含有联苯基衍生物化合物作为有效成分的抗菌佐剂及其用途的制作方法

1.本发明涉及一种包含联苯基衍生物化合物作为有效成分的抗菌补充剂，以及各种使用该化合物的技术。


背景技术：

2.抗生素耐药菌的出现和兴起给全世界带来了巨大的问题，这些抗生素耐药菌即使暴露于抗生素也能获得耐药性而存活下来。截至2018年，全球因感染抗生素耐药菌而死亡的人数达到70万，而在韩国，由于感染五种代表性抗生素耐药菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(mrsa)、耐多药鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)(mdra)、耐多药铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(mrpa)、耐万古霉素肠球菌(enterococci)(vre)和耐碳青霉烯肠杆菌科(enterobacteriaceae)(cre))，一年内造成9,000例感染和3,600例死亡，死亡率约为40％。此外，韩国每年因感染抗生素耐药菌的患者的医疗费、护理费和过早死亡造成的生产力损失所造成的社会总成本估计为5500亿韩元，因此抗生素耐药性的扩散可能会造成经济损失和人类健康损失。特别是由于同时对所有现有抗生素产生耐药性的多药耐药菌(称为“超级细菌”)的出现，抗生素耐药菌造成的损害预计将呈指数增长。
3.已知抗生素耐药菌通过以下方式获得相应机制的耐药相关基因而获得对抗生素的耐药性：
①
产生抗生素降解酶，以使抗生素失活，或通过抗生素转化酶改变抗生素的结构，
②
通过抗生素流入抑制/排出泵激活抗生素流出，以降低细胞内抗生素浓度；
③
通过突变改变与抗生素结合的靶蛋白等。抗生素耐药菌通过调动两种或更多种耐药机制来有效抵抗抗生素，并且已知调动的机制越多，耐药程度就越高。因此，针对耐药菌株的抗生素应
①
抑制迄今未知的新细菌靶点，或
②
通过抑制各种靶点群避免耐药性的产生。
4.为了解决抗生素耐药菌感染的问题，需要开发新型抗生素，但挖掘用于新药开发的靶点很难，新药开发平均耗资约8亿美元，至少花费10年时间，导致困难重重。更严重的问题是，虽然通过挖掘新的靶点开发出了新的抗生素，可以避免目前已知的抗药性机制，但抗药性细菌会迅速出现。事实上，利奈唑胺(linezolid)的作用机制不同于传统抗生素，是2000年代唯一获批的新型靶点抑制剂，但耐药菌已经出现。因此，从成本和时间方面考虑，开发一种可抑制由抗生素耐药菌获得的耐药机制的物质而不是开发一种新型抗生素，从而提高现有抗生素的疗效，可能是应对抗生素耐药菌感染的有效策略。
5.因此，更需要开发一种技术，以在使用因抗药性而无法使用抗生素治疗的同时，通过增加对抗生素的敏感性来杀死细菌。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明已被做出以解决现有技术的问题，并提供了一种抗菌补充剂，其改善细菌对抗生素的敏感性。
8.此外，本发明的另一个目的是提供抗菌组合物，其包含上述抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。
9.此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的药物组合物，其包含上述抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。
10.技术方案
11.为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种抗菌补充剂，其包含由以下化学式1所表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
12.[化学式1]
[0013][0014]
其中，x是卤素原子，r1和r2各自独立地为氢原子或具有1至6个碳原子的烷基。
[0015]
此外，本发明的另一方面提供了一种抗菌组合物，其包含抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。
[0016]
此外，本发明的另一方面还提供了一种用于预防或治疗由败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的药物组合物，其包含上述抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。
[0017]
有益效果
[0018]
本发明的抗菌补充剂提高革兰氏阴性菌对多粘菌素类抗生素的敏感性，从而将用于抑制革兰氏阴性菌生长的多粘菌素类抗生素的治疗剂量最多减少128倍。
[0019]
此外，本发明的抗菌补充剂与多粘菌素类抗生素联合给药，引起协同效应，从而显示出抑制革兰氏阴性菌生长和杀灭革兰氏阴性菌的效果。
[0020]
此外，根据本发明，可显著降低因过量使用多粘菌素而引起的肾毒性等常规副作用，并可预防或治疗因过量使用抗生素而引起的败血症和脓毒性休克。
[0021]
本发明的效果并不局限于上述效果，本领域技术人员可以通过以下描述清楚地了解本文中未提及的其他效果。
附图说明
[0022]
图1是显示pa108及其衍生物(pa108-1至14)和多粘菌素b(pmb)通过细菌相对呼吸速率对鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)菌株的细菌生长抑制效果的图。
[0023]
图2是显示单独使用多粘菌素b(pmb)处理、单独使用pa108处理或多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理通过细菌相对呼吸速率对鲍曼不动杆菌菌株的细菌生长抑制效果的图。
[0024]
图3是显示单独使用多粘菌素b(pmb)处理、单独使用pa108处理或多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理对鲍曼不动杆菌菌株的细胞死亡效果的图。
[0025]
图4显示了通过棋盘分析确认多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理是否对鲍曼不动
杆菌菌株产生协同效应的结果。
[0026]
图5是单独使用多粘菌素b(pmb)处理、单独使用pa108处理或多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理鲍曼不动杆菌菌株时，在荧光显微镜(上)和扫描电子显微镜(下)下观察到的细菌形态变化的照片。
[0027]
图6显示了多粘菌素b(左)和pa108(右)通过肾细胞存活率对人源肾细胞的肾毒性。
[0028]
图7显示了在感染鲍曼不动杆菌菌株的小鼠败血症模型中，单独施用多粘菌素b(pmb)、单独施用pa108或多粘菌素b(pmb)和pa108联合施用后的小鼠存活率。
[0029]
图8显示了通过棋盘分析确认多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理是否对3株肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)菌株和3株铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌株产生协同效应的结果，所述3株肺炎克雷伯菌菌株和3株铜绿假单胞菌菌株对多粘菌素类抗生素具有抗药性。
[0030]
图9显示了与对照组相比，单独使用多粘菌素b(pmb)处理、单独使用pa108处理或多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理鲍曼不动杆菌菌株时表达增加的基因数量(左)和表达减少的基因数量(右)。
[0031]
图10显示了与对照组相比，在使用多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理时，表达增加或减少的基因中具有高度统计学意义的基因的功能信息(紫色：使用pmb和pa108联合处理的组，黄色：使用pmb处理的组，蓝色：使用pa108处理的组。
[0032]
图11显示了在单独使用多粘菌素b(pmb)处理、单独使用pa108处理或多粘菌素b(pmb)和pa108联合处理鲍曼不动杆菌菌株时，细菌细胞膜渗透性的变化(左)和细胞质膜电位的变化(右)。
具体实施方式
[0033]
下文将详细描述本发明。
[0034]
本发明的一个方面提供了一种改善细菌对抗生素的敏感性的抗菌补充剂。
[0035]
本发明的抗菌补充剂包含由以下化学式1所表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分：
[0036]
[化学式1]
[0037][0038]
在化学式1中，x可以是选自由f、cl、br和i组成的组中的任意一个卤素原子，x可以是选自由f、cl和br组成的组中的任意一个卤素原子，或者x可以是cl。
[0039]
在化学式1中，r1和r2可以各自独立地为氢原子或烷基。
[0040]
烷基是指直链或支链饱和脂肪族烃基，可以是具有1至12个、1至10个、1至8个或1至6个碳原子的烷基，例如可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。
[0041]
此外，烷基可以是取代或未取代的。当烷基被取代时，取代基可以在任何可能的连接点被取代。取代基优选地可以是独立地选自由烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代、羧基和烷氧羰基组成的组中的一个或多个，但并不限于此。
[0042]“药学上可接受的盐”是指通过常规方法制备的盐，盐包括无机酸和有机酸，可以是选自由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、糠酸、琥珀酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸和扁桃酸组成的组中的任意一种，但不限于此。
[0043]“药学上可接受的盐”还包括由钠、钾、铝、钙、锂、镁和锌等阳离子形成的盐以及由氨、乙二胺、n-甲基谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、n-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷和四甲基氢氧化铵等碱形成的盐。这些盐可以通过标准程序制备，例如游离酸与适当的有机碱或无机碱反应。“药学上可接受的盐”还包括游离酸、游离碱和两性离子形式。
[0044]
化学式1所表示的化合物可以具有改善抗生素耐药菌对抗生素的敏感性的作用。因此，化学式1所表示的化合物可用作抗菌补充剂的有效成分，该抗菌补充剂可与抗生素联合使用，以对抗对抗生素耐药的细菌。
[0045]“抗菌补充剂”也称为“抗生素补充剂”，是指一种不直接杀死细菌，而是通过抑制细菌对抗生素的耐药性、诱导抗生素的细胞内积累等来增加细菌对抗生素的敏感性的物质。
[0046]“抗生素”一般是指具有抗菌活性的物质，例如，可以是选自由青霉素类；头孢菌素类；单内酰胺类和碳青霉烯类，其是以β-内酰胺环为基本结构的β-内酰胺类抗生素；能改变细菌细胞膜的通透性，从而显示抗菌作用的多粘菌素；通过革兰氏阴性菌外膜上的孔蛋白进入细胞质周围的空间，然后进入细胞，从而显示抗菌作用的氨基糖苷类；与细菌核糖体的50s结合，抑制蛋白质合成，以显示抗菌作用的大环内酯类；对多种细菌显示抗菌作用，并且被称为广谱抗生素的四环素类；抑制细菌细胞壁的生物合成，以显示抗菌作用的糖肽类；从林肯链霉菌(streptomyces lincolnensis)中分离出来并对厌氧菌有良好抗菌功效的林可霉素类(linomycins)；干扰细菌dna复制以显示抗菌效果的喹诺酮类；其组合及其衍生物组成的组中的任意一种或多种，尤其可以是多粘菌素类抗生素。
[0047]
多粘菌素类抗生素是一种肽类抗生素，由一个带正电荷的巨大环组成，并由一个七肽环和三个与脂肪族酸连接的氨基酸尾部组成。此外，多粘菌素类抗生素是由革兰氏阴性菌(如多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa))中的非核糖体肽合酶系统产生的，具有与许多革兰氏阴性菌细胞外膜中存在的磷脂结合的活性，激活磷脂酶，以破坏细胞膜。多
粘菌素类抗生素可以是多粘菌素a、多粘菌素b、多粘菌素c、多粘菌素d和多粘菌素e(粘菌素)，特别是以b1(c
56h98n16o13
，分子量：1203.49)和b2(c
55h96n16o13
，分子量：1189.47)为主要成分的多粘菌素b或多粘菌素e。多粘菌素b和多粘菌素e具有相同的结构，除了与第6位相连的一个氨基酸不同外，分别是苯丙氨酸(phe)和亮氨酸(leu)。
[0048]
只要细菌是具有外膜的革兰氏阴性菌，细菌可以被包括在内而没有限制，具体来说，细菌可以是致病性革兰氏阴性菌，例如埃希氏菌属(escherichia sp.)、不动杆菌属(acinetobacter sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、克雷伯氏菌属(klebsiella sp.)等。具体来说，埃希氏菌属包括大肠埃希氏菌(escherichia coli)、艾伯特埃希氏菌(escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(escherichia blattae)、弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)、赫尔曼埃希氏菌(escherichia hermannii)、脆弱埃希氏菌(escherichia vulneris)等，但不限于此。不动杆菌属包括鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)、博伊西不动杆菌(acinetobacter boissieri)、醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)、溶血不动杆菌(acinetobacter haemolyticus)、医院不动杆菌(acinetobacter nosocomialis)、辛德勒不动杆菌(acinetobacter schindleri)、乌尔新不动杆菌(acinetobacter ursingii)等，但不限于此。假单胞菌属包括铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida,)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、穿孔素假单胞菌(pseudomanas pertucinogena)、施氏假单胞菌(pseudomanas stutzeri)、丁香假单胞菌(pseudomanas syringae)等，但不限于此。克雷伯氏菌属包括肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia)、肉芽肿克雷伯氏菌(klebsiella granulomatis)、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)、土生克雷伯氏菌(klebsiella terrigena)等，但不限于此。
[0049]
特别是，细菌可能会对抗生素显示抗药性，尤其是对上述抗生素中的至少一种显示抗药性。“抗生素耐药菌”是指不再受或几乎不受至少一种以前有效的抗生素影响的细菌，是指这些细菌有能力抵抗以前具有有效抗菌活性的抗生素。抗生素耐药菌可将耐药能力传给后代。抗生素的抗药性机制多种多样。例如，抗药性可通过以下机制表现出来：不渗透机制，从物理上阻止抗生素到达细菌内部或细菌的作用部位；流出机制，通过迅速清除细菌体内的抗生素，阻止有效量的抗生素到达细菌内部或细菌的作用部位；代谢机制，以破坏抗生素，将抗生素转化为无害(或危害较小)的化合物或更容易排出的化合物；或旁路机制，使用除通过抗生素抑制细菌，或通过对抗生素或无靶标细菌不太敏感的抗生素靶标形式的细菌(如酶)外的途径。
[0050]
此外，抗生素耐药菌可以对两种或更多种抗生素具有耐药性，这也被称为耐多药细菌。耐多药细菌包括，例如，甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)、万古霉素中间型金黄色葡萄球菌(visa)、耐万古霉素肠球菌(enterococci)(vre)、万古霉素敏感性肠球菌(vse)、耐多药铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(mrpa)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(crpa)、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)(crab)、耐碳青霉烯类肠杆菌科(enterobacteriaceae)(cre)等。
[0051]
在本发明的具体实例中，证实了当用化学式1所表示的化合物以本身不具有抗菌
活性的浓度与多粘菌素联合处理通常对多粘菌素类抗生素显示耐药性的细菌时，进一步促进了对多粘菌素类抗生素耐药的细菌的死亡。上述结果清楚地表明，化学式1所表示的化合物可进一步提高了抗生素耐药菌的敏感性，可用作抗菌补充剂的有效成分，从而可以恢复抗生素的抗菌活性。
[0052]
本发明的另一方面提供了一种抗菌组合物，其包含抗菌补充剂，所述抗菌补充剂包含作为有效成分的化学式1所表示的化合物和作为有效成分的抗生素。
[0053]
如上所述，由于本发明的化学式1所表示的化合物具有改善抗生素耐药菌对抗生素的敏感性的效果，因此将上述抗菌补充剂与抗生素联合使用，从而恢复抗生素的常规抗菌活性。
[0054]
将本发明的抗菌组合物施用于抗生素耐药菌时，参与锌离子结合、相同蛋白结合和铁离子结合的基因的表达量以及参与过氧化物酶活性的基因的表达量可以显著降低，而参与物质通过细胞膜转运的基因的表达量，特别是atp酶偶联硫酸盐跨膜转运蛋白活性的基因的表达量可以显著增加。
[0055]
本发明的抗菌组合物可以改变细菌细胞膜内外的环境，破坏细胞膜的脂双层区域的完整性，使细胞膜高度去极化，从而破坏细胞质内稳态，降低细胞通透性，导致细胞死亡。
[0056]
抗生素耐药菌如上所述，尤其可以是革兰氏阴性菌。
[0057]
此外，抗生素也如上所述，尤其可以是多粘菌素类抗生素。
[0058]
因此，与单独施用多粘菌素类抗生素的情况相比，本发明的抗菌组合物可更有效地提高多粘菌素类抗生素的抗对多粘菌素类抗生素耐药菌的抗菌活性。
[0059]
在本发明的具体实例中，当抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素联合使用处理对多粘菌素类抗生素耐药的细菌时，显示出协同效应，从而具有抑制细菌生长和破坏细胞膜以导致细胞死亡的效果。
[0060]
此外，由于本发明的抗菌组合物联合使用了抗菌补充剂，因此虽然没有过量施用多粘菌素类抗生素，但也能获得足够的抗菌活性。因此，可显著降低因过量施用多粘菌素类抗生素而引起的副作用，如肾毒性。
[0061]
在本发明的具体实例中，证实当引起肾毒性的多粘菌素类抗生素和本发明的抗菌补充剂联合使用时，在败血症动物模型中不会引起肾毒性，而且还提高了存活率。
[0062]
本发明的另一方面提供了一种用于预防或治疗由败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的药物组合物，该组合物包含抗菌补充剂，所述抗菌补充剂包含作为有效成分的化学式1所表示的化合物或其药学上可接受的盐，以及作为有效成分的抗生素。
[0063]
抗生素也如上所述，尤其可以是多粘菌素类抗生素。败血症或脓毒性休克可由革兰氏阴性菌引起，革兰氏阴性菌不受限制，只要它们对抗生素有耐药性即可，例如可以是埃希氏菌属和/或不动杆菌属。
[0064]“败血症”是指由于微生物感染而导致全身出现严重的炎症反应的一种病症。当出现发热或体温过低、呼吸频率加快(呼吸过速)、心率加快(心动过速)和血液检查中白细胞计数增加或明显减少等两种或更多种症状时，被称为全身炎症反应综合征(sirs)。如果全身炎症反应综合征是由微生物感染引起的，则称为败血症。病原体持续或间歇性地进入身体的感染灶中的血液中，并在各器官组织中定居以形成病灶，表现出严重的全身症状，败血症更由可能影响体弱者、老年人和衰弱者。败血症可潜在地导致脓毒性休克。败血症严重
时，身体各器官(如心、肾、肝、脑和肺)功能衰退，导致休克状态。
[0065]
在本发明的具体实例中，证实提高了败血症动物模型的存活率，并显著减少了包括肝、肺、肾、脾等器官中感染的细菌的数量(菌落形成单位，cfu)，因此，包括本发明的抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素的组合物可用于预防或治疗败血症。
[0066]“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制败血症或脓毒性休克或延缓其发作的所有作用。
[0067]“治疗”是指改善或有利地改变与败血症相关的症状和与多器官功能障碍综合征有关的病症(例如，不同程度的发热、低氧血症、反射性心动过速、内皮炎、心肌梗塞、高原混乱、精神状态改变、血管衰竭和器官损伤、急性呼吸窘迫综合征、凝血病、心力衰竭、肾功能衰竭、休克和/或昏迷等)的所有作用。
[0068]
此外，本发明还可抑制由败血症造成的器官损伤。本发明的药物组合物可以通过抑制由败血症造成的器官损伤来预防或治疗败血症。所述器官是指由败血症损伤的器官，本发明的组合物所抑制的受损器官不受限制，例如，可以是选自由肝脏、肾脏和肺脏组成的组中的至少一种。
[0069]
根据本发明的药物组合物可以通过添加无毒且药学上可接受的载体、增强剂、赋形剂等按照常见的方法进行配制，例如，可以配制成口服给药制剂或肠胃外给药制剂，如片剂、胶囊剂、锭剂、液体和混悬剂。
[0070]
此外，可用于根据本发明的药物组合物中的赋形剂还可包括甜味剂、粘合剂、增溶剂、溶解助剂、润湿剂、乳化剂、张度剂、吸附剂、崩解剂、抗氧化剂、防腐剂、润滑剂、填充剂、香料等，例如，可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸、二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁、硅酸铝镁、淀粉、明胶、角叉菜胶、海藻酸、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、琼脂、水、乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、氯化钙、橙子香精、草莓香精、香草香精等。
[0071]
本发明的化合物的浓度水平可在0.1wt％至95wt％的范围内，即相对于药物组合物的总重量，足以获得所需的效果。
[0072]
本发明的药物组合物可以通过各种途径给药于哺乳动物，如大鼠、小鼠、家畜和人类。所有给药方式均可，例如透皮、口服、直肠、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、子宫内膜注射或脑室内注射，优选任何一种口服或静脉注射给药途径，但不限于此。
[0073]
给药可包括一种或多种具有相同或类似功能的有效成分。对于给药，可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及其一种或多种的混合物，必要时还可以添加其他常用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，通过进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，根据本发明的化合物可以很容易地配制成各种形式，例如，可以配制成注射制剂，如水溶液、悬浮液和乳剂，粉末，片剂，胶囊，丸剂，颗粒剂或注射剂。
[0074]
化合物的量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率、疾病严重程度等在一定范围内变化。本发明的化合物的日剂量为0.0001至100mg/kg，优选为0.001至30mg/kg，每天给药一次或多次。此外，给药周期可以是一天到两个月，但可以不受限制，直到显示出疾病预防或治疗效果为止。
[0075]
由于本发明的抗菌补充剂提高革兰氏阴性菌对多粘菌素类抗生素的敏感性，从而将用于抑制革兰氏阴性菌生长的多粘菌素类抗生素的处理量降低高达128倍，可显著降低因施用过量多粘菌素而引起的肾毒性等传统副作用，并显示出优异的细菌生长抑制和杀灭效果，使得多粘菌素类抗生素对耐多粘菌素类抗生素的革兰氏阴性菌的抗菌活性可以恢复，因此，本发明具有按原样使用传统抗生素而无需单独开发新抗生素的功效。
[0076]
本发明的另一方面提供了一种预防、改善或治疗由败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的方法，包括：向个体施用抗菌补充剂，其包含作为有效成分的化学式1所表示的化合物或其药学上可接受的盐；以及多粘菌素类抗生素。
[0077]
本发明的另一方面提供了一种抗菌补充剂在用于制备预防、改善或治疗由败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的药物中的用途，所述抗菌补充剂包含作为有效成分的化学式1所表示的化合物或其药学上可接受的盐；以及多粘菌素类抗生素。
[0078]
实施发明的最佳方式
[0079]
下文将通过实施例和实验例对本发明进行详细描述。然而，以下实施例和实验例仅说明本发明，并不以任何方式限制对本发明的描述。
[0080]
实施例1选择改善细菌对多粘菌素类抗生素敏感性的化合物
[0081]
1-1.选择pa108化合物
[0082]
在本发明中，利用测量细胞呼吸速率的方法，在韩国化学技术研究院化合物库所拥有的各种化合物中筛选出一种可与多粘菌素一起作用以杀死耐多粘菌素细菌的物质。作为细菌，本实验提供并使用了从延世大学医院的败血症感染患者中分离出来，并鉴定为鲍曼不动杆菌耐粘菌素357株(acinetobacter baumannii colistin resistance 357，以下简称r357株)的细菌，既是耐多粘菌素菌株，又是耐多药菌株。
[0083]
具体来说，细菌已经生长的lb琼脂平板上，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，然后在37℃、220转/分的条件下培养过夜，持续16小时。然后，在250ml烧瓶中配制50ml的1/1000稀释的培养基溶液，向其中加入0.5％的氯化三苯四氮唑(ttc)，加入16μg/ml的多粘菌素b(以下简称pmb)并混合。然后，将溶液以每孔198μl的量分配到96孔板中，最后将每个不同的候选化合物调整到5μm的浓度，以2μl的量分配到每个孔中，然后混合，使用表型微阵列在37℃下观察24小时，使用多功能微孔板阅读器再次测量od值，并比较结果值。
[0084]
结果，筛选出了一种具有改善细菌对多粘菌素类抗生素的敏感性的活性的化合物(下面化学式2的化合物)，将其命名为pa108，用于之后的实验。
[0085]
[化学式2]
[0086][0087]
1-2.pa108衍生物作为抗菌补充剂的活性确认
[0088]
为了找到pa108化合物的活性的结构相关性，共制备了14种pa108衍生物(见表1)，并通过测量细菌呼吸速率的方法验证了pmb与这些衍生物的协同作用。pa108衍生物由韩国化学技术研究院化合物库提供或直接合成。
[0089]
具体来说，在已经生长细菌的lb琼脂平板上，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，然后在37℃下以220转/分培养过夜，持续16小时。然后，在250ml烧瓶中配制50ml的1/1000稀释的培养基溶液，向其中加入0.5％氯化三苯四氮唑(ttc)和16μg/ml多粘菌素b(pmb)并混合。然后，将溶液以每孔198μl的量分配到96孔板中，最后将每种不同的候选化合物调整到5μm的浓度，以2μl的量分配到每个孔中，然后混合，使用表型微阵列在37℃下观察24小时，使用多功能微孔板阅读器再次测量od值，并比较结果值。
[0090]
结果表明，除了原始的pa108外，衍生物没有显示出杀死r357菌株的任何显著效果(图1)。
[0091]
表1
[0092]
[0093][0094]
实施例2 pa108抑制细菌生长效果的确认
[0095]
为了确认pa108的抗菌活性，采用实施例1中使用的方法测量了细胞呼吸速率，从而确认了细菌生长抑制效果。
[0096]
首先，在已经生长细菌的lb琼脂平板中，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，然后在37℃下以220转/分培养过夜，持续16小时。然后，在250ml烧瓶中配制50ml的1/1000稀释的培养基溶液，加入0.5％的氯化三苯四氮唑(ttc)并混合。然后，将溶液以每孔198μl的量分配到96孔板中。将16μg/ml的pmb和5μm的pa108各以2μl的量分配，使得pmb(16μg/ml)和pa108(5μm)的浓度调整到三个孔中，每个处理重复3次，然后混合，使用表型微阵列在37℃下观察24小时，使用多功能微孔板阅读器再次测量od值，并比较结果值。
[0097]
结果，由于r357菌株对pmb的最小抑菌浓度(mic)为64μg/ml，因此确认在16μg/ml的低浓度下对细胞生长没有抑制作用(图2，黑色)。此外，还证实pa108(其是一种开发的多粘菌素类抗菌补充剂)在5μm的浓度下也没有抑制自身细胞生长的作用(图2，蓝色)。然而，当同时使用pmb和pa108处理时，证实细胞呼吸受到有效抑制(图2，红色)。
[0098]
实施例3 pa108增加细胞死亡效果的确认
[0099]
抗生素主要有两种功效。一种是抑制细菌生长而不导致细菌死亡的抑菌剂，另一种是导致细菌死亡的杀菌剂。为了证实pa108与多粘菌素一起处理时是否实际上增加了杀菌效果，进行了细菌活力测试。
[0100]
首先，在lb琼脂平板上，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，在37℃和220转/分的条件下培养过夜，持续16小时。然后，将1％的培养液稀释到250ml的锥形(erlenmeyer)烧瓶
中，然后培养至od＝0.5。将生长的培养基各3ml分装到3个15ml的圆形培养管中，分别制备并分配其中加入16μg/ml的pmb、5μm的pa108，以及pmb(16μg/ml)和pa108(5μm)的3个处理组，每隔1、4、7和12小时在每个处理组的3个lb琼脂平板上各涂抹100μl，同时在37℃、220rpm的条件下进行培养，从而确认菌落形成单位(cfu)。
[0101]
结果，与细胞呼吸速率的结果一样，使用pmb或pa108的单一处理组并没有显示出杀死r357b菌株的效果(图3，黑色，蓝色)。然而，确认在同时使用pmb和pa108的处理组中，导致细胞死亡(图3，红色)。此外，还确认基于14小时，同时处理组的杀菌效果是对照组和单一处理组杀菌效果的107倍，最终显示杀菌效果为99.99999％。
[0102]
实施例4多粘菌素类抗生素与pa108协同抗菌效果的确认
[0103]
为了确认pa108与多粘菌素类抗生素联合处理时是否会显示协同效应，进行了棋盘试验，并根据试验结果确定了分级抑菌浓度指数(fici)。
[0104]
首先，在lb琼脂平板上，将3-4个菌落接种到4-5ml的lb肉汤中，然后在37℃和220转/分的条件下培养过夜，持续16小时。然后，在15ml圆形培养管中制备5ml的1/10000稀释的培养基，在37℃、220转/分的条件下培养至od＝0.08-0.1。然后，将溶液稀释至1/20，每孔196μl分装到96孔板中，pa108和pmb各2μl分配到每个孔中，浓度分别为0-160μm和0-64μg/ml，混合后在37℃下培养18小时，使用多功能微孔板阅读器测量od值。
[0105]
接下来，为了确认协同效应，使用标准方程计算了分级抑菌浓度(fic)指数，该指数通过将mic值与化合物单一处理的mic值进行比较，评估了化合物与抗生素的组合对疗效的影响，标准方程为化合物a的单一组合/化合物a+化合物b单独的mic组合/化合物b的mic＝fic a+fic b＝fic指数。mic和fici值见表2。
[0106]
确定，当fici值为0.5以下时，效果是协同的；当fici值为0.5至4.0时，效果是中等的；当fici值为4以上时，效果是拮抗的。
[0107]
表2
[0108][0109]
结果证实，由于pa108和pmb的fici值为0.093，因此耐药细菌的杀灭效果是协同效应(图4)。
[0110]
实施例5多粘菌素类抗生素和pa108的形态学细胞死亡效应的确认
[0111]
为了确认pa108与多粘菌素类抗生素联合处理时细菌的形态变化，使用荧光显微镜和扫描电子显微镜观察了细菌的形态变化。
[0112]
首先，在lb琼脂平板上，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，然后在37℃和220转/分钟的条件下培养过夜，持续16小时。然后，将1％的培养基稀释到250ml的锥形烧瓶中，培养至od＝0.5，分别用浓度为16μg/ml和5μm的pmb和pa108处理，培养9小时。细胞在4℃下以8,000
×
g离心10分钟，洗涤三次，然后重悬于pbs中。固定3ml细胞悬浮液，然后用扫描电子显微镜观察。使用live/dead baclight细菌活力试剂盒(cat#.l7007,invitrogen,waltham,massachusetts,usa)加入与活细胞的dna和rna结合，发出绿色荧光的syto9(67mm,3μl)和与死亡细胞的dna和rna结合，发出红色荧光的碘化丙啶(pi)(1.67mm，3μl)，
最终体积为3ml添加每个样品，然后将样品在室温下于暗室中培养15小时，用荧光显微镜观察。
[0113]
结果，在使用荧光显微镜观察时，在pmb或pa08的单一处理组中观察到绿色荧光，因此确认细胞没有像对照组那样死亡。然而，在同时使用pmb和pa108的处理组中观察到了红色荧光，因此确认得出细胞死亡(图5，上图)。
[0114]
此外，在使用扫描电子显微镜进行观察时，确认使用pmb或pa08的单一处理组与对照组一样，细胞表面未受损伤，显示完整形态。但确认，同时使用pmb和pa108的处理组中，细胞缩小，细胞内物质渗出，使得细胞的形状和结构受到破坏(图5，下图)。
[0115]
实施例6 pa108的肾毒性确认
[0116]
由于已知多粘菌素类抗生素具有肾毒性，因此使用人体衍生肾细胞achn(crl-1611)测定pmb和pa108的肾毒性。
[0117]
首先，用2
×
104个细胞/孔培养achn肾细胞24小时，并将培养基更换为在所有孔中混合pmb或pa108的培养基。经pmb或pa108处理0、24、48、72和96小时后，通过细胞滴度glo以每个时间时的atp量与0小时的比值来测量细胞活力，以评估细胞毒性。
[0118]
结果证实，在pmb的情况下，肾细胞的活力从50μg/ml的浓度开始下降(图6，左图)。对于多粘菌素类抗生素耐药菌株r357，由于多粘菌素的最小抑菌浓度为64μg/ml，因此预计在r357感染中显示治疗效果的64μg/ml浓度时会显示肾毒性。然而，在pa108的情况下，证实，在5μm的工作浓度下根本没有显示出肾毒性，即使在较高浓度下，肾细胞的存活率也显示80％以上，这与pmb不同(图6，右图)。因此，在同时使用pmb和pa108进行处理时，即使pmb的浓度为16μg/ml也能显示出对多粘菌素类抗生素耐药菌株r357的杀菌作用，因此，预计在使用pmb和pa108组合进行处理时，不会显示肾毒性。
[0119]
实施例7在小鼠败血症模型中确认用pa108处理的存活率
[0120]
在多粘菌素类抗生素耐药菌株r357感染的小鼠模型中，确认pa108和pmb同时处理是否能有效治疗r357感染引起的败血症。
[0121]
具体来说，将5
×
107株r357菌株腹腔注射到6周龄的c57bl/6小鼠体内，制备r357感染引起的败血症小鼠模型，并单独或组合地腹腔注射100μg/kg剂量的pmb和60μg/kg剂量的pa108，以测定小鼠的存活率。
[0122]
结果证实，在对照组、pmb单一处理组和pa108单一处理组中，所有小鼠均在42小时内死亡。然而，在同时使用pmb和pa108的处理组的情况下，小鼠一直存活到168小时，没有显示任何病理症状(图7)。此外，作为pmb和pa108同时处理组小鼠的尸体解剖结果，在小鼠的器官中没有检测到r357菌株，因此证实pmb和pa108同时处理完全去除了r357菌株。
[0123]
实施例8在多粘菌素耐药菌的其他物种中确认抗菌补充剂的功效
[0124]
为了确认在同时使用pa108和多粘菌素类抗生素处理除r357菌株以外的物种的多粘菌素耐药菌时是否显示出协同效应，进行了棋盘试验，并根据结果确定了分级抑菌浓度指数(fici)。
[0125]
首先，在每个细菌(肺炎克雷伯菌sch530、sch740、sch777，铜绿假单胞菌smc-u9、smc-u10、smc-u11)生长的lb琼脂平板上，将3至4个菌落接种到4至5ml的lb肉汤中，在37℃下以220转/分培养过夜，持续16小时。第二天，在15ml圆形培养管中将5ml稀释至1/10000的培养基，在37℃、220转/分的条件下培养至od＝0.08-0.1，然后稀释至1/20，以196μl的量分
装在96孔板中。pa108和pmb分别以0至80μm和0至128μg/ml的浓度，每孔各2μl分配到每个孔中，混合后于37℃孵育18小时，使用多功能微孔板阅读器测量od值。
[0126]
接着，以与实施例4相同的方法计算fici，mic值和fici值见下表3：
[0127]
表3
[0128][0129]
结果，由于pa108和pmb的fici值显示为0.5以下(0.5以下是在所有菌株中显示协同效应的参考值)，因此确认杀死其他革兰氏阴性菌(肺炎克雷伯菌sch530、sch740、sch777，铜绿假单胞菌smc-u9、smc-u10、smc-u11)物种的效果是pa108和pmb的协同效应(图8)。
[0130]
实施例9通过同时使用多粘菌素类抗生素和pa108处理，确认基因表达的变化和作用机制
[0131]
通过转录组分析，证实了pa108与多粘菌素类抗生素pmb联合处理耐药菌时，残余耐药菌死亡的主要基因的表达发生了变化。
[0132]
首先，在lb琼脂平板上，将一个菌落接种到3ml的lb肉汤中，在37℃和220转/分的条件下培养过夜，持续16小时。然后，将1％的培养液稀释到250ml的锥形烧瓶中，然后培养至od＝0.5。将各5ml的培养基分装到三个15ml的圆形培养管中，分别用浓度为16μg/ml的pmb、浓度为5μm的pa108，以及浓度为16μg/ml的pmb和浓度为5μm的pa108处理，然后在37℃、220转/分的条件下培养1小时。然后，用pbs冲洗细菌三次，在4℃和8,000
×
g条件下离心10分钟，并保存在-80℃下。
[0133]
用truseq stranded总rna样品制备试剂盒(包括ribo-zeroh/m/r)提取总rna，合成150bp大小的cdna，制备用于rna测序的文库。用agilent 2100bioanalyzer(agilent，ca，usa)评估合成的cdna文库的质量，扩增变性模板的簇后，用illumina novaseq 6000(illumina，ca，usa)对dna片段的两端进行配对测序。为了分析转录组数据，对读值进行了过滤，并使用对齐器star v.2.4.0b将过滤后的读值映射到参考基因组。之后，为了测量基因表达量，使用kapa文库定量试剂盒(kapa biosystems,ma,usa)按照制造商的文库定量方案对基因表达量进行定量。
[0134]
为了鉴定差异表达基因(deg)，使用cufflinks v2.1.1，使用基因注释数据库测量基因表达水平，并使用htseq-count v0.6.1p1生成基因表达水平计数数据。在生成的数据中，使用tcc r包将q值小于0.05的基因鉴定为差异表达基因。
[0135]
对鉴定为差异表达基因(deg)的基因进行基因本体(go)分析，将基因按生物过程、分子功能和细胞组分三类进行分类，并提供基因功能的信息。
[0136]
结果，与对照组相比，所有pmb单一处理组、pa108单一处理组以及pmb和pa108同时处理组都观察到了显著的基因变化(图9)。此外，通过基因本体(go)分析证实，当同时使用pmb和pa108处理时，参与锌离子结合、相同蛋白结合、铁离子结合的基因的表达量和参与过氧化物酶活性的基因的表达量可能会显著下降，而参与通过细胞膜转运物质的基因的表达量，特别是atp酶偶联硫酸盐跨膜转运蛋白活性的基因的表达量会显著增加(图10)。
[0137]
据推测，当使用低剂量抗生素pmb进行处理时，产生一种外部物质更容易渗透的物理和化学环境，并且由于pa108更容易渗透到细胞质周围空间，与细胞膜负责蛋白质氧化和各种营养物质运输的功能有关的基因的表达减少，从而显示出细胞死亡效应。
[0138]
此外，据此推测，超氧化物(一种显示高突变率和生长缺陷并作为毒素和过氧化氢的活性氧)引起细胞内氧化应激反应，与调节调节酶以调节反应的活性氧的活性有关的基因的表达减少，从而破坏了细胞的内稳态，因此显示出细胞死亡效应。
[0139]
此外，据推测，与铁离子结合和蛋白分解功能有关的基因以及与苯乙酸分解代谢有关的基因的表达受到抑制，从而抑制了铁载体(sideropore)的合成，穿过细胞膜的pmb和pa108与某些蛋白质和dna结合，降低新陈代谢，并显示出细胞死亡效应。
[0140]
本发明的抗菌组合物通过使用对细菌没有直接作用的低浓度抗生素(pmbb)处理，使细胞膜的流动性变得顺畅，细菌活性氧通过进入细胞质的物质(pa108)过度产生，破坏细胞的内稳态，从而降低细胞的通透性，导致细胞死亡。
[0141]
实施例10通过同时使用多粘菌素类抗生素和pa108来确认细菌膜的变化
[0142]
多粘菌素e(粘菌素)与革兰氏阴性菌细胞外膜的磷脂和脂多糖(lps)特异性结合，显示出杀菌活性，而耐粘菌素细菌由于lps改变，导致粘菌素与细菌外膜之间的亲和力下降，从而显示对粘菌素的耐药性。因此，确认pa108的添加是否会导致细菌的转运和渗透性发生变化。
[0143]
具体来说，对于制备样品，将生长16小时的菌落培养物洗涤并重悬于ph值为7.4的0.01m pbs中。在相同的缓冲溶液中，将细菌悬浮液在600nm处的吸光度标准化为0.5，加入最终浓度为1.67μm的色素pi9(cat.p1304mp,thermo fisher scientific,waltham,massachusetts,usa)。37℃培养30分钟后，在96孔板中加入198μl荧光标记的细菌细胞，并加入16μg/ml pmb和2μl 5μm pa108。再次培养30分钟后，用多功能微孔板阅读器在激发波长为535nm、发射波长为615nm的荧光测量波长范围内测量荧光，以测量膜渗透性。
[0144]
将细胞膜电位重悬于5mm hepes(ph 7.0，+5mm葡萄糖)中，加入对电位敏感的色素disc3(5)(3,3'-二丙基噻二碳菁碘化物)(50μm，cat.d306,invitrogen,carlsbad,california)，培养30分钟，然后用多功能微孔板阅读器测量荧光以测量膜电位。
[0145]
结果证实，pmb和pa108的组合处理改变了细菌的细胞质膜电位(图11，右图)，但不影响整体膜渗透性(图11，左图)。
[0146]
结果表明，低剂量的pmb处理并没有改变导致细菌死亡的膜通透性，而是形成了一种使革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(lps)不稳定的物理化学环境，外来物质更容易进入，同时处理的pa108进入细胞膜，形成细胞膜的离子通道或孔，使细胞膜产生高膜去极化。
[0147]
结果显示，pa108作为pmb的抗菌补充剂同时处理，引起细菌细胞质膜的脂双层区
域破坏，从而导致细菌死亡。

技术特征：
1.一种抗菌补充剂，包含以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分：[化学式1]其中，x是卤素原子，并且r1和r2各自独立地为氢原子或具有1至6个碳原子的烷基。2.根据权利要求1所述的抗菌补充剂，其中，x是氯原子，r1是氢原子，r2是甲基。3.根据权利要求1或2所述的抗菌补充剂，其中，所述抗菌补充剂改善细菌对多粘菌素类抗生素的敏感性。4.根据权利要求3所述的抗菌补充剂，其中，所述多粘菌素类抗生素是多粘菌素b或多粘菌素e。5.根据权利要求3所述的抗菌补充剂，其中，所述细菌为革兰氏阴性菌。6.根据权利要求5所述的抗菌补充剂，其中，所述革兰氏阴性菌为埃希氏菌属(escherichia sp.)、不动杆菌属(acinetobacter sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)或克雷伯氏菌属(klebsiella sp.)。7.根据权利要求6所述的抗菌补充剂，其中，所述埃希氏菌属是选自由大肠埃希氏菌(escherichia coli)、艾伯特埃希氏菌(escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(escherichia blattae)、弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)、赫尔曼埃希氏菌(escherichia hermannii)和脆弱埃希氏菌(escherichia vulneris)组成的组中的至少一种；所述不动杆菌属是选自由鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)、博伊西不动杆菌(acinetobacter boissieri)、醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)、溶血不动杆菌(acinetobacter haemolyticus)、医院不动杆菌(acinetobacter nosocomialis)、辛德勒不动杆菌(acinetobacter schindleri)和乌尔新不动杆菌(acinetobacter ursingii)组成的组中的至少一种；所述假单胞菌属是选自由铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、穿孔素假单胞菌(pseudomanas pertucinogena)、施氏假单
胞菌(pseudomanas stutzeri)和丁香假单胞菌(pseudomanas syringae)组成的组中的至少一种；所述克雷伯氏菌属是选自由肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia)、肉芽肿克雷伯氏菌(klebsiella granulomatis)、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)和土生克雷伯氏菌(klebsiella terrigena)组成的组中的至少一种。8.根据权利要求5所述的抗菌补充剂，其中，所述革兰氏阴性菌是多粘菌素类抗生素耐药菌或多药耐药菌。9.一种抗菌组合物，包含权利要求1所述的抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。10.根据权利要求9所述的抗菌组合物，其中，所述组合物导致革兰氏阴性菌的细胞死亡。11.根据权利要求9所述的抗菌组合物，其中，所述组合物使革兰氏阴性菌的细胞膜去极化以破坏细胞膜。12.一种用于预防或治疗由败血症或脓毒性休克引起的器官损伤的药物组合物，包含权利要求1所述的抗菌补充剂和多粘菌素类抗生素作为有效成分。13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述败血症或脓毒性休克是由埃希氏菌属或不动杆菌属的细菌感染引起的。14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述器官是选自由肝脏、肾脏和肺组成的组中的至少一种。

技术总结
本发明涉及含有联苯基衍生物化合物作为活性成分的抗菌佐剂及其各种用途的技术。本发明的化合物减少了多粘菌素类抗生素的用量，施用该组合物以抑制革兰氏阴性菌的增殖，通过提高革兰氏阴性菌对多粘菌素类抗生素的敏感性，与多粘菌素类抗生素联合使用，显示出抑制革兰氏阴性菌生长和杀灭革兰氏阴性菌的作用，可显著降低肾毒性等副作用，并且可预防或治疗因过度使用抗生素而引起的败血症和脓毒性休克。度使用抗生素而引起的败血症和脓毒性休克。度使用抗生素而引起的败血症和脓毒性休克。


技术研发人员：金俊燮 柳忠民 金善莹
受保护的技术使用者：韩国生命工学研究院
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/10/7