一种膜荚黄芪幼苗的培育方法

1.本发明涉及植物栽培技术领域，具体涉及一种膜荚黄芪幼苗的培育方法。


背景技术：

2.黄芪属隶属豆科多年生草本植物，又名黄耆、棉芪等，以膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根入药，是目前应用最为广泛且药用价值极高的中草药之一。黄芪属植物广泛分布在全球温带地区，约有2000种，主要分布在欧洲、亚洲及北美洲，中国有278种。膜荚黄芪主要分布在华北、东北、内蒙古和西北地区等温暖干旱的地区。在东汉时期的“神农经荆”中曾被列为上层产品，并持续出现在历代本草经中。膜荚黄芪味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳、生津养血、脱毒排脓等功效。中医药学中常作为滋补中药材使用，可用于补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、脱毒排脓、敛疮生肌等症状。在临床实践中，常被运用于治疗身体虚弱无力、呼吸急促、自汗、虚脱等症状]。现代药理研究亦证明了，膜荚黄芪具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、强心作用、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、利尿作用等活性，对免疫系统、心血管系统以及神经系统，肝脏和肾脏系统有多重保护作用。
3.随着膜荚黄芪在药物应用方面的逐步深入，还被广泛应用于新领域，在保健品和化妆品行业中得到了迅速发展。由于和膜荚黄芪相关应用逐渐被重视导致需求量的增加，人们采取不正当的方式对野生膜荚黄芪进行采挖，破坏其生存环境，使野生膜荚黄芪濒临绝灭，膜荚黄芪的数量已降至符合植物逐渐恶化的物种标准。为保护该物种以及缓解膜荚黄芪供需之间的矛盾，改良中草药类经济作物使其适应适应新环境成为解决问题的关键，期望达到保护膜荚黄芪物种和发展农业经济的双重目标。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，解决了膜荚黄芪的数量下降的问题。
5.本发明通过下述技术方案实现：本发明提供一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，包括：种子处理：挑选大小一致饱满的膜荚黄芪种子，对种子进行消毒处理后，用水冲洗干净，浸泡备用；接种菌剂：将am真菌用苜蓿扩繁，并用以真菌菌丝、孢子、侵染根段以及含有根外菌丝体的根际土壤混合物为基础，进行菌剂接种，得到接种物；培养基质：将土壤经自然光风干后，加入细沙和土壤混合，过筛，取筛下物，装在密封的布袋中，用高压蒸汽灭菌；幼苗培育：将浸泡后的膜荚黄芪种子置于培养基质中，将接种物放置在膜荚黄芪种子下方1-3cm土层，浇水，进行培养出苗。
6.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，采用浓度为0.5%-1.5% naclo溶液对种子表面进行消毒处理5 min
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15 min。
7.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，细沙和土壤按照质量比1:1-3混合。
8.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，所述am真菌包括：根内根孢囊霉和/或摩西管柄囊霉。
9.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，所述接种物中am真菌孢子密度为20-30个/g。
10.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，在幼苗培养步骤中，培养环境的相对湿度50%~70%，温度20℃~35℃。
11.进一步地，在所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，所述接种物与培养基质的质量比为（0.5~2）
×
10-5
：1。
12.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明提供的膜荚黄芪幼苗的培育方法，通过am真菌的菌丝能够扩大根的吸收面积、增强根的吸收能力，改善了植物对营养和水分的吸收，提高盐胁迫下植物的根系活力，增强了植物的抗逆性，维持了植物的生长发育，有效缓解了盐胁迫对植株伤害，提高膜荚黄芪抵抗盐处理的能力。
13.本发明提供的膜荚黄芪幼苗的培育方法，随着盐浓度的增加，膜荚黄芪叶片中丙二酸和脯氨酸含量也随之升高，接种am真菌后，膜荚黄芪植株叶片中的丙二醛和脯氨酸的含量上升较为迟缓，在高度盐水平下，分别接种rf、f处理组的丙二醛和脯氨酸的含量相较于对照组分别降低了61.45%和18.06%，说明接种am真菌可以有效地缓解膜荚黄芪叶片膜受损程度，从而减缓植株在逆境中受到的伤害，保护植物膜系统。
14.本发明提供的膜荚黄芪幼苗的培育方法，通过接种am真菌还可以提高抗氧化酶：超氧化物歧化酶（sod）、过氧化物酶（pod）和过氧化氢酶（cat）的活力，能够消除植物中自由基，盐处理下植物能够通过增强抗氧化酶活性增强耐盐性。在高度盐水平下，接种r处理组sod和pod活性相较于对照组分别增加了96.09%、21.59%，接种rf处理组cat活性较对照组增加了77.41%，说明接种am真菌可以清除植物体内的自由基，减少了盐处理下叶片的损伤程度。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：图1为试验例1中接种不同am真菌对膜荚黄芪植株株高的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一生长时期不同菌种之间株高的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同生长时期相同菌种之间株高的差异显著（p＜0.05）。
16.图2为试验例1中接种不同am真菌对膜荚黄芪植株茎粗的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表
示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一生长时期不同菌种之间茎粗的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同生长时期相同菌种之间茎粗的差异显著（p＜0.05）。
17.图3为试验例1中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株根长的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间根长的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间根长的差异显著（p＜0.05）。
18.图4为试验例2中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株鲜重和干重的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间鲜重、干重的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间鲜重、干重的差异显著（p＜0.05）。
19.图5为试验例2中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪土壤中amf孢子密度的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间孢子密度的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间孢子密度的差异显著（p＜0.05）。
20.图6为试验例2中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪菌根侵染率的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间侵染率的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间侵染率的差异显著（p＜0.05）。
21.图7为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株脯氨酸含量的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间脯氨酸含量的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间脯氨酸含量的差异显著（p＜0.05）。
22.图8为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株可溶性蛋白含量的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间可溶性蛋白含量的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间可溶性蛋白含量的差异显著（p＜0.05）。
23.图9为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株丙二醛含量的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间丙二醛含量的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代
表不同浓度相同菌种之间丙二醛含量的差异显著（p＜0.05）。
24.图10为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株过氧化物酶活性的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间过氧化物酶活性的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间过氧化物酶活性的差异显著（p＜0.05）。
25.图11为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株过氧化氢酶活性的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间过氧化物氢活性的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间过氧化物氢活性的差异显著（p＜0.05）。
26.图12为试验例3中不同盐处理下接种am真菌对膜荚黄芪植株过氧化氢酶活性的影响；其中，nm表示未接种am真菌处理组即对照组；r表示接种根内根孢囊霉处理组；f表示接种摩西管柄囊霉处理组；r+f表示接种混合根内根孢囊霉与摩西管柄囊霉处理组；不同小写字母代表同一浓度不同菌种之间超氧化物歧化酶活性的差异显著（p＜0.05）；不同大写字母代表不同浓度相同菌种之间超氧化物歧化酶活性的差异显著（p＜0.05）。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.实施例1
29.本实施例提供一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，包括：种子处理：挑选大小一致饱满的膜荚黄芪种子，采用浓度为1% naclo溶液对种子表面进行消毒处理10 min，蒸馏水与去离子水冲洗2遍，浸泡备用；接种菌剂：将am真菌（根内根孢囊霉和/或摩西管柄囊霉）用苜蓿扩繁，并用以真菌菌丝、孢子、侵染根段以及含有根外菌丝体的根际土壤混合物为基础，进行菌剂接种，得到接种物；所述接种物中根内根孢囊霉孢子密度为28个/g，摩西管柄囊霉孢子密度为24个/g。
30.培养基质：将土壤经自然光风干后，细沙和土壤按照质量比1:2混合，过筛，取筛下物，装在密封的布袋中，用高压蒸汽灭菌；幼苗培育：将浸泡后的膜荚黄芪种子置于培养基质中，按照接种物与培养基质的质量比为1.5
×
10-5
：1将接种物放置在膜荚黄芪种子下方2cm土层，浇水，在相对湿度65%，温度30℃环境下，进行培养出苗。
31.试验例11.1试验设计
依照实施例1的培养方法在花盆中进行培养，花盆大小150*130*150（mm），每盆装沙土混合物2 kg。设置不接种组（nm组）、单独接种根内根孢囊霉组（r组）、接种摩西管柄囊霉组（f组）、混合接种根内根孢囊霉和摩西管柄囊霉组（1：1）（rf组），设置两个平行实验，每个处理组进行3个重复，一共24盆。其中，在接种时，不接种处理组加等重量的灭菌接种物和不灭菌接种物的水滤液以保证与其他组处理的土壤营养状况一致。出苗后每盆定苗10株。按照测试指标的要求保存各类样品，分别在植株生长30 d、60 d、100 d，对植株进行生长指标的测定以及am真菌侵染率。
32.1.2膜荚黄芪幼苗生长指标的测定1.2.1 膜荚黄芪植株株高的测定与分析分别在植株生长30 d、60 d、100 d，测量膜荚黄芪植株自然状态下植株最高点到土壤的距离。
33.准确测量膜荚黄芪不同时期接种不同am真菌的植株高度，分别从30 d、60 d、100 d三个生长时期下考察未接种nm组，接种r、f组和rf混合组四个处理组别对膜荚黄芪生长指标株高的影响，结果见图1。
34.从图1可以看出，在膜荚黄芪植株生长初期，各组別株高差异不大，接种r、f、rf三种处理组均表现出更高的株高，其中r组和f组之间相较于对照组分别增加了29.51%和21.31%，存在显著的差异（p＜0.05）。在膜荚黄芪植株生长后期，接种r组与f组植株有明显差异（p＜0.05）且均高于混合rf组别，接种r、f、rf三种处理组植株的株高均高于对照组，其中接种r组差异最为显著，相较于对照组增加了25.54%。由此可见，膜荚黄芪植株在生长过程中，接种r、f、rf三种处理组相较于对照组均有显著差异，其中接种r组显著高于接种f组及rf混合组。
35.1.2.2 膜荚黄芪植株茎粗的测定分别在植株生长30 d、60 d、100 d，测量膜荚黄芪植株自然状态下植株茎基部的茎粗。
36.准确测量膜荚膜荚黄芪不同时期接种不同am真菌的植株茎部粗细，分别从30 d、60 d、100 d三个生长时期下考察未接种nm组，接种r、f组和rf混合组四个处理组别对膜荚黄芪生长指标茎粗的影响，结果见图2。
37.从图2可以看出，在膜荚黄芪植株生长初期，接种r、f、rf三种处理组茎粗均高于对照组，均具有显著差异（p＜0.05），其中接种r组与f组较之接种rf混合组相比对照组分别增加了50.29%、50.86%、37.14%，有明显差异。在膜荚黄芪植株生长中期，接种r、f、rf三种处理组株高均高于对照组且有明显差异（p＜0.05），其中接种r组与混合rf组与对照组相比分别增加了15.71%和5.71%，均高于接种f组。在膜荚黄芪植株生长后期，接种r、f、rf三种处理组株高均高于对照组有明显差异性（p＜0.05），其中接种f组效果最为明显，接种r组植株次之，分别增加了34%和24%，均高于接种rf混合组别。另外，膜荚黄芪植株在生长过程中，接种r、f、rf三种处理组相较于对照组均有显著差异，其中接种f组在植株生长后期效果最好于接种r组及rf混合组。
38.近年来，随着大型工厂的排放污染以及人类不当的资源利用，环境在不断的恶化，盐碱地面积也不断地扩大，土壤盐碱化是干旱、半干旱区农业生产中最重要的非生物因素之一，全球约1
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109hm2盐碱化土地，约占地球陆地总面积的7%，并且盐碱化范围仍在扩大。
土壤盐碱化作为最严峻的世界环境难题之一，严重影响着全球范围内土壤退化和水资源的可持续发展，土壤盐碱化还严重影响农作物的产量，导致盐碱化农田不断恶化。我国土地盐碱化问题持续增加，盐碱地面积逐步扩大、数量不断增多、类型复杂多样，总面积约 3.6
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7 hm2，总耕地面积约6.6%，在西北、华北和东北西部等各种气候类型地区均有分布，严重威胁着我国的生态环境及粮食安全。在这些盐碱土中，西北地区尤为严重，占据了全国盐渍土面积的近70%，土壤盐渍化是较为突出且亟待解决的问题，具有复杂性、长期性、普遍性，农业生产受到严重的制约，给灌溉农业造成了损失，土壤盐碱化问题已经严重阻碍农牧业经济的发展。处理土壤盐碱化问题进而充分发挥和利用这一部分土地资源刻不容缓，对改善农业循环、提高生态水平具有重要的战略意义。
39.对此，探究膜荚黄芪幼苗在盐碱地中的培育有巨大必要性。下面实施例2通过向培养基质中加入nacl溶液用以模拟不同外部自然盐渍化条件和人为接菌处理对各组膜荚黄芪生长的影响。
40.实施例2
41.本实施例提供一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，在实施例1的培养方法基础上，在膜荚黄芪种子生长100d以后，按照每1kg的培养基质中，加入nacl溶液体积为7ml，向培养基质中加入0.01-100mm的nacl溶液，共浇15d。
42.试验例22.1试验设计依照实施例2的培养方法在花盆中进行培养，花盆大小150*130*150（mm），每盆装沙土混合物2 kg。设定：分别设置4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）每个盐处理设置不接种组、单独接种根内根孢囊霉组、接种或摩西管柄囊霉组、混合接种根内根孢囊霉和摩西管柄囊霉组，设置两个平行实验，每个处理组进行3个重复，总共96盆。其中，在接种时，不接种处理组加等重量的灭菌接种物和不灭菌接种物的水滤液以保证与其他组处理的土壤营养状况一致。植物生长100 d后对其进行盐处理。4个浓度的盐溶液分别浇入对应盆中，每盆每天浇15 ml，共浇15 d。待植物生长2周后，对其进行收获。
43.2.2膜荚黄芪植株生长指标的测定2.1膜荚黄芪植株根长的测定待膜荚黄芪植株收获时，将其地上部分的叶子剪掉并保存，留下其根部测量其根长。
44.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌的植株根部长度，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪生长指标根长的影响，结果见图3。
45.从图3可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪幼苗的根长都大于对照组别的根长，差异显著（p＜0.05）。盐处理下各组膜荚黄芪幼苗根长表现出随盐浓度水平的升高而增大的变化趋势。在25mm盐浓度下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪幼苗根长均显著高于对照组（p＜0.05），相较于对照组，接种r处理组增加了21.33%；接种f处理组增加了9.68%；接种rf混合处理组增加了4.48%。在50mm盐浓度下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪幼苗根长均显著高于对照组（p＜0.05），接种r、f及混合rf处理组相对比对照组分别增加了28.99%、18.01%、10.12%。在100mm盐浓度下，接种r、f、rf三种处理组的膜荚黄芪幼苗
根长相较于对照组有明显的提高且具有差异显著性（p＜0.05），接种r处理组植株根长大于对照组且差异显著，增加了19.35%，接种f及接种rf混合处理组略高于对照组。随着盐度的增加，膜荚黄芪植株根长在未接种am真菌处理组受到盐浓度的影响，在低中度盐处理下生长缓慢，在高盐度处理下生长呈现下降趋势；而在接种am真菌处理下，在低中度盐处理下，膜荚黄芪植株能够正常生长，在高度盐处理下缓缓生长。表明接种am真菌有助于植物在逆境下生长，在低中高盐处理下均有效缓解盐环境对植株生长的带来的损害，接种不同am真菌均对膜荚黄芪植株的根部生长起到促进的作用，而接种r、f、rf三种处理组相比下，接种r处理组对膜荚黄芪植株根部的生长更具有优势。综上，接种am真菌缓解了盐处理对膜荚黄芪幼苗根部生长受到的阻碍。
46.2.2膜荚黄芪植株鲜重、干重的测定将膜荚黄芪的将叶子摘下并彻底清洗，擦干水分，称重，即为其新鲜的重量。然后把它放进干燥箱里，设定70
°
c的温度，烘干48 h直到恒重，称重量为干重。
47.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌的植株鲜重和干重，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪生长指标鲜重、干重的影响，结果见图4。
48.从图4可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪幼苗鲜重、干重均高于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）随着盐浓度等级的升高，膜荚黄芪在盐处理条件下呈现出不同的鲜重和干重变化趋势。在25 mm盐浓度下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪鲜重和干重均显著高于对照组（p＜0.05），其中接种混合rf处理组相较于对照组鲜重明显增加了13.23%，接种r、f处理组相比增幅不大；接种r、f、rf三种处理组干重较于对照组分别增加了6.12%、5.92%、7.70%。在50 mm盐浓度下，接种r、f两组处理组鲜重、干重较对照组均有明显增加，其中接种f处理组增幅最大，鲜重、干重分别增加了16.30%、18.75%。在100 mm盐度下，接种r、rf两组处理组略有起伏，而接种f处理组明显高于对照组，其鲜重、干重分别增加了17.35%、18.64%。随着盐度的增加，未接种am真菌的膜荚黄芪植株鲜重和干重在低度盐处理下受到的影响不大，说明较低的盐浓度环境对植物生物量的变化影响不显著：而在中高盐度下，盐处理程度的增加会明显的抑制植物生物量的增加，使植株生长呈现下降趋势，接种r、f以及rf混合处理组都可以有效缓解盐处理给膜荚黄芪生物量带来的影响，并且在高度盐环境下对于生物量的提升更为明显，在接种r、f、rf三种处理组处理下，接种f处理组更能够稳定维持膜荚黄芪植株正常的生长。
49.2.3膜荚黄芪根际土壤amf孢子密度的测定称取50 g风干土样，泡入500 ml水中静置20～30 min等待分层，待大的石砾或者杂物沉积在烧杯底部，将上悬液迅速倒在从上往下分别为40目、80目、100目、120目和180目的筛网中。用洗瓶将下层筛中的过滤物冲洗至100 ml离心管中，3000 rpm离心5 min。除去水面杂物及上清液。有时上清液中含有较轻的孢子，应先检查后再除去。加入60 ml蔗糖溶液，搅拌均匀后迅速放入离心机，3000 rpm离心3 min。将上悬液过180目筛，并用水冲洗数分钟以除去残留的蔗糖溶液。用洗瓶依次轻轻冲洗停留在筛面上的残余物，将其转移至培养皿中，于显微镜下进行观察并统计培养皿内所有孢子数量。
50.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌对盐渍化土壤中膜荚黄芪根际土壤amf孢子密度的影响，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）
的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对土壤中amf孢子密度的的影响，结果见图5。
51.从图5可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪土壤中amf孢子密度均高于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）。各组膜荚黄芪土壤amf孢子密度随盐浓度等级升高表现出多样化趋势。在25 mm盐浓度下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪土壤中amf孢子密度均显著高于对照组（p＜0.05），其中接种混合rf处理组明显优于接种r、f处理组，混合rf处理组相较对照组孢子密度增加了38.3 %。在50 mm盐度下，接种r、f两个处理组对比对照组均有明显降低，而接种混合rf处理组则显著增加了56.74%。在100 mm盐度下，接种f、rf两个处理组相较于对照组略有增加，而接种r处理组则有所降低。膜荚黄芪土壤中amf孢子密度在未接种am真菌处理组时随着盐度的增加受到的处理不同，在低中度盐处理下膜荚黄芪土壤中amf孢子密度并未受到影响，而在高盐度处理下受到阻碍；而在接种am真菌处理下，膜荚黄芪土壤中amf孢子密度在中度盐浓度下有所改善，其优势菌种为混合接种rf处理组，在中度盐处理下可以减少阻碍。
52.2.4菌根侵染率的测定：植物采收后，剪去地上部及根系完整样品，漂洗至净，蒸馏水洗三次，从根部挑选出1～2 g新鲜根段，清洗后剪成约1 cm的根段，放入组织包埋盒内。将组织包埋盒放入装有 10% koh 溶液的 500 ml烧杯中浸没，90
ꢀ°
c水浴锅内放置60 min去除根系细胞内含物和细胞壁色素，使得根系透明。弃去koh溶液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。将组织包埋盒浸泡在装有2% hcl溶液的烧杯内，常温10 min。弃去hcl溶液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。将组织包埋盒浸泡在装有0.05%台盼蓝溶液的烧杯内，90
ꢀ°
c水浴锅内染色30 min。弃去染液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。将组织包埋盒浸泡在装有脱色液的烧杯内，常温脱色2 d。脱色后随机挑取30个根段制片，每张载玻片压制10根。在显微镜观察。其计算公式如下：菌根侵染率（%）=（侵染的根段数/观察的总根段数）
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100%。
53.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌对盐渍化土壤中膜荚黄芪菌根侵染率的影响，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪菌根侵染率的影响，结果见图6。
54.从图6可以看出，膜荚黄芪菌根侵染率受盐处理的影响因盐浓度不同而异，因此在不同盐浓度的处理下，其变化趋势也不尽相同，盐处理下均未发现未接种am真菌组别膜荚黄芪有菌根侵染的状况。随着盐浓度的增长，接种r、f、rf三种处理组的侵染率在低度盐处理下受影响不大，均呈现缓慢上升的趋势，随着盐浓度的增加，在中高度盐处理下侵染率逐渐降低。在非盐碱条件下，接种r处理组高于接种f、rf处理组，具有差异显著性（p＜0.05），接种r处理组相比接种f、rf处理组分别高出34.15%、26.48%。在25 mm盐浓度下，接种r处理组分别高于接种f、rf处理组15.15%、21.2%，差异性显著（p＜0.05）。在50 mm盐度下，接种r处理组高于接种f、rf处理组，具有差异显著性（p＜0.05），接种r处理组相比接种f、rf处理组分别高出28.11%、34.58%。在100 mm盐度下，接种r处理组分别高于接种f、rf处理组30.26%、63.38%，有明显差异性（p＜0.05）。总之，接种r处理组与膜荚黄芪建立了良好的共生关系，在盐处理条件或非盐处理条件下，接种r处理组侵染率均高接种f、rf处理组，且对中高度盐处理有更强的应答能力。
55.试验例1和2的结果表明：接种am真菌能促进膜荚黄芪植株在株高、茎粗上的生长。
56.接种am真菌可显著的促进盐处理下膜荚黄芪植株的生长，从而减轻了盐处理毒害。未接种am 真菌的处理组下，盐处理对膜荚黄芪幼苗的生长产生了明显的抑制效应，这种抑制作用在植物生长的多个方面都得到了充分的表现。植物生物量的变化并未受到盐浓度较低环境的显著影响，而在中高盐度下，盐处理程度的增加会明显的抑制植物的生长发育，使植株生长呈现下降趋势。植物在面对逆境时，其生物量不仅是其生长状况的体现，更是反映其在逆境中所表现出的耐受性和生命力的重要指标，接种am真菌可显著的促进盐处理下植物的生长，提高膜荚黄芪抵抗盐处理的能力。
57.试验例33.1试验设计与试验例2中的试验设计步骤相同。
58.3.2.膜荚黄芪植株幼苗生理学指标的测定3.2.1膜荚黄芪植株脯氨酸含量的测定对脯氨酸采用茚三酮比色法进行测定。称取新鲜叶片样本0.2 g左右于研钵中，在低温条件下迅速充分研磨，向其中加入预先配制好的3%的磺基水杨酸溶液1.5 ml，振荡混匀，匀浆使用滤纸过滤，之后12000 rpm离心10 min，取上清液1 ml移至10 ml新的试管中，将1 ml酸性茚三酮溶液和1 ml冰乙酸混合，搅拌均匀后，将混合物转移至沸水中进行1 h的水浴加热，直至溶液呈现出鲜艳的红色。取出后，迅速将其置于冰上进行冷却，同时向其中加入2 ml的甲苯,震荡摇匀30 s，静置至分层。吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液，并测定其在520 nm处的吸光值。每次采集的样品3个重复，以蒸馏水代替提取液作为空白对照。
59.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株脯氨酸的含量，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪生理指标脯氨酸含量的影响，结果见图7。
60.从图7可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪叶片中脯氨酸含量均低于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）。随盐浓度水平升高，各处理组膜荚黄芪叶片的脯氨酸均升高，呈现上升的趋势。在各盐浓度处理下，接种am真菌的脯氨酸含量均低于对照组且达到显著性差异（p＜0.05），对照组累积的脯氨酸含量明显高于各接菌处理组，表明其受到的盐处理程度远大于各接菌处理组。接种r、f、以及混合rf处理组在不同盐处理时均降低了膜荚黄芪叶片的脯氨酸含量，其中接种f处理组在低中高盐浓度对比对照组分别降低了25.5%、22.59%、18.06%，接种混合rf处理组在低中高盐浓度对比对照组分别降低了15.3%、21.31%、17.97%，接种r处理组在低中高盐浓度对比对照组分别降低了15.33%、13.47%、17.77%。综上，随着盐浓度的增加，对植物膜造成的损伤越大，膜荚黄芪叶片的脯氨酸含量逐渐升高，说明接种am真菌可以有效地缓解膜荚黄芪叶片膜受损程度，缓解了盐处理对膜荚黄芪植物体内的渗透平衡的破坏，在接种r、f、rf三种处理下，接种f处理组效果最好，其在低中度浓度下影响较大，可见接种am真菌可以有效缓解盐处理对植株造成的损伤，更好的维持膜荚黄芪的渗透调节平衡。
61.3.2.2膜荚黄芪植株可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝染色法进行测定。称取0.2 g膜荚黄芪试样置于研钵中，磨至匀浆后转移至10 ml容量瓶中。使用蒸馏水对研钵重复清洗三次，并将清洗液并入容量瓶中，吸
取匀浆液3 ml在离心管中，5000 rpm离心分离10 min，上清液作为需要的蛋白质提取液。取0.1 ml蛋白质提取液，0.9 ml蒸馏水和5 ml考马斯亮蓝g-250均匀混合，静置2 min后，在595 nm波长处比色读出吸光值并进行计算结果。
62.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株可溶性蛋白的含量，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪生理指标可溶性蛋白含量的影响，结果见图8。
63.从图8可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪叶片中可溶性蛋白含量均高于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）。盐处理下各组膜荚黄芪叶片中可溶性蛋白质含量均随盐浓度增加呈先升高再降低的变化趋势。各种盐浓度处理下接种am真菌可溶性蛋白含量都比对照组高并存在显着差异（p＜0.05），在25 mm盐度下，接种r处理组相较于对照组可溶性蛋白含量显著增加了25.65%，接种f、rf处理组较于对照组波动不大。在50 mm盐度下，接种r、f、rf处理组相比对照组可溶性蛋白含量分别增加了24.61%、18.6%、12.21%，其中接种r处理组别显著优于其他组别。在100 mm盐度下，接种r、f、rf处理组均略高于对照组。相对比未接种am真菌处理组接种am真菌更有利于提升植株在低中度盐处理下可溶性蛋白的含量，并且有助于降低植株在高度盐处理环境下的迫害，其中接种r、f、rf三种处理组相比接种r处理组更有助于植物的生长。
64.3.2.3膜荚黄芪植株丙二醛含量的测定丙二醛含量的测定用mda试剂盒（南京建成）硫代巴比妥酸tba法进行测定，操作方法见说明书。对植物进行前处理后95℃水浴40 min，取出后流水冷却，4000 rpm离心10 min后，取上清液于532 nm处，用紫外分光光度计或者酶标仪测定其吸光度值。
65.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株丙二醛的含量，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪生理指标丙二醛含量的影响，结果见图9。
66.从图9可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪叶片中丙二醛含量均低于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）。在盐处理条件下，随着盐浓度的增加，各组别膜荚黄芪叶片的丙二醛含量随之增加，呈现上升的趋势。在各盐度处理下，接种am真菌的丙二醛含量均低于对照组且具有差异显著性（p＜0.05），对照组所含有的丙二醛含量明显高于各接种am真菌处理组，表明植物受到的盐处理程度远大于各接菌处理组。在25mm盐度下，接种r、f、rf三种处理组之间区别不大。在50mm盐度下，接种rf混合处理组相较于对照组丙二醛含量显著降低了56.81%，接种f、r处理组较于对照组波动不大。在100mm盐度下，接种rf处理组相较于对照组丙二醛含量降低仍旧最大，相较于对照组降低了61.45%。在盐处理对植物膜造成的损伤越来越大时，植物叶片的丙二酸含量也会越来越高，但是接种am真菌可有效地缓解膜荚黄芪叶片膜受损程度，进而减少植物产生的膜脂过氧化物，从而保护植物膜系统，表明，接种am真菌可以有效缓解了植株受到盐处理的伤害，其中接种rf处理组对于高盐度环境下更具有优势。
67.3.2.4膜荚黄芪植株过氧化物酶活性的测定过氧化物酶的测定用pod试剂盒（南京建成）愈创木酚法进行测定，操作方法见说明书。对植物进行前处理后3500 rpm离心10 min后，取上清液进行测定。将组织匀浆与试剂
混匀后，3500 rpm离心10 min，取上清液于420 nm处，用紫外分光光度计或者酶标仪测定其吸光度值。
68.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株过氧化物酶的活性，分别从4个浓度梯度（nacl：0mm、25mm、50mm、100mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪叶片中的过氧化物酶活性的影响，结果见图10。
69.从图10可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf处理组相比对照组膜荚黄芪叶片中过氧化物酶活性均高于对照组别，分别提高了18.07%、11.45%、9.42%。在盐处理条件下，随着盐浓度的增加，各组别膜荚黄芪过氧化物酶活性均出现了下降的趋势，可见盐处理抑制了膜荚黄芪叶片中的过氧化物酶的活性。在各盐处理水平上，接种am真菌组别的过氧化物酶活性均大于对照组，在25 mm盐度下，接种r处理组相较于对照组过氧化物酶活性显著增加，其次为接种f、rf处理组，三组较于对照组分别增加了19.51%、14.43%、8.54%。在50 mm盐度下，接种r、f、rf处理组相比对照组过氧化物酶活性分别增加了21.78%、18.22%、15.33%，其中接种r处理组别过氧化物酶活性显著高于其他组别。在100 mm盐度下，接种r、f、rf处理组均略高于对照组，其中接种r处理组较为显著，相比对照组过氧化物酶活性增加了21.59%。膜荚黄芪植株相对比未接种am真菌处理组接种am真菌处理组更有利于适应其在中度盐处理下生存，有助于提升植株在盐环境下的生存率，这表明，接种r、f、rf处理组相比接种r处理组在更有助于植物的生长，适应低中度盐渍化环境，可以很好的缓解其对膜荚黄芪过氧化物酶活性的抑制。
70.3.2.5膜荚黄芪植株过氧化氢酶含量的测定过氧化氢酶的测定用cat试剂盒（南京建成）可见光法进行测定，操作方法见说明书。对植物进行前处理后2500 rpm离心10 min，取上清液于405 nm处，用紫外分光光度计或者酶标仪测定其吸光度值。
71.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株过氧化氢酶的活性，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪叶片中的过氧化氢酶活性的影响，结果见图11。
72.从图11可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf处理组别膜荚黄芪叶片的过氧化氢酶活性均高于对照组别，分别提高了67.92%、51.07%、69.82%，其中接种r、rf处理组具有差异显著性（p＜0.05）。在盐处理条件下，随着盐浓度的增加，对照组与接种f处理组别膜荚黄芪叶片的过氧化氢酶活性均出现了下降的趋势，可见盐处理抑制了膜荚黄芪叶片的过氧化氢酶的活性。在25 mm盐度下，接种r、rf处理组相较于对照组过氧化氢酶活性均显著增加，分别增加了47.3%、60.28%，具有差异显著性（p＜0.05）。在50 mm盐度下，接种r、f、rf处理组相比对照组过氧化氢酶活性均有所提高。在100 mm盐度下，接种r、rf处理组均显著高于对照组，其过氧化氢酶活性分别增加了55.44%、77.41%。可见，在低度盐处理情况下接种r、rf两种处理组可以很好的提升膜荚黄芪叶片的过氧化氢酶活性，在中高度盐处理环境下可以提高植物对其的适应能力。
73.3.2.6膜荚黄芪植株超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶的测定用sod试剂盒（南京建成）wst-1法进行测定，操作方法见说明书。对植物进行前处理后3500 rpm离心10 min，取匀浆上清液，再用磷酸缓冲液稀释成不
同浓度进行预试验，之后在于450 nm处，用紫外分光光度计或者酶标仪测定其吸光度值。
74.准确测量膜荚黄芪在不同浓度的盐处理下接种不同am真菌植株超氧化物歧化酶的活性，分别从4个浓度梯度（nacl：0 mm、25 mm、50 mm、100 mm）的水平下考察未接种nm组，与接种r、f组和rf混合组别四个处理组对膜荚黄芪叶片中的超氧化物歧化酶活性的影响，结果见图12。
75.从图12可以看出，在非盐条件下，接种r、f、rf处理组组别膜荚黄芪叶片超氧化物歧化酶活性均高于对照组别，具有差异显著性（p＜0.05）。在盐处理条件下，随着盐浓度的增加，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪叶片的超氧化物歧化酶均活性均出现了上升的趋势，在各个盐浓度条件下，接种r、f、rf三种处理组膜荚黄芪叶片的超氧化物歧化酶均活性均高于对照组且达到显著性差异（p＜0.05）。在25 mm、50 mm、以及100 mm盐度下，接种r处理组别相比对照组超氧化物歧化酶均活性远远高于接种f、rf组别，在低中高盐处理下接种r处理组超氧化物歧化酶均活性较于对照组分别增加了73.43%、82.56%、96.09%，可见盐浓度较高的时候接种此菌种对于植物叶片超氧化物歧化酶均活性的提升尤为明显，接种am真菌有助于膜荚黄芪叶片超氧化物歧化酶活性的提升，从而提升膜荚黄芪清除氧自由基的能力。
76.试验结果3表明：丙二醛是盐处理中衡量植物质膜和渗透损伤的抗逆性指标，与作为渗透保护物质的脯氨酸在维持膜稳定性过程中同样重要。盐处理会破坏植物细胞内离子平衡、抑制细胞生理生化代谢过程、刺激细胞抗氧化酶活性、损坏细胞膜结构和功能、阻止细胞内外物质交换等。随着盐浓度的增加，对植物膜造成的损伤越来越大时，在盐处理膜荚黄芪叶片的丙二酸和脯氨酸含量也会越来越高，接种am真菌的膜荚黄芪植株的丙二醛和脯氨酸的含量相较于未接种 am 真菌植株上升的较为迟缓，说明接种am真菌可以有效地缓解膜荚黄芪叶片膜受损程度，从而减缓植株在逆境中受到的伤害，保护植物膜系统。盐碱胁迫和干旱胁迫均为自然界普遍存在的非生物胁迫现象，植物在逆境环境下会在机体内蓄积大量活性氧。3种主要抗氧化酶：超氧化物歧化酶（sod）、过氧化物酶（pod）和过氧化氢酶（cat）能够消除植物中自由基，盐处理下植物能够通过增强抗氧化酶活性增强耐盐性。接种am真菌组别的sod、pod、cat活性均大于对照组，接种am真菌的确有益于这三种抗氧化酶活性的提高，接种am真菌显著提高了叶片的sod活性，降低了cat活性，缓解盐处理引发的氧化胁迫和渗透胁迫对植株的伤害。
77.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，包括：种子处理：挑选大小一致饱满的膜荚黄芪种子，对种子进行消毒处理后，用水冲洗干净，浸泡备用；接种菌剂：将am真菌用苜蓿扩繁，并用以真菌菌丝、孢子、侵染根段以及含有根外菌丝体的根际土壤混合物为基础，进行菌剂接种，得到接种物；培养基质：将土壤经自然光风干后，加入细沙和土壤混合，过筛，取筛下物，装在密封的布袋中，用高压蒸汽灭菌；幼苗培育：将浸泡后的膜荚黄芪种子置于培养基质中，将接种物放置在膜荚黄芪种子下方1-3cm土层，浇水，进行培养出苗。2.根据权利要求1所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，采用浓度为0.5%-1.5% naclo溶液对种子表面进行消毒处理5 min
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15 min。3.根据权利要求1所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，细沙和土壤按照质量比1:1-3混合。4.根据权利要求1所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，所述am真菌包括：根内根孢囊霉和/或摩西管柄囊霉。5.根据权利要求4所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，所述接种物中am真菌孢子密度为20-30个/g。6.根据权利要求1所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，在幼苗培养步骤中，培养环境的相对湿度50%~70%，温度20℃~35℃。7.根据权利要求1所述的膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，所述接种物与培养基质的质量比为（0.5~2）
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：1。

技术总结
本发明公开了一种膜荚黄芪幼苗的培育方法，属于植物栽培技术领域。其包括：将膜荚黄芪种子消毒处理后用AM真菌接种培养在含土壤和细沙的培养基质中，浇水，进行培养出苗。本发明提供的膜荚黄芪幼苗的培育方法，通过AM真菌的菌丝能够扩大根的吸收面积、增强根的吸收能力，改善了植物对营养和水分的吸收，提高盐胁迫下植物的根系活力，增强了植物的抗逆性，维持了植物的生长发育，有效缓解了盐胁迫对植株伤害，提高膜荚黄芪抵抗盐处理的能力。提高膜荚黄芪抵抗盐处理的能力。提高膜荚黄芪抵抗盐处理的能力。


技术研发人员：郭娜 盛后财 接伟光 乔巍 张玥
受保护的技术使用者：江苏食品药品职业技术学院
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/7