient-derived tumor-like cell cluster，PTC)的体外药敏检测，辅助结直肠癌患者化疗精准用药的方法。利用患者新鲜的手术样本构建PTC；PTC与临床化疗方案FOLFOX(氟尿嘧啶+奥沙利铂)、FOLFIRI(氟尿嘧啶+伊立替康)、FOLFOXIRI(氟尿嘧啶+奥沙利铂+伊立替康)药物共孵育7天；通过微肿瘤图像分析系统检测加药前后PTC面积变化，结合CellTiter-Glo试剂测试细胞活力，评估PTC对药物的敏感性；比较PTC对三种药物方案的敏感性，综合患者身体耐受性、药物毒副作用，辅助患者精准选择化疗方案。利用PTC培养周期短，能够较真实模拟肿瘤微环境，成本低，药敏检测接近临床真实疗效等优势，可为个体化精准医疗提供依据。为个体化精准医疗提供依据。


技术研发人员：路威 孙志学
受保护的技术使用者：浙江基石精准医学有限公司
技术研发日：2022.10.10
技术公布日：2023/10/8