一种抗菌羧基化胶原基角膜修复材料及其制备方法

1.本发明属于组织工程人工角膜技术领域，特别涉及一种抗菌羧基化胶原基角膜修复材料及其制备方法。


背景技术：

2.影响数百万盲人的一个重要临床问题是角膜疾病，角膜移植手术是治疗角膜失明的有效方法之一。然而，由于严重缺乏高质量的异体角膜组织，限制了其临床上的应用。因此，国内外的研究人员专注于利用天然生物材料开发角膜组织替代品。其中，胶原蛋白是结缔组织的主要承重成分，具有良好的理化性能和生物相容性。因此，它作为一种角膜组织工程的支架材料得到了广泛的研究。
3.虽然胶原基支架在替代病理性角膜组织方面有许多优势，但其在应用过程中往往会产生术中或术后的细菌感染，甚至直接导致移植或修复失败。目前，为了降低胶原基生物材料产生细菌感染风险，国内外研究人员尝试通过物理或化学方法提升胶原基生物材料的抗菌性能，例如添加抗生素、抗菌无机纳米颗粒、聚阳离子抗菌剂等抗菌成分等。然而，如何在不显著影响胶原基角膜修复材料良好的光学性能、卓越的生物相容性和低免疫原性的前提下实现高效抗菌功能化，对提高其临床应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种新型的高效抗菌羧基化胶原基角膜修复材料及其制备方法。本研究利用柠檬酸对胶原膜进行羧基化改性，增加其表面的能够与氨基糖苷类抗生素产生酰胺键合反应的羧基官能团，再通过化学交联增加其表面负载氨基糖苷类抗生素的量，从而制备了一种高效抗菌的羧基化胶原基薄膜。其中，氨基糖苷类抗生素通过抑制细菌蛋白合成，对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧菌均有有效的抗菌作用。本研究中，利用1-乙基-3-（3-3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（edc）和正羟基琥珀酰亚胺（nhs）作为交联剂将氨基糖苷类抗生素接枝到羧基化胶原膜表面。通过这种方式，我们希望在不改变胶原基薄膜良好的理化的性能和卓越的生物相容性的基础上实现胶原基生物材料高效抗菌功能化。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：一种高效抗菌羧基化胶原基角膜修复材料，包括以下步骤：（1）配制胶原蛋白溶液，分别以碳化二亚胺和n-羟基丁二酰为交联剂和催化剂，充分搅拌发生交联反应，将交联后的胶原溶液浇铸到模具中，风干成胶原膜(col)；（2）配制柠檬酸溶液，通过柠檬酸分子对步骤（1）获得的胶原膜进行表面化学修饰，获得羧基化胶原膜；（3）配制氨基糖苷类抗生素溶液，将步骤（2）获得的羧基化胶原膜浸泡在氨基糖苷类抗生素溶液中，并加入碳化二亚胺和n-羟基丁二酰分别作为交联剂和催化剂，使得氨基糖苷类抗生素分子与羧基化胶原蛋白分子发生化学交联，形成酰胺键结合，得氨基糖苷类
china)。
15.实施例1以胶原蛋白、氨基糖苷类抗生素和柠檬酸等作为原料，制备一种新型的含庆大霉素的高效抗菌羧基化胶原基角膜修复材料。这种高效胶原基抗菌材料的制备步骤如下：（1）将3.5g胶原蛋白溶于0.1mol/ml hcl中定量至500ml，配制浓度为7mg/ml的胶原溶液，然后根据胶原蛋白的质量向胶原溶液中按照m
col
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的比例加入583mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（edc）和583mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），充分搅拌5小时发生交联反应，将交联后的胶原溶液分装浇铸到35ml的模具中风干成膜(col)；（2）配制2 mg/ml的柠檬酸溶液130ml；（3）将步骤(1)中风干后的col薄膜0.2508g浸泡至步骤(2)的柠檬酸溶液中充分吸收，风干成膜(colca)；（4）配置15mg/ml的庆大霉素（gm）溶液130ml；（5）在常温下，按照m
colca+mgm
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的质量比在步骤（4）中得到的庆大霉素溶液中加入edc和nhs，使colca薄膜在其搅拌充分反应5小时；（6）将步骤（5）中交联所得的colca-gm薄膜用去离子水冲洗三次，风干成膜，即得到colca-gm薄膜。测试薄膜的吸水率和拉伸强度，结果见表1。测试薄膜的庆大霉素药物负载量，结果见表2。
16.实施例2本实施例与实施例1的区别是将4g胶原蛋白溶于0.1mol/ml hcl中定量至500ml，配置浓度为8mg/ml的胶原溶液500 ml，其余操作同实施例1。测试薄膜的吸水率和拉伸强度，结果见表1。测试薄膜的庆大霉素药物负载量，结果见表2。
17.对实施例2制备的新型的含庆大霉素的高效抗菌羧基化胶原基薄膜的透光率进行评价。从图1中可以看出，colca-gm薄膜的透明度与col薄膜略有不同，前者略高于后者。随着波长的增加，薄膜的透光率增加到最大值（90%以上）。两种薄膜的透光率在可见光范围内趋于恒定。
18.图2为实施例2制备的新型的含庆大霉素的抗菌羧基化胶原基角膜的形貌图：从图中可以看出，该薄膜呈透明色，表面光滑均匀，没有明显的相分离。
19.图3为在本实施例2制备的新型的含庆大霉素的抗菌羧基化胶原基角膜上培养人的角膜上皮细胞48小时后的显微镜照片（左图）和荧光染色照片（右图）：在材料表面接种48小时后，细胞完全覆盖了colca-gm膜的整个表面。为了观察hcecs在细胞膜表面的增殖和粘附情况，我们采用免疫荧光染色法观察细胞的生长情况。用蓝色荧光观察细胞核，用红色荧光观察细胞骨架。蓝色荧光呈圆形，红色荧光为纺锤形，说明细胞已粘附在细胞膜表面，且生长良好。
20.实施例3本实施例与实施例1的区别是将4.5g溶于0.1mol/ml hcl中定量至500ml，配置浓度为9mg/ml的胶原溶液，其余操作同实施例1。测试薄膜的吸水率和拉伸强度，结果见表1。测试薄膜的庆大霉素药物负载量，结果见表2。
21.吸水率、拉伸强度的测试方法分别如下：（1）吸水率的测试方法具体为：将干燥样品剪成20 mm
×
20 mm的正方形薄膜，用天
平称量薄膜的重量，记为mo，将样品薄膜置于pbs（10 mmol/l，ph=7.4）溶液中，24h后快速用滤纸吸去表面的水分，称重记录样品质量为mw。每个样品平行做五次实验，求其平均值，样品吸水率按照公式（ⅰ）计算：x=（mw-mo）/ mw
×
100%（公式ⅰ）其中，mo为干燥敷料的重量（g）；mw为吸水后薄膜的重量（g）；x为薄膜的饱和吸水率（%）；（2）拉伸强度：参照医药行业标准yy/t 0471.4-2004的测试方法进行，采用电子拉力试验机测试薄膜的拉伸强度。具体步骤如下：将样品裁剪成长为90 mm，宽为25 mm的长条形样品。用游标卡尺测量其厚度并记录。在恒温恒湿条件（温度为25℃，相对湿度为70%）下进行拉伸，测试时试样的夹持距离为50 mm，拉伸速率为300 mm/min。按照试验方法规定设置程序，进行检测，每个试验测试5组有效数据，取其平均值。敷料的拉伸强度（ts）按照以下公式计算：ts=f
max
/(l
×
w)（公式ⅱ）其中，ts是拉伸强度（mpa），f
max
是样品断裂时所承受的最大拉力（n），l是敷料的厚度（mm），w是敷料的宽度（mm）。
22.表1实施例1-3制备薄膜的吸水率、拉伸强度
23.从表1可看出本发明所制得的抗菌羧基化胶原基材料的饱和吸水率均在90%以上，具有良好的吸水性能。这种高的吸水率主要是由于胶原蛋白，庆大霉素和柠檬酸的分子包含许多氨基和羧基等亲水基团。结合胶原基材料在角膜的应用上来看，良好的吸水性可以为细胞生长和粘附在其表面上提供适宜的环境。同时，与col薄膜和colca薄膜相比，本发明所制得抗菌羧基化胶原基薄膜的拉伸强度均在9mpa，力学性能得到了提升。这归因于柠檬酸分子的修饰和庆大霉素分子的引入，使分子之间的相互作用更强，分子运动的空间位阻效应更大，从而提升其拉伸强度。
24.测试薄膜的庆大霉素药物负载量，结果见表2。薄膜的庆大霉素药物负载量的测试方法分别如下：将样品薄膜置于15mg/ml的庆大霉素溶液中，按照m
col
+m
gm
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的比例在15mg/ml的庆大霉素溶液中加入edc和nhs，并且取3 ml的溶液作为母液1。然后,搅拌5小
时使其充分交联，并且在交联完成后取3 ml的溶液作为液体2。最后，通过紫外分光光度计法测量母液1，液体2的吸光度分别为x1,x2,计算薄膜中庆大霉素的负载量。药物负载量公式如下：x=（x
1-x2)/x1×
100%（公式ⅲ）其中，x1为母液1吸光度值；x2为液体2的吸光度值；x为薄膜的药物负载率（%）。
25.表2实施例1-3制备薄膜的庆大霉素的药物负载量
26.从表2可看出本发明所制得的羧基化胶原基材料的庆大霉素药物负载量显著高于对照组。这主要是因为柠檬酸对胶原膜的羧基化修饰，增加了胶原膜表面可以与庆大霉素反应的羧基官能团的数量，从而提升材料的庆大霉素的药物负载量，并且提升其抗菌性能。
27.实施例4以胶原蛋白、妥布霉素和柠檬酸等作为原料，制备一种新型的含妥布霉素的高效抗菌羧基化胶原基角膜修复材料。这种高效胶原基抗菌材料的制备步骤如下：（1）配制浓度为8mg/ml的胶原蛋白溶液500ml。然后向胶原溶液中按照m
col
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的比例加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），充分搅拌5小时发生交联反应，将交联后的胶原溶液分装浇铸到35ml模具中，风干成膜(col)；（2）配置2mg/ml的柠檬酸溶液130 ml；（3）将步骤(1)中风干后的col薄膜浸泡至步骤(2)中2mg / ml的柠檬酸溶液中充分吸收，风干成膜(colca)（4）配置15mg/ml的妥布霉素溶液130 ml；（5）在常温下，按照m
colca
+m
tob
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的比例在步骤（4）中得到的妥布霉素溶液中加入edc和nhs，使colca薄膜在其搅拌充分反应5小时；去离子水冲洗三次，风干成膜，即得到colca-tob薄膜。
28.（6）在常温下，将步骤（1）的col膜直接负载tob，按照m
col
+m
tob
：m
edc
：m
nhs
=6：1：1的比例在步骤（4）中得到的妥布霉素溶液中加入edc和nhs，使col薄膜在其搅拌充分反应5小时；去离子水冲洗三次，风干成膜，即得到col-tob薄膜。
29.图4为本实施例制备的羧基化胶原膜负载妥布霉素（右图），胶原膜负载妥布霉素（中间图），与胶原膜（左图）的抗大肠杆菌性能对比：从图中可以看出，与胶原膜相比，经柠檬酸羧基化改性后负载妥布霉素的胶原基薄膜的抗菌性能得到了显著的提高。
30.图5为本实施例制备的羧基化胶原膜负载妥布霉素（右图），胶原膜负载妥布霉素（中间图），与胶原膜（左图）的抗金黄色葡萄球菌性能对比：从图中可以看出，与胶原膜相比，经柠檬酸羧基化改性后负载妥布霉素的胶原基薄膜的抗菌性能得到了显著的提高。

技术特征：
1.一种抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制胶原蛋白溶液，分别以碳化二亚胺和n-羟基丁二酰为交联剂和催化剂，充分搅拌发生交联反应，将交联后的胶原溶液浇铸到模具中，风干成胶原膜；（2）配制柠檬酸溶液，通过柠檬酸分子对步骤（1）获得的胶原膜进行表面化学修饰，获得羧基化胶原膜；（3）配制氨基糖苷类抗生素溶液，将步骤（2）获得的羧基化胶原膜浸泡在氨基糖苷类抗生素溶液中，并加入碳化二亚胺和n-羟基丁二酰分别作为交联剂和催化剂，使得氨基糖苷类抗生素分子与羧基化胶原蛋白分子发生化学交联，形成酰胺键结合，得氨基糖苷类抗生素-羧基化胶原膜交联体系；（4）将步骤（3）得到的氨基糖苷类抗生素-羧基化胶原膜交联体系置于模具中自然风干成膜，即得含氨基糖苷类抗生素的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料。2.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中胶原蛋白溶液的浓度为7~10mg/ml。3.根据权利要求2所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白为牛跟腱i型胶原蛋白。4.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中胶原蛋白、碳化二亚胺、n-羟基丁二酰的质量比为6.0~6.5：1~1.2：1~1.2。5.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中柠檬酸与胶原膜的质量比为1-1.5：1。6.根据权利要求5所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的柠檬酸溶液的浓度为2mg/ml。7.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中氨基糖苷类抗生素溶液的浓度为15mg/ml。8.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述氨基糖苷类抗生素选自链霉素，庆大霉素，妥布霉素，大观霉素，阿米卡星，奈替米星，依替米星，异帕米星中的一种或几种。9.根据权利要求1所述的抗菌羧基化胶原基角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中羧基化胶原膜、碳化二亚胺、n-羟基丁二酰的质量比为6.0~6.5：1~1.2：1~1.2。10.一种抗菌羧基化胶原基角膜修复材料，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的方法制得。

技术总结
本发明属于组织工程人工角膜技术领域，具体涉及一种抗菌羧基化胶原基角膜修复材料。本发明利用柠檬酸对胶原膜进行羧基化改性，增加其表面的能够与氨基糖苷类抗生素产生酰胺键合反应的羧基官能团，再通过化学交联增加其表面负载氨基糖苷类抗生素的量，从而制备了一种高效抗菌的羧基化胶原基薄膜。本发明利用1-乙基-3-（3-3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和正羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为交联剂将氨基糖苷类抗生素接枝到羧基化胶原膜表面，在不改变胶原基薄膜良好的理化的性能和卓越的生物相容性的基础上实现胶原基生物材料高效抗菌功能化。化。


技术研发人员：刘杨 刘慧玉
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/7