一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法及装置

1.本发明涉及光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像的方法及装置。


背景技术：

2.近年来，突破光学衍射极限的超分辨显微成像技术取得了巨大进展，如光激活定位显微技术、随机光学重构显微技术、受激发射损耗和结构光照明显微技术等，部分荧光超分辨成像技术虽已实现商业化，但为满足未来更多应用需求，这些技术仍然面临一些挑战，例如，如何更好兼顾时空分辨率；如何简化光学系统复杂度；如何增强活细胞应用场景等。多种新型超分辨成像技术也相继出现，如：基于荧光随机涨落的超分辨成像、径向涨落超分辨成像、基于最少光子数的纳米尺度定位技术以及膨胀显微成像技术等，这些技术都有各自的优势和特色，但也存在图像重构伪影，样品选取、处理复杂等一种或多种问题。
3.综上，传统的超分辨显微成像技术，存在着系统复杂、图像重构伪影、时空分辨率难以兼顾、样品选取和处理复杂等问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像的方法及装置。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其操作步骤具体如下：
6.s1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜系统通过物镜获得激发光斑；
7.s2激发光斑在物镜出射端耦合进入微球透镜，由于微球透镜的高数值孔径特性，微球透镜另一侧会聚焦形成超越光学衍射极限的小光斑；
8.s3将具有高阶非线性效应的荧光探针样品置于载玻片表面，激光经微球透镜聚焦为极窄区域光场，并利用高阶非线性效应进一步压缩激发点扩散函数，再利用光电探测器记录激发样品的荧光信号，实现超高分辨成像。
9.优选的，所述微球透镜具备高数值孔径特性，从物镜出射的激发光斑经过微球透镜后可被聚焦成超越光学衍射极限的更小光斑，即微球透镜聚焦光斑的半高全宽可小于传统光学衍射极限(～λ/2)。同时，由于微球透镜能够将入射光场聚焦在极窄区域内，使得出射光场强度远高于入射光场强度，在荧光发光过程中，这等效于集中且提高了激发光的光场强度，高数值孔径特性也使得收集效率增加，可实现全光谱荧光信号增强。
10.优选的，所述荧光探针至少包括稀土掺杂上转换纳米颗粒，其中，通过连续型/飞秒型近红外光匹配激活离子tm
3+
的激发态吸收能量，由nd
3+
、yb
3+
作为敏化剂共掺杂的上转换纳米颗粒，可被波长为980nm、800nm以及730nm的激光激发产生非线性四/五光子过程，并
压缩激发点扩散函数，实现超分辨成像。
11.优选的，由于系统中新增的微球透镜具备高数值孔径特性，将入射光场聚焦成半高全宽小于经典衍射极限的光斑，而荧光探针本身的高阶非线性效应可压缩系统点扩散函数，内外部条件均超越衍射极限的结合可进一步提高分辨率，实现超高分辨成像。
12.优选的，所述荧光探针可选光子雪崩上转换纳米探针，利用近红外连续光激发上转换yb
3+
/pr
3+
或tm
3+
，产生光子雪崩超高阶非线性效应，实现多光子数≥20，极大程度地压缩点扩散函数，大大突破衍射极限，配合微球透镜聚焦效果，可实现亚λ/20(λ为激光波长)超分辨成像效果。
13.一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的装置，既可基于点扫描成像装置，也可基于宽场成像装置。点扫描成像装置包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块、微球透镜样品模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的近红外激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块，对样品不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的荧光信号。宽场成像装置包括激发光生成模块、宽场照射模块、微球透镜样品模块和光电探测模块。
14.优选的，所述点扫描成像装置的激发光生成模块包括近红外激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片、针孔滤波扩束系统、二分之一波片和偏振片；近红外激光器用于产生连续型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了敏化离子的基态吸收，激光束经过滤光片滤除激发波长以外的激光，再由针孔滤波扩束系统进行空间滤波并扩束，使激发光得以充满物镜入瞳，最后经过二分之一波片与偏振片配合调节其功率，所述针孔滤波扩束系统包括准直扩束镜和针孔滤波器。
15.优选的，所述点扫描成像装置的多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜用于控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，透镜与管镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜通过反射近红外激发光和透射样品荧光来分离激发光与荧光，激光束经过物镜聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块。
16.优选的，所述点扫描成像装置的微球透镜样品模块从下往上依次是pdms薄膜、微球透镜、具有高阶非线性效应的荧光探针样品和载玻片，所述微球透镜为高折射率介电材料。
17.优选的，所述点扫描成像装置的光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射荧光，经微球透镜有效收集以后回到物镜，荧光信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电倍增管(pmt)接收，每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超高分辨荧光图像。
18.优选的，所述宽场成像装置的激发光生成模块包括近红外激光器，以及沿激光束前进方向依次放置的滤光片、针孔滤波扩束系统、二分之一波片和偏振片；宽场照射模块包括沿激光束前进方向依次放置的高反低透二向色镜、管镜和物镜，管镜和物镜配合将激光束光斑缩小，并准直出射；微球透镜样品模块与点扫描成像装置中相同；光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，其中光电探测器为ccd相机或cmos相机。
19.在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
20.1、本方法使用具备高数值孔径特性的微球透镜聚焦激发光斑，集中缩小后激发稀土掺杂上转换荧光探针，利用稀土掺杂上转换荧光探针丰富的能级结构与多光子效应，配合微球透镜的超分辨成像效果，能够大大突破光学衍射极限，再通过光电探测器快速记录，可实时获得二维超高分辨图像。与传统超分辨显微成像技术相比，本发明既可用于点扫描成像装置，也可用于宽场成像装置，只需要在原显微成像系统的基础上加入一层具备高数值孔径特性的微球透镜，即可实时获得分辨率的提升，这有助于解决传统超分辨显微成像技术系统复杂、图像重构伪影、时空分辨率难以兼顾等问题；
21.2、本发明在微球透镜压缩了聚焦光斑的横向点扩散函数的基础上，利用上转换纳米探针高阶非线性效应，进一步压缩了点扩散函数，可实现超高分辨实时显微成像，具有系统简单、成像效果好、可直接成像的优点，基于上述方法，搭建由激发光生成模块、多光子显微扫描模块/宽场照射模块、微球透镜样品模块、光电探测模块组成的显微成像装置，实现在连续型近红外激光激发下，无光漂白、低光毒性、低复杂度、低成本、易用的实时超高分辨显微成像技术。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明的二维仿真的单个微球透镜超分辨聚焦图；
24.图2为实施例1中获得的单颗粒二维超分辨图；
25.图3为实施例1中所获两个单颗粒之间的距离分析图；
26.图4为实施例2中点扫描显微成像装置的结构示意图；
27.图5为实施例2中微球透镜样品模块的结构示意图；
28.图6为实施例3中宽场显微成像装置的结构示意图。
29.附图4标记说明：
30.1、近红外激光器；2、滤光片；3、针孔滤波扩束系统；4、二分之一波片；5、偏振片；6、扫描振镜；7、透镜；8、管镜；9、高反低透二向色镜；10、物镜；11、微球透镜样品模块；12、聚焦透镜；13、光电探测器。
31.附图6标记说明：
32.1、近红外激光器；2、滤光片；3、针孔滤波扩束系统；4、二分之一波片；5、偏振片；6、高反低透二向色镜；7、管镜；8、物镜；9、微球透镜样品模块；10、聚焦透镜；11、光电探测器。
具体实施方式
33.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
34.本发明提供了如图1-6所示的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像的方法，其操作步骤具体如下：
35.s1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜
准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜系统通过物镜10获得激发光斑，激光至少包括连续型近红外光波长：700nm-1100nm、飞秒型近红外光波长：700nm-1100nm、连续型可见光波长：400nm-700nm中的一种或多种；
36.s2激发光斑在物镜出射端耦合进入微球透镜，由于微球透镜的高数值孔径特性，微球透镜另一侧会聚焦形成超越光学衍射极限的小光斑；
37.s3将具有高阶非线性效应的荧光探针样品置于载玻片表面，激光经微球透镜聚焦为极窄区域光场，并利用高阶非线性效应进一步压缩激发点扩散函数，再利用光电探测器记录激发样品的荧光信号，实现超高分辨成像。
38.微球透镜具备高数值孔径特性，从物镜出射的激发光斑经过微球透镜后可被聚焦成超越光学衍射极限的更小光斑，即微球透镜聚焦光斑的半高全宽可小于传统光学衍射极限(～λ/2)。同时，由于微球透镜能够将入射光场聚焦在极窄区域内，使得出射光场强度远高于入射光场强度，在荧光发光过程中，这等效于集中且提高了激发光的光场强度，高数值孔径特性也使得收集效率增加，可实现全光谱荧光信号增强。
39.荧光探针至少包括稀土掺杂上转换纳米颗粒，其中，通过连续型/飞秒型近红外光匹配激活离子tm
3+
的激发态吸收能量，由nd
3+
、yb
3+
作为敏化剂共掺杂的上转换纳米颗粒，可被波长为980nm、800nm以及730nm的激光激发产生非线性四/五光子过程，并压缩激发点扩散函数，实现超分辨成像。荧光探针也可以是包括量子点或有机染料中的一种，当荧光探针为量子点和有机染料时，由连续型可见光波长范围400nm-700nm激发，产生单光子荧光辐射，利用微球透镜突破衍射极限，实现超分辨成像100nm-200nm。
40.由于系统中新增的微球透镜具备高数值孔径特性，将入射光场聚焦成半高全宽小于经典衍射极限的光斑，而荧光探针本身的高阶非线性效应可压缩系统点扩散函数，内外部条件均超越衍射极限的结合可进一步提高分辨率，实现超高分辨成像。
41.荧光探针可选光子雪崩上转换纳米探针，利用近红外连续光激发上转换yb
3+
/pr
3+
或tm
3+
，产生光子雪崩超高阶非线性效应，实现多光子数≥20，极大程度地压缩点扩散函数，大大突破衍射极限，配合微球透镜聚焦效果，可实现亚λ/20(λ为激光波长)超分辨成像效果。
42.一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的装置，既可基于点扫描成像装置，也可基于宽场成像装置。点扫描成像装置包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块、微球透镜样品模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的近红外激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块，对样品不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的荧光信号。宽场成像装置包括激发光生成模块、宽场照射模块、微球透镜样品模块和光电探测模块。
43.点扫描成像装置的激发光生成模块包括近红外激光器1，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片2、针孔滤波扩束系统3、二分之一波片4和偏振片5；近红外激光器1用于产生连续型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了敏化离子的基态吸收，激光束经过滤光片2滤除激发波长以外的激光，再由针孔滤波扩束系统3进行空间滤波并扩束，使激发光得以充满物镜10入瞳，最后经过二分之一波片4与偏振片5配合调节其功率，针孔滤波扩束系统3包括准直扩束镜和针孔滤波器。
44.点扫描成像装置的多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描
振镜6、扫描透镜7、管镜8、高反低透二向色镜9和物镜10；扫描振镜6用于控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜7与管镜8对经过扫描振镜6出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜9通过反射近红外激发光和透射样品荧光来分离激发光与荧光，激光束经过物镜10聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块11。
45.点扫描成像装置的微球透镜样品模块11从下往上依次是pdms薄膜、微球透镜、具有高阶非线性效应的荧光探针样品和载玻片，微球透镜为高折射率介电材料，如聚苯乙烯n～1.59、熔融石英n～1.46、二氧化钛n～2.1、钛酸钡n～1.9-2.2等，微球透镜直径多在几微米至几十微米之间，少数微球透镜直径可达几百微米，为兼顾成像分辨率和成像视野需对应选择不同材料和尺寸的微球透镜。根据二维仿真结果显示，当激发波长为980nm的平面波经过直径为2.5μm，折射率为2.2的钛酸钡微球时，聚焦光斑的半高全宽为251.5nm，约为～λ/4。
46.点扫描成像装置的光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜12和光电倍增管13，聚焦透镜12和光电倍增管13设置在物镜10收集荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射荧光，经微球透镜有效收集以后回到物镜10，荧光信号经过高反低透二向色镜9与聚焦透镜12，由光电倍增管13接收，光电倍增管13每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜6旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超高分辨荧光图像。
47.宽场成像装置的激发光生成模块包括近红外激光器1，以及沿激光束前进方向依次放置的滤光片2、针孔滤波扩束系统3、二分之一波片4和偏振片5；宽场照射模块包括沿激光束前进方向依次放置的高反低透二向色镜9、管镜6和物镜7，管镜6和物镜7配合将激光束光斑缩小，并准直出射；微球透镜样品模块8与点扫描成像装置中相同；光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜10和光电探测器11，其中光电探测器11为ccd相机或cmos相机。
48.实施例1
49.如图2-3所示，s1激光器1发出一束波长为980nm的连续型近红外激光，该激光经过滤光片2、准直扩束镜和针孔滤波器3等滤波处理与准直扩束后，获得聚焦的高斯型光斑；
50.s2将稀土掺杂上转换纳米颗粒稀释并旋涂在载玻片上获取单颗粒样品分布，以表征本发明的超分辨成像效果，聚焦的高斯型光斑耦合进入微球透镜进一步聚焦，利用光斑更小、聚焦强度更大的激发光激发组分为nayf4:18％yb10％tm@nayf4的稀土掺杂上转换纳米探针，由于传统激发光斑尺寸受到物镜衍射极限的限制，其激发光斑大小约为λ/1.6，但基于微球的高数值孔径特性和样品的非线性效应，利用聚焦的更小光斑对样品进行xy方向逐点扫描，光电倍增管13检测荧光信号，仍然得到了二维超分辨荧光图像，如图2所示，图3以点扩散函数的形式表征了该实施例的二维分辨率，其中，可以分辨横向约λ/3.5的间距。
51.实施例2
52.如图4-5所示，近红外激光器1产生高斯型激光输出，滤光片2滤除激光中其他波段的杂散光，准直扩束镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率，同时焦点处放置针孔滤波器，滤除高频杂散光，二分之一波片4安装在可旋转安装座上，搭配线偏振片5用于调节激光束的功率；扫描振镜6控制激光束的光路偏转实现对样品的二维扫描，高反低透二向色镜9对激光束进行反射，透镜7和管镜8对扫描振镜6出射光束进行聚焦和准直，使激光束在扫描过程中依然匹配显微物镜10的入瞳大小，最后由物镜10将激光聚焦到微球透镜样品模块
11；微球透镜是折射率为2.2的钛酸钡小球，直径5～22μm；pdms薄膜折射率为1.4，完全覆盖微球透镜，制备过程首先将稀土掺杂上转换荧光探针、量子点或有机染料标记的样品旋涂在载玻片上，再将嵌有微球透镜的pdms薄膜贴到载玻片上，最后将整体倒扣正对空气物镜10；聚焦透镜12和光电倍增管13设置在沿物镜10收集的荧光的前进方向上，光电倍增管13与外部计算机连接，在光电倍增管13接收完一次检测信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机控制扫描振镜6旋转，利用聚焦光斑逐点扫描样品的方式得到一幅二维激光扫描超分辨图像。
53.实施例3
54.如图6所示，近红外激光器1产生高斯型激光输出，滤光片2滤除激光中其他波段的杂散光，准直扩束镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率，同时焦点处放置针孔滤波器，滤除高频杂散光，二分之一波片4安装在可旋转安装座上，搭配线偏振片5用于调节激光束的功率；高反低透二向色镜9对激光束进行反射，激光束通过管镜6聚焦于物镜7后焦平面，并经由物镜7准直到达微球透镜样品模块8；微球透镜是折射率为2.2的钛酸钡小球，直径5～22μm，可制备成有序的微球阵列进行大视野成像；pdms薄膜折射率为1.4，完全覆盖微球透镜阵列，制备过程首先将稀土掺杂上转换荧光探针、量子点或有机染料标记的样品旋涂在载玻片上，再将嵌有微球透镜阵列的pdms薄膜贴到载玻片上，最后将整体倒扣正对空气物镜7；聚焦透镜10和scmos相机11依次设置在沿物镜7收集荧光的前进方向上，通过scmos相机采集得到一幅二维超分辨图像。
55.以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

技术特征：
1.一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其特征和操作步骤具体如下：s1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜系统通过物镜获得激发光斑；s2激发光斑在物镜出射端耦合进入微球透镜，由于微球透镜的高数值孔径特性，微球透镜另一侧会聚焦形成超越光学衍射极限的极小光斑；s3将具有高阶非线性效应的荧光探针样品置于载玻片表面，激光经微球透镜聚焦为极窄区域光场，并利用高阶非线性效应进一步压缩激发点扩散函数，再利用光电探测器记录激发样品的荧光信号，实现超高分辨率显微成像。2.根据权利要求1所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其特征在于：所述微球透镜具备高数值孔径特性，从物镜出射的激发光斑经过微球透镜后可被聚焦成超越光学衍射极限的更小光斑，即微球透镜聚焦光斑的半高全宽可小于传统光学衍射极限(～λ/2)。同时，由于微球透镜能够将入射光场聚焦在极窄区域内，使得出射光场强度远高于入射光场强度，在荧光发光过程中，这等效于集中且提高了激发光的光场强度，高数值孔径特性也使得收集效率增加，可实现全光谱荧光信号增强。3.根据权利要求1所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其特征在于：所述荧光探针至少包括稀土掺杂上转换纳米颗粒，其中，通过连续型/飞秒型近红外光匹配激活离子tm
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的激发态吸收能量，由nd
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、yb
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作为敏化剂共掺杂的上转换纳米颗粒，可被波长为980nm、800nm以及730nm的激光激发产生非线性四/五光子过程，并基于非线性压缩激发点扩散函数，实现超分辨成像。4.根据权利要求1所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其特征在于：由于系统中新增的微球透镜具备高数值孔径特性，将入射光场聚焦成半高全宽小于经典衍射极限的光斑，而荧光探针本身的高阶非线性效应可压缩系统点扩散函数，内外部条件均超越衍射极限的结合可进一步提高分辨率，实现超高分辨成像。5.根据权利要求1所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其特征在于：所述荧光探针可选光子雪崩上转换纳米探针，利用近红外连续光激发上转换yb
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或tm
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，产生光子雪崩超高阶非线性效应，实现多光子数≥20，极大程度地压缩点扩散函数，大大突破衍射极限，配合微球透镜聚焦效果，可实现亚λ/20(λ为激光波长)超分辨成像效果。6.一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的装置，其特征在于：既可基于点扫描成像装置，也可基于宽场成像装置。点扫描成像装置包括激发光生成模块、多光子显微扫描模块、微球透镜样品模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成作为激发光的近红外激光束，激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块，对样品不同区域进行扫描，所述光电探测模块用于检测上述样品被扫描激发的荧光信号。宽场成像装置包括激发光生成模块、宽场照射模块、微球透镜样品模块和光电探测模块。7.根据权利要求6所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的点扫描成像装置，其特征在于：所述激发光生成模块包括近红外激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的滤光片、针孔滤波扩束系统、二分之一波片和偏振片；近红外激
光器用于产生连续/脉冲型近红外稳态激光束输出，该光束的光子能量匹配了敏化离子的基态吸收，激光束经过滤光片滤除激发波长以外的激光，再由针孔滤波扩束系统进行空间滤波并扩束，使激发光得以充满物镜入瞳，最后经过二分之一波片与偏振片配合调节其功率，所述针孔滤波扩束系统包括准直扩束镜和针孔滤波器。8.根据权利要求6所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的点扫描成像装置，其特征在于：所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜用于控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，透镜与管镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜通过反射近红外激发光和透射样品荧光来分离激发光与荧光，激光束经过物镜聚焦到荧光探针标记的微球透镜样品模块。9.根据权利要求6所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的点扫描成像装置，其特征在于：所述微球透镜样品模块从下往上依次是pdms薄膜、微球透镜、具有高阶非线性效应的荧光探针样品和载玻片，所述微球透镜为高折射率介电材料。10.根据权利要求6所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的点扫描成像装置，其特征在于：所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集荧光的前进方向上，样品在近红外激光的激发下沿各个方向上发射荧光，经微球透镜有效收集以后回到物镜，荧光信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电倍增管(pmt)接收，每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超高分辨荧光图像。11.根据权利要求6所述的一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法的宽场成像装置，其特征在于：所述激发光生成模块包括近红外激光器，以及沿激光束前进方向依次放置的滤光片、针孔滤波扩束系统、二分之一波片和偏振片；所述宽场照射模块包括沿激光束前进方向依次放置的高反低透二向色镜、管镜和物镜，管镜和物镜配合将激光束光斑缩小，并准直出射；所述微球透镜样品模块与点扫描成像装置中相同；所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，其中光电探测器为emccd相机或cmos相机。

技术总结
本发明公开了一种基于高阶非线性荧光的微球透镜超高分辨成像方法，其操作步骤具体如下：S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入显微镜系统通过物镜获得激发光斑；S2激发光斑在物镜出射端耦合进入微球透镜，由于微球透镜的高数值孔径特性，微球透镜另一侧会聚焦形成超越光学衍射极限的小光斑；本发明在微球透镜压缩了激发光斑的横向点扩散函数的基础上，利用上转换纳米探针高阶非线性效应，进一步压缩点扩散函数，可实现超高分辨显微成像，具有系统简单、成像效果好、无需图像重构的优点。无需图像重构的优点。无需图像重构的优点。


技术研发人员：詹求强 邱雪 潘彬雄 王保举
受保护的技术使用者：华南师范大学
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/7