肝细胞生长因子在制备炎性疼痛治疗药物中的作用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及肝细胞生长因子在制备炎性疼痛治疗药物中的作用。


背景技术：

2.肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，hgf）是一种重要的多功能蛋白，参与多种细胞的生理活动，具有调节血管生成、细胞存活、迁移以及抗炎等作用。有关研究报道，hgf亦可作为神经营养因子，在中枢和外周神经系统中发挥直接或是间接的调节作用。在外周神经的发育初期，hgf不仅能促进运动神经元的存活和轴突再生，还能诱导感觉神经元的突起延长。外周神经损伤后，损伤组织处内源性的hgf表达水平增高，与施万细胞中的c-met受体相互作用，诱导施万细胞的增值和迁移，激活erk信号通路，增加炎性因子gdnf和lif的表达。
3.外周神经损伤经常会发生炎性反应，从而引发强烈的疼痛感觉。根据文献报道发现，hgf参与了外周神经炎性反应过程，然而hgf在炎性疼痛中发挥着怎样的具体作用尚未得知。本技术选用辣椒素和福尔马林两种炎性疼痛模型，通过足底和鞘内两种途径给药，研究hgf在外周炎性疼痛中的作用和影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供肝细胞生长因子在制备炎性疼痛治疗药物中的作用。
5.本发明选用b6小鼠，通过足底注射辣椒素或福尔马林，构建两种炎性疼痛模型；首先选用drg组织提取总mrna，检测炎性过程中hgf mrna的表达变化；其次通过两种不同给药方式（足底给药、鞘内给药），检测hgf及pha（hgf阻断剂）在炎性疼痛中的作用。在炎性反应过程中，与对照组相比，hgf的mrna表达水平显著增高；与对照组相比，足底和鞘内给药hgf，都可以显著缓解炎性疼痛反应；使用pha阻断剂后，小鼠恢复疼痛感觉。hgf mrna表达水平显著上调；hgf给药可以有效缓解炎性疼痛反应；以上结果均证明hgf参与炎性疼痛过程并具有调节作用。
6.本发明通过实验证明，hgf参与炎性病理过程，具有缓解疼痛的作用；这为将来的炎症发生发展等相关研究提供理论依据。
附图说明
7.图1为炎性过程中hgf mrna水平的表达变化结果。其中：a为实验组和对照组中hgf mrna水平的表达变化；b为统计学分析，与对照组比较，**p＜0.01；***p＜0.001。
8.图2为 hgf 鞘内给药后抑制炎性疼痛反应的结果。其中：a为实验分组及鞘内给药、辣椒素造模及行为学检测时间（0-5min）的模式图；b为辣椒素模型小鼠实验中hgf对疼痛影响的统计分析；c为实验分组、福尔马林造模及行为学检测时间(0-1h)的模式图；d为福尔马林模型小鼠实验中hgf对疼痛影响的统计分析。n=5-6/组，**p＜0.01，ns表示无显著性
差异。
9.图3为hgf 足底给药抑制炎性疼痛反应的结果。其中：a为实验分组及足底给药、辣椒素造模及行为学检测时间（0-5min）的模式图；b为辣椒素模型小鼠实验中hgf对疼痛影响的统计分析；c为实验分组、福尔马林造模及行为学检测时间(0-45min) 的模式图；d为福尔马林模型小鼠实验中hgf对疼痛影响的统计分析。n=5-6/组，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns表示无显著性差异。
实施方式
10.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
11.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
12.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
13.hgf在神经损伤和神经性疼痛中具有重要作用，参与调节施旺细胞、胶质细胞、炎性因子等多种病理生理过程，发明人猜想hgf也许对炎症性疼痛也具有调节作用。根据假设，发明人开展了相关研究。首先，制作两种炎性疼痛模型（辣椒素诱导模型、福尔马林诱导模型），提取drg组织总rna，通过pcr技术检测炎性过程，hgf的表达变化。结果显示，与对照组相比，实验组hgf的mrna水平显著增加。接下来，通过实验分组（对照组，hgf，hgf+pha），足底给药和鞘内给药两种，分别检测给药后两种模型小鼠的行为学变化。结果显示，两种方式给与hgf后，都具有缓解炎性疼痛的显著效果。pha抑制剂的使用，阻断了hgf的作用，小鼠恢复疼痛反应。以上结果表明，hgf参与炎性病理过程，具有缓解疼痛的作用；可以为将来的炎症发生发展等相关研究提供理论依据。
实施例1
14.一、材料与方法1.1 主要试剂： hgf（origene，货号：tp315593），pha665752（bio-techne，货号：2693），辣椒素（上海生物，货号：2444-464），福尔马林（solarbio，货号：g2160），生理盐水。
15.1.2 实验动物：选用c57bl/6雄性小鼠（6-8w，20-25g），购买于南通大学医学院实验动物中心。小鼠自由进食水粮、12小时昼夜循环模式，室温24
°
c。适应环境3-5天后，构建动物模型，给药并行为学检测。
16.1.3 动物模型：选用小鼠左侧后肢，脚底中心位置皮下注射10μl辣椒素（1.6μg每只）或10μl福尔马林（使用浓度为2%）。每组实验动物为6-8只。
17.1.4 实验分组：对照组（生理盐水，10μl）、实验组1（hgf，1μg/只，10μl）、实验组 2（hgf 1μg+pha 16.5μg/只，10μl）。
18.1.5 给药方式：（1）足底给药：左侧后肢中心位置，浅层皮下注射10μl药物；（2）鞘内给药：去除小鼠背部毛发，捏住髂骨控制小鼠，定位l5-6棘突，选用微量胰岛素注射器，30
°
斜角缓慢进针并注射10μl药物，小鼠尾巴出现反射性甩尾即给药成功。
19.1.6 行为学实验：建立模型并给药，将动物放置在透明塑料盒内，观察小鼠抬足、舔足、甩足等疼痛反应累积时间。辣椒素模型组观察记录时间为5分钟，福尔马林模型组观
察记录为45分钟。
20.1.7 rt-pcr实验：分离小鼠drg组织（l5-6），用trizol法提取总rna后，逆转录成cdna，检测hgf mrna的表达变化，用β-actin做内参。
21.引物序列如下：hgf：f：5’ctggttccccttcaatagca3
’ꢀ
(seq_1)r：5’ctccagggctgacatttgat 3
’ꢀ
(seq_2)；gapdh：f：5
’ꢀ
tccatgacaactttggcattg 3
’ꢀ
(seq_3)r：5
’ꢀ
cagtcttctgggtg gcagtga 3
’ꢀ
(seq_4)。
22.1.8 统计学方法：数据用mean
±
sem表示，采用graphpad 8.0软件进行统计学分析并作图，组间比较采用单因素方差分析，差异结果表示如下：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
23.二、实验结果1、炎性过程中，hgf mrna水平的表达变化如图1所示，与对照组相比，炎性模型组hgf的mrna表达水平显著增高。hgf表达水平的改变，暗示其在炎性反应过程中具有特殊的作用。
24.2、hgf 鞘内给药显著抑制炎性疼痛反应在小鼠鞘内给药10μl（对照组，hgf组，hgf+pha组），5分钟后足底注射辣椒素或福尔马林，诱导炎性疼痛，记录小鼠的疼痛反应累积时间。行为学结果表明，hgf鞘内给药能有效缓解辣椒素（图2中a和b所示）和福尔马林诱导的炎性疼痛（图2中c和d所示）；pha（hgf阻断剂）可以阻断hgf发挥作用，小鼠再次感受到强烈的疼痛（图2中a-d所示）。
25.3、hgf 足底给药显著抑制炎性疼痛反应小鼠通过足底方式给药10μl（对照组，hgf组，hgf+pha组），5分钟后足底注射辣椒素或福尔马林，诱导炎性疼痛，记录小鼠的疼痛反应累积时间。行为学结果表明，hgf足底给药亦能有效缓解辣椒素（图3中a和b所示）和福尔马林诱导的炎性疼痛（图3中c和d所示）；pha（hgf阻断剂）可以阻断hgf发挥作用，小鼠再次感觉到疼痛（图3中a和d所述）。
26.以上结果表明，hgf参与炎性病理过程，具有缓解疼痛的作用；这可以为将来的炎症发生发展等相关研究提供理论依据。

技术特征：
1.用于检测肝细胞生长因子的物质在制备炎性疼痛诊断试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测肝细胞生长因子的物质为用于检测肝细胞生长因子的表达量的物质和/或用于检测肝细胞生长因子浓度的物质。3.一种用于诊断或辅助诊断炎性疼痛的诊断试剂，其特征在于：包括用于检测肝细胞生长因子的物质。4.肝细胞生长因子在筛选炎性疼痛治疗药物中的作用。5.肝细胞生长因子抑制剂在制备炎性疼痛治疗药物中的作用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肝细胞生长因子抑制剂为pha-665752。

技术总结
本发明公开了肝细胞生长因子在制备炎性疼痛治疗药物中的作用。本发明选用B6小鼠，通过足底注射辣椒素或福尔马林，构建了两种炎性疼痛模型；首先选用DRG组织提取总mRNA，检测炎性过程中HGF mRNA的表达变化；其次通过两种不同给药方式（足底给药、鞘内给药），检测HGF及PHA（HGF阻断剂）在炎性疼痛中的作用。实验结果表明，HGF参与炎性病理过程，具有缓解疼痛的作用；可以为将来的炎症发生发展等相关研究提供理论依据。理论依据。理论依据。


技术研发人员：潘静莹 杨日云 包璟崟 李嘉洁 吴泳江
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/10/7