一种多功能可注射组织粘合剂及其制备方法

1.本发明属于临床应用材料领域，具体涉及一种多功能可注射组织粘合剂及其制备方式。


背景技术：

2.组织粘合剂作为新一代临床应用材料，可快速闭合伤口，有效防止液体渗透，并最大限度地降低附加创伤。临床常用的粘合剂主要分为三大类，生物提取类，合成类及半合成类。然而，目前商用的粘合剂已逐步显示出以下两大不足：(1)优异的生物安全性和良好的组织粘合强度难以兼顾；(2)所需生物功能缺乏，易出现伤口感染、愈合缓慢等问题。
3.生物提取类粘合剂，如纤维蛋白胶(crosseal
tm
、cryoseal
tm
、)、胶原基蛋白粘合剂等，虽然具有优异的生物相容性，且反应过程模拟自身交联固化机制，温和安全，并且可伴随伤口的愈合而发生相应降解，具有一定的促组织愈合活性。然而，此类材料内聚力低，且与组织界面之间无稳定连接，因此粘合强度普遍不足，且凝血效果受限于伤口环境，导致其应用范围十分有限。
4.合成类组织粘合剂，如α-氰基丙烯酸酯胶氰基丙烯酸酯胶聚乙二醇胶(coseal
tm
、)等，虽然能在材料内部及组织界面间建立稳定的共价连接，具有较高的粘合强度，但是反应过程常伴随放热、毒副产物的溶出以及有毒催化剂的使用等，导致其生物安全性较差，同时降解速率受限于反应类型，通常不能随伤口的愈合而按需降解，可能会长期占位而影响愈合。
5.在生物提取及合成类组织粘合剂的基础上，为了获得更高的粘合强度和生物安全性，基于合成与天然分子相结合的半合成类粘合剂应运而生。然而，目前的半合成类组织粘合剂，如明胶基粘合剂牛血清白蛋白基粘合剂为追求高的交联效率和强度，通常会用到活性较高但毒性较大的交联剂，如甲醛、戊二醛等，依然无法根本解决生物安全性与粘合强度相矛盾的问题。
6.申请号为cn202011631269.1的中国专利公开了一种复合组织粘合剂及其制备方法和应用。该复合组织粘合剂包括三维多孔基质以及吸附在基质表面的增强粘附因子，所述三维多孔基质由甲基丙烯酸酐化明胶和接枝n-羟基琥珀酰亚胺的聚丙烯酸的复合水凝胶冻干得到，所述增强粘附因子为聚多巴胺。该发明具有两种组分可与创面组织上的氨基进行键合，虽然与湿润创面的组织粘附强度可以达到180kpa以上，但并未表现出良好的抗菌性能，以及针对伤口愈合的生物学活性。此外，因其可注射性的缺乏而无法应用于复杂伤口的密封，局限性较大。
7.因此，设计一款制备简单，同时具有优异的生物安全性和高粘合强度、抗溶胀、抗菌、促进组织愈合的多功能可注射组织粘合剂，从而进一步扩大其临床应用范围，并同时提升伤口愈合质量及缩短住院周期，具有重要研究及实用意义。


技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本发明提供了一种多功能可注射组织粘合剂及其制备方法。模拟天然细胞外基质成分的仿生设计：以透明质酸(ha)和iii型重组胶原(col)为主要成分，可充分发挥天然分子高生物安全性、抗炎、促血管生成和高细胞亲和性等优势。
9.对天然大分子的功能化基团修饰：对ha和col分别进行活性酯(nhs)和还原态多酚功能基团(dopa
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)的修饰，利用ha上的nhs基团与col及组织表面上的氨基或巯基进行亲核加成反应，可实现组织伤口原位密封，并通过改变缓冲液中无机盐的类型及浓度，对凝胶化时间实现可控调节。随后，网络中的还原态多酚基团可发生缓慢氧化而自聚，并能与周围剩余氨基或巯基发生席夫碱反应或迈克尔加成，以增强材料的内聚力和粘合力，并起到自增强及抗溶胀效果。同时，原位生成适量h2o2，赋予粘合剂长效抗菌活性。
10.一方面，本发明提供了一种多功能组织粘合剂。
11.所述的多功能组织粘合剂中包括：
12.(1)组分a：化学修饰还原型多酚基团且表面含rgd序列、赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的活性蛋白；
13.(2)组分b：化学修饰活性酯基团的天然多糖；
14.(3)成胶缓冲液：碱性缓冲溶液及酸性溶液。
15.具体地，所述的组分a中的活性蛋白表面包含：rgd序列以提供细胞可黏附的活性位点；赖氨酸链段以提供可反应的活性氨基；天冬氨酸和/或谷氨酸链段以提供可反应的活性羧基。
16.优选地，所述活性蛋白选自：重组i型胶原、重组iii型胶原、明胶、溶菌酶中的一种或多种。
17.具体地，所述的组分a中的多酚基团选自：邻苯二酚、邻苯三酚或其组合。
18.所述的多酚基团的还原程度利用还原剂进行可控调节，其酚醌比例在2:8到8:2之间。
19.优选地，所述的组分a为还原型多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa
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)。
20.所述的组分b中的天然多糖的活性酯基团选自：琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺乙酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯中的一种或多种。
21.所述的活性酯基团修饰率为10-50％。
22.优选地，所述的组分b中的天然多糖侧链含有羧基基团。
23.优选地，所述的组分b中的天然多糖分子量为10-500kda。
24.优选地，所述的组分b为活性酯功能化透明质酸(ha-nhs)。
25.所述的成胶缓冲液中：
26.碱性缓冲液中的无机盐选自：四硼酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钠或其组合；
27.酸性溶液中的酸性物质选自：盐酸、乙酸、磷酸二氢钠或其组合。
28.本发明方案的反应原理：
29.成胶及粘合原理：透明质酸侧链上修饰的活性酯基团可与重组ⅲ型胶原及组织表面蛋白中赖氨酸上的氨基进行自发的亲核加成反应，形成稳定的酰胺键，实现前驱液的固化和伤口密封。
30.成胶时间可控原理：活性酯与氨基之间的酰胺化反应为亲核加成过程，其反应速
率与氨基组分的脱质子化程度密切相关，氨基的脱质子化程度越高，亲核性越强，反应速率越快。而氨基组分的脱质子化程度又与体系环境的ph值呈正相关，因此通过调整缓冲液中强碱弱酸盐的类型及浓度，即可实现对凝胶化时间的精准控制。
31.自增强原理：重组ⅲ型胶原上修饰的还原型多巴胺基团具有自氧化特性，通过缓慢的自聚反应形成凝胶内部的二重交联，氧化后的苯醌基团可与周围的氨基、巯基发生迈克尔加成或席夫碱反应，进一步提升粘合强度及胶体的稳定性。
32.抗菌原理：重组ⅲ型胶原上修饰的还原型多巴胺基团在自氧化过程中，可将酚羟基中储存的电子传递给周围的氧气，从而原位生成过氧化氢，一种高效、清洁的抗菌剂，赋予材料良好的抗菌活性。
33.促进组织愈合原理：活性蛋白本身的rgd序列及所修饰的还原态多酚基团均可促进细胞黏附，同时伴随材料的降解也为新生组织的生长提供了空间，从而加速组织愈合。
34.另一方面，本发明提供了一种粘合剂医疗器械包。
35.所述的粘合剂医疗器械包包括前述的一种多功能可注射组织粘合剂。
36.所述的组织粘合剂的成分分别包装，其中组分a和组分b为粉末；所述的碱性缓冲液和酸性溶液为液体。
37.所述的粘合剂医疗器械包包括一种双筒注射器或涂抹棒。
38.优选地，所述的多功能组织粘合剂包括活性酯功能化透明质酸(ha-nhs)、还原型多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa
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)、酸性溶液、碱性缓冲液；进一步优选地，所述的酸性溶液为盐酸稀释液，所述的碱性缓冲液为na2b4o7溶液；更进一步地，所述的盐酸稀释倍数为105，所述的na2b4o7溶液浓度为0.1m。
39.在一些实施例中，所述的ha-nhs以60mg/ml的浓度溶于盐酸稀释液(105倍)；所述的col-dopa
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以120mg/ml的浓度溶于0.1m的na2b4o7溶液。
40.再一方面，本发明提供了一种制备前述的组织粘合剂的方法。
41.步骤包括：
42.(1)将组分a、b的粉末分别溶于碱性缓冲液和酸性溶液中，得成胶前驱液a和成胶前驱液b。
43.(2)利用双筒注射器或涂抹棒，将胶前驱液a和成胶前驱液b混合均匀，形成所述的多功能组织粘合剂。
44.优选地，所述的方法如下：将还原型多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa
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)溶解于碱性缓冲液中作为成胶前驱体a，将活性酯功能化透明质酸(ha-nhs)溶于弱酸性溶液中作为成胶前驱体b。将两种溶液混合后交付，原位形成该凝胶粘合剂(ha-col)。
45.再一方面，本发明提供了前述的多功能可注射组织粘合剂的应用。
46.所述的应用为术后血管、心脏、硬脑膜等软/硬组织密封。
47.本发明的有益效果：
48.1.解决了目前粘合剂存在优异的生物安全性和良好的组织粘合强度难以兼顾，易吸收体液而溶胀过大的问题，该粘合剂可与组织间建立稳固连接，并可通过后续凝胶网络内部的自交联而有效抵御因体液浸润而发生的过度溶胀，降低了压迫周围组织、神经以及粘合力减弱甚至粘合剂脱落的风险，保证了其在应用过程中的安全性和稳定性。
49.2.解决了目前粘合剂缺乏抗菌活性，无法避免伤口感染的不足，该粘合剂模拟了
生物体抗菌机制，通过原位释放清洁、高效、安全的抗菌剂杀灭细菌。
50.3.解决了目前粘合剂缺乏生物活性，无法促进组织愈合的不足，模拟了天然细胞外基质的成分与结构，为组织再生提供了良好的微环境。
附图说明
51.图1为活性酯功能化透明质酸钠(ha-nhs)检测图，其中(a)为紫外光谱图；(b)为核磁1h谱图。
52.图2为多巴胺功能化重组iii型胶原(col-dopa)检测图，其中(a)为紫外光谱图；(b)为核磁1h谱图。
53.图3为多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa)与还原型多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa
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)的xps谱图，其中(a)为col-dopa，(b)为col-dopa
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。
54.图4为粘合剂在猪皮表面的粘合性能展示。
55.图5中的(a)为(ha-nhs)-col、(ha-nhs)-(col-dopa
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)凝胶粘合猪皮并浸泡pbs 7天前后图片；(b)为粘合强度。
56.图6为(ha-nhs)-(col-dopa
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)的h2o2生成曲线。
具体实施方式
57.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.实施例1一种多功能组织粘合剂的制备方法
59.包括以下步骤：
60.(1)活性酯功能化透明质酸钠(ha-nhs)的合成
61.以酶切得到的低分子量透明质酸(mw 50kda)为原料(购买自福瑞达生物科技有限公司)，溶解于水中获得2wt％ha溶液。按照ha重复单元：碳化二亚胺(edc)：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)摩尔比等于1：2：4，先加入edc活化羧基1h后，再加入nhs进行功能基团接枝，室温反应6h后依次加入2％氯化钠溶解后进行降温处理(4℃)，然后加入5倍体积的冰乙醇(-20℃)将产物析出，抽滤后再使用无水冰乙醇对其进行多次洗涤，经真空冷冻干燥后得ha-nhs。用核磁共振波谱仪和紫外吸仪分析ha-nhs的化学结构，并对nhs基团的接枝率进行定量测定。
62.如图1中的(a)所示，ha-nhs在259nm处出现了明显吸收峰，且与在ha溶液中加入nhs所对应吸收峰位置一致。同时，如图1中的(b)所示，通过核磁表征，在2.75-2.90ppm，4h化学位移处出现了琥珀酰亚胺酯中亚甲基上质子峰，相对于ha上甲基中质子峰(1.80-2.00ppm，3h)进行积分换算，可计算其接枝率为23.25％，表明ha-nhs的成功合成。
63.(2)多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa)的合成
64.以iii型重组胶原(col)为原料(购买自江苏创建生物科技有限公司)，以1wt％的浓度溶解于无氧mes缓冲液(ph为6)，加入2mg/ml氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基(dmtmm)，30mg/ml多巴胺盐酸盐(dopa)溶液，室温反应24h后，低温透析提纯2天，经真空冷冻干燥后得col-dopa干态粉末并低温保存(-20℃)。用核磁共振波谱仪和紫外
吸收仪分析col-dopa的化学结构。
65.如图2中的(a)所示，col-dopa在280nm处出现了明显吸收峰，且与在col溶液中加入dopa所对应吸收峰位置一致。同时，如图2中的(b)的核磁谱图中，col-dopa组在2.75ppm出现的吸收峰为多巴胺基团中靠近苯环的甲基质子峰，而在col组中并无此吸收峰，证明了col-dopa的成功合成。
66.(3)还原态多巴胺功能化重组ⅲ型胶原(col-dopa
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)的制备
67.配制浓度为1m的抗坏血酸溶液，以此为溶剂将col-dopa以1wt％的浓度溶解，室温下反应24h后在去氧水中进行透析处理，经真空冷冻干燥后得还原型的col-dopa
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，利用x射线光电子能谱仪(xps)对酚醌基团的比例进行定量测定。
68.由图3中的(a)的xps结果可知，初始合成的col-dopa中，col上所修饰多巴胺基团中的c-o与c＝o比例约为1:1，经抗坏血酸还原后，c-o比例增至70％，说明col-dopa中的苯醌基团可以被还原为苯酚基团，证明了col-dopa
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的成功制备。
69.(4)多功能组织粘合剂的制备及其粘附性能展示
70.将col-dopa
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以120mg/ml的浓度溶于0.1m na2b4o7溶液中获得成胶前驱液a，将ha-nhs分别以60mg/ml的浓度溶于含少量亮蓝的盐酸稀释液(105倍)获得成胶前驱液b，使用双筒注射器作为交付工具进行等量混合，原位注射至猪皮表面，待其固化后对猪皮进行拉伸、弯折、扭转等动作，观察粘合剂在猪皮表面的粘合情况。
71.由图4结果可知，由于ha上修饰的活性酯基团可与col及组织表面蛋白中的氨基或巯基进行自发的酰胺化反应，注射后，前驱液即可在猪皮表面迅速固化，并稳定地粘附于其表面，可经拉伸、弯折、扭转等破坏动作而不脱落。
72.(5)粘合强度测试
73.将col-dopa
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以120mg/ml的浓度溶于0.1m na2b4o7溶液中获得成胶前驱液a，将ha-nhs以60mg/ml的浓度溶于盐酸稀释液(105倍)获得成胶前驱液b，通过双筒注射器将其注射至两块贴于玻璃片表面的猪真皮组织(2.5cm
×
7.5cm)之间实现粘结(重叠面积为2.5cm
×
1.0cm)，利用生物力学测试仪对其进行搭接剪切强度测试，并计算粘合强度。为了定量化表征该粘合剂的自增强效果，完成粘结后，将两块猪皮浸泡于磷酸盐缓冲液(pbs)中，7d后再对其进行粘合强度的评价测试。
74.由图5中的(a)结果可知，将粘合后的猪皮在pbs中浸泡7d后，由于凝胶网络内还原态dopa基团发生的大量氧化交联反应，(ha-nhs)-(col-dopa
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)粘合剂的颜色已发生明显变黑且无明显溶胀，同时进一步增强了粘合剂的内聚力及与组织间的界面粘合力，如图5中的(b)所示，由初始的23kpa提升至约35kpa。作为对照，未修饰dopa基团的(ha-nhs)-(col)组分，凝胶发生了明显的溶胀并有部分被挤出，且粘合强度发生了明显下降。
75.(6)过氧化氢(h2o2)生成测定
76.将col-dopa
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以120mg/ml的浓度溶于0.1m na2b4o7溶液中获得成胶前驱液a，将ha-nhs以60mg/ml的浓度溶于盐酸稀释液(105倍)获得成胶前驱液b，使用双筒注射器作为交付工具进行等量混合后注射至直径15mm，高7.5mm的圆柱体模具中，脱模后将样品浸泡于5倍体积的pbs中，于37℃下孵育，在7天内不间断采样，利用h2o2试剂盒测定其h2o2释放含量。
77.由图6结果可知，该粘合剂可持续原位释放h2o2，7天后溶液中的h2o2浓度约190μm，
而未修饰dopa基团的粘合剂未检测到有h2o2生成，证明了该粘合的h2o2生成能力全部归因于col上修饰的还原态dopa基团，通过其在自氧化的过程中的电子转移机制而原位生成h2o2。
78.实施例2合成活性酯功能化透明质酸钠条件测试
79.参照实施例1，在合成活性酯功能化透明质酸钠(ha-nhs)时，设置5个ha重复单元：碳化二亚胺(edc)：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)摩尔比的组别，分别为a组1:1:1；b组1:2:2；c组1:2:3；d组1:3:4；e组1:3:6。
80.项目/组别abcde活性酯基团接枝率10.2
±
1.6％9.4
±
1.8％15.4
±
2.1％24.5
±
2.3％23.2
±
2.8％
81.实施例3重组ⅲ型胶原还原条件测试
82.参照实施例1，对重组ⅲ型胶原进行还原时，设置5个抗坏血酸浓度组别，分别为a组：0.01m；b组：0.10m；c组：0.50m；d组：1.00m；e组：2.00m，其余不变。
83.项目/组别abcde酚羟基比例52.9
±
3.2％57
±
4.1％64
±
4.5％70.2
±
5.2％71.5
±
5.5％
84.实施例4前驱体浓度条件测试
85.参照实施例1，在制备粘合剂时，设置4个前驱体浓度组别，分别是a组：ha-nhs:30mg/ml，col-dopa
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：60mg/ml；b组：ha-nhs:50mg/ml，col-dopa
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：100mg/ml；c组：ha-nhs:70mg/ml，col-dopa
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：140mg/ml；d组：ha-nhs:80mg/ml，col-dopa
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：160mg/ml。
[0086][0087]
实施例5
[0088]
参照实施例1，将b组分中的透明质酸钠替换为肝素钠(购买自上海麦克林生化科技有限公司)，其余不变。
[0089]
项目/组别实施例5粘合强度(0d)32
±
4.1(kpa)粘合强度(7d)47
±
9.2(kpa)过氧化氢浓度(7d)185
±
20.8(μm)
[0090]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，包括：(1)组分a：含有化学修饰还原型多酚基团且表面含rgd序列、赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的活性蛋白；(2)组分b：含化学修饰活性酯基团的天然多糖；(3)成胶缓冲液：碱性缓冲溶液及酸性溶液。2.如权利要求1所述的多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，所述活性蛋白选自：重组i型胶原、重组iii型胶原、明胶、溶菌酶的一种或多种。3.如权利要求1所述的多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，所述的多酚基团的还原至酚醌比例在2:8到8:2之间。4.如权利要求1所述的多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，所述的活性酯基团选自：琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺乙酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯中的一种或多种。5.如权利要求4所述的多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，所述的活性酯基团修饰率为10-50％。6.如权利要求1所述的多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，所述的成胶缓冲液中：碱性缓冲液中的无机盐选自四硼酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钠或其组合；酸性溶液中的酸性物质选自盐酸、乙酸、磷酸二氢钠或其组合。7.一种制备如权利要求1所述的多功能可注射组织粘合剂的方法，步骤包括：(1)将组分a、b的粉末分别溶于碱性缓冲液和酸性溶液中，得成胶前驱液a和成胶前驱液b；(2)利用双筒注射器或涂抹棒，将成胶前驱液a和成胶前驱液b混合均匀，形成所述的多功能组织粘合剂。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的成胶前驱液a中，蛋白的质量浓度为5-20％(w/v)。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的成胶前驱液b中，天然多糖的质量浓度为2-10％(w/v)。

技术总结
本发明提供一种多功能可注射组织粘合剂，其特征在于，包括组分A：化学修饰还原型多酚基团且表面富含RGD序列、赖氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的活性蛋白；组分B：化学修饰活性酯基团的天然多糖；成胶缓冲液：碱性缓冲溶液及酸性溶液。本发明提供的组织粘合剂兼顾良好的生物安全性和粘附性，并具有抗菌活性，能够促进组织愈合，具有很好的临床应用前景。具有很好的临床应用前景。具有很好的临床应用前景。


技术研发人员：谈浩琪 董昕 孙俊杰
受保护的技术使用者：苏州上海大学创新中心
技术研发日：2022.07.26
技术公布日：2023/10/8