一种基于患者恶性积液来源的PTC辅助鉴定NSCLC患者PD-L1表达的方法与流程

一种基于患者恶性积液来源的ptc辅助鉴定nsclc患者pd-l1表达的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定nsclc患者恶性积液pd-l1表达的方法。


背景技术：

2.pd-1是位于细胞膜上的一个跨膜蛋白，在t淋巴细胞(t-lymphocyte)、b淋巴细胞(b-lymphocyte)等免疫细胞以及肿瘤细胞中表达，当肿瘤细胞膜上的pd-l1与免疫细胞膜上的pd-1结合时，就产生了抑制性信号，这种抑制性信号就能使免疫细胞不能识别肿瘤细胞，也就抑制了免疫系统对肿瘤组织的杀伤作用，导致肿瘤组织的增殖和侵袭不受免疫系统的控制，从而实现免疫逃逸。免疫检查点抑制剂，是一类可以与pd-1或pd-l1结合，阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制性信号，恢复免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，使得免疫系统能正常的对肿瘤组织进行清除和杀伤。pd-l1高表达的肿瘤组织，对免疫检查点抑制剂的治疗更加敏感，因此，在进行免疫治疗之前，需要对患者的组织标本进行pd-l1检测。尽管免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)检测pd-l1表达水平可作为一种免疫治疗的预测标志物，用于筛选潜在获益人群和预测疗效，但pd-l1检测实践和结果仍存在很多问题，对于部分无法获取手术组织的患者，采用恶性积液进行pd-l1检测，结果的准确性较组织标本存在差异。因此，利用ptc技术构建nsclc患者恶性积液来源的ptc肿瘤微球，可为恶性积液pd-l1检测等问题提供一个新的解决路径。
3.ptc是一种全新的基于患者来源的原代肿瘤细胞体外培养方法(patient-derived tumor-like cell clusters，ptc)。ptc是肿瘤细胞、原发性上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞和免疫细胞自组装并且增殖的结果，通过获取患者恶性积液，在体外一系列培养后自组装形成肿瘤微球。ptc自组装周期短，3-6天可完成细胞与细胞之间的自聚过程，一定程度上模拟了肿瘤微环境，真实的反映了肿瘤在体内的情况，反应了肿瘤的异质性，与相应肿瘤组织在病理、遗传、功能上有高度明显的一致性。本发明以ptc技术为基础，利用ptc构建基于nsclc患者恶性积液来源的ptc肿瘤微球，检测ptc肿瘤微球pd-l1表达水平，为这部分nsclc患者提供接受免疫治疗的可行性。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种基于患者恶性积液来源的ptc辅助鉴定nsclc患者pd-l1表达的方法，该方法为仅能提供恶性积液的nsclc患者提供pd-l1检测。
5.本发明的技术方案：
6.步骤一，构建源于nsclc患者恶性积液的ptc模型
7.步骤二，基于ptc模型的培养结果，收集肿瘤微球并制作成石蜡切片
8.步骤三，基于ptc石蜡切片，免疫组化法鉴定pd-l1表达。
9.进一步地，步骤一中构建构建源于nsclc患者恶性积液的ptc模型的具体方法包括
如下步骤：
10.1.1将新鲜的源于nsclc患者的恶性积液离心，pbs吹洗后再次离心；
11.1.2 pbs重悬1.1沉淀，平置缓慢加入到细胞分离液中，比例为1∶1，2500r离心20mm；
12.1.3吸取1.2离心管中间层液体，2000r离心5min，弃去上清后，用nsclc专用ptc培养基重悬沉淀，接种到低吸附孔板中，获得源于nsclc患者的ptc模型。
13.进一步地，步骤二中基于ptc模型的培养结果，收集肿瘤微球并制作成石蜡切片的具体方法包括如下步骤：
14.1.1离心收集培养后的微肿瘤ptc，弃去上清并用4％多聚甲醛固定；
15.1.2将步骤1.1中固定好的微肿瘤ptc采用梯度酒精逐级脱水，再用二甲苯进行透化，最后加入石蜡进行渗透包埋；
16.1.3将1.2中包埋后的石蜡块切片并烤片，获得ptc模型的石蜡切片。
17.进一步地，步骤三中鉴定ptc模型石蜡切片pd-l1表达的具体方法包括如下步骤：
18.1.1将切片放到60℃烤箱中烤片2-3小时，逐级经过二甲苯和梯度酒精，将石蜡切片脱蜡至水；
19.1.2将步骤1.1中脱蜡后的切片用3％h2o2室温孵育10min以阻断内源过氧化氢酶，pbs冲洗三次；
20.1.3将步骤1.2中的切片加入到0.01m枸橼酸修复液(ph 6.0)中，微波炉中火加热5min，重复两次，冷却至室温后用pbs冲洗三次；
21.1.4将步骤1.3中的切片用10％正常山羊血清封闭1h，吸去血清后加入pd-l1一抗(22c3，dako)，4℃过夜，pbs清洗两次；
22.1.5在步骤1.4中的切片上滴加二抗孵育30min，pbs清洗两次；
23.1.6在步骤1.5中的切片上滴加dab显色，镜下控制显色时间，pbs清洗三次；
24.1.7在步骤1.6中的切片上滴加苏木素复染，1min后自来水冲洗，1％盐酸分化3s，自来水冲洗；
25.1.8将步骤1.7中染色后的切片依次放入梯度酒精和二甲苯中，每一级时间5min；
26.1.9在步骤1.7中的切片上滴加中性树脂封片，镜检。
附图说明
27.图1.腹水来源nsclc患者ptc模型
28.图2.经ihc鉴定的nsclc患者pd-l1表达
具体实施方式
29.下面将对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
30.实施例1
31.收集50-100ml nsclc患者腹水标本，离心并分离后重悬于nsclc专用ptc培养基，并以105/cm2的细胞密度接种于低吸附表面培养皿，37℃，5％co2条件下进行培养。每2-3天更换一次培养基。将获得的ptc模型用4％多聚甲醛固定，采用石蜡包埋并切片。利用dako的22c3抗体进行pd-l1检测，利用苏木素复染细胞核，封片镜检，检验患者腹水来源ptc模型中
pd-l1表达。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。


技术特征：
1.一种基于患者恶性积液来源的肿瘤样细胞簇(patient-derived tumor-like cell cluster，ptc)辅助鉴定非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)患者pd-l1表达的方法，其中，所述辅助鉴定nsclc患者pd-l1表达的方法仅包括基于ptc进行鉴定。其特征在于，包括以下步骤：步骤一、收集源于nsclc患者的可供实验标本，构建ptc模型；步骤二、基于ptc模型的培养结果，收集肿瘤微球并制作成石蜡切片；步骤三、基于ptc石蜡切片，免疫组化法鉴定pd-l1表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤一中的可供实验标本，包括但不限于恶性积液。3.根据权利要求1或2所述的ptc构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、利用酶消法，将nsclc患者的实验标本解离成单个细胞；步骤二、在nsclc专用的ptc培养基中培养解离后的标本，标本中的肿瘤细胞与其他组分细胞自组装形成肿瘤微球，获得ptc模型。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中的石蜡切片，包括以下步骤：步骤一、离心收集ptc模型中的肿瘤微球，4％多聚甲醛固定；步骤二、将固定好的肿瘤微球用石蜡包埋，切片成5um厚度的石蜡切片。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤三中的免疫组化，所用的抗体为22c3，检测的平台为dako autostainer link 48平台，评分方式为tps。

技术总结
本发明提供了一种基于患者恶性积液来源的肿瘤样细胞簇(patient-derived tumor-like cell cluster，PTC)辅助鉴定非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者PD-L1表达的方法。PTC是肿瘤细胞、原发性上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞和免疫细胞自组装并且增殖的结果，能利用恶性积液在较短时间内培养成肿瘤微球，获得的肿瘤微球与原始肿瘤具有高度一致性。利用NCSLS患者恶性积液来源的PTC，能为无法获取组织切片的患者提供PD-L1检测，为这部分患者提供接受免疫治疗的可行性。为这部分患者提供接受免疫治疗的可行性。


技术研发人员：路威 张宇翔 孙志学
受保护的技术使用者：浙江基石精准医学有限公司
技术研发日：2022.10.10
技术公布日：2023/10/8