白及或其药物制剂的UPLC特征图谱的构建方法及应用与流程

白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于药物质量控制领域，涉及一种uplc特征图谱的构建方法及其应用，尤其涉及一种白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法及应用。


背景技术：

2.白及为兰科植物白及bletilla striata(thunb.)reichb.f.的干燥块茎，味苦、甘、涩，性微寒，归肺、肝、胃经，具收敛止血，消肿生肌之功效，现代临床广泛用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肛肠疾病、妇科肌瘤、肿瘤栓塞及用于前列腺手术等。白及的化学成分主要有联苄类、二氢菲类、联菲类、联菲醚类、菲并吡喃类、联苄葡萄糖苷类、甾体、三萜等(任华忠，何毓敏，杨丽.白及化学成分及其药理活性研究进展[j].亚太传统医药，2009，5(2)：134-140)。
[0003]
现代药理作用与临床应用研究表明，白及在止血(wang w，meng h.cytotoxic，anti-inflammatory and hemostatic spirostane-steroidal saponins from the ethanol extract of the roots of bletilla striata[j].fitoterapia，2015，101：12-18)、抗菌(guo jj，dai bl，chen np，et al.the anti-staphylococcus aureus activity of the phenanthrene fraction from fibrous roots of bletilla striata [j].bmc complement altern med，2016，16(1)：491)、抗炎(吴梅，田守征，郑永仁，等.白及苦味成分的分离、鉴定及抗炎药效学初研[j].时珍国医国药，2019，30(2)：372-374)、抗肿瘤(suna，liu j，pang s，et al.two novel phenanthraquinones with anti-cancer activity isolated from bletilla striata[j].bioorg med chem-lett，2016，26(9)：2375-2379)、促进伤口愈合(wangc，sun j，luoy，et al.apolysaccharideisolatedfrom the medicinal herb bletilla striata induces endothelial cells proliferation and vascular endothelial growth factor expression in vitro[j].biotechnology letters，2006，28(8)：539-543)等方面都有较好的疗效。
[0004]
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，是饮片改革的一种新形式，相比于传统饮片汤剂具有方便携带、使用简单的特性，能够满足现代快节奏工作与生活的要求。白及配方颗粒是白及饮片经过现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成，保留了白及的临床效果，同时兼顾了使用的便携性。但与药材和饮片相比，白及配方颗粒已失去固有的形态，难以通过简单的性状评价其优劣。目前市场上流通的白及颗粒质量参差不齐，因此制定能够全面、稳定、快速控制白及配方颗粒质量的标准方法显得尤为重要。
[0005]
白及现行法定质量标准收录于《中国药典》2020年版一部，主要由性状、显微鉴别、薄层鉴别、水分、总灰分、二氧化硫残留量检查项和含量测定(1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯)组成。这些检测项目在一定程度上能反映白及药材的质量，但由于中药有效成分多样性及复杂性，单一成分含量测定不足以说明中药材的质量，缺乏专属性，质量控制效果有限。
[0006]
中药特征图谱既能全面反映中药个体之间的共性，亦能反映中药种群之间的唯一
性。运用中药特征图谱控制中药质量，比目前沿用的方法提供的信息更为全面、丰富，可以为白及质量控制提供全面的质量控制手段。
[0007]
关于白及药材特征图谱或指纹图谱的研究较多，但检测时间多数超过45min。姚玥等人建立了不同产地白及药材的hplc指纹图谱，以全国11省共60份白及属植物作为样本，确定了8个药材指纹图谱共有峰，其指纹图谱相似度在0.623～0.994之间(姚玥，夏琳颖，黄桑琦，沈徐婷，蒋福升，丁志山，基于uplc指纹图谱结合薄层色谱的白及药材质量标准讨论[j].药物资讯，2020，9(3)：109-116)。周海婷等人将militarine作为特征峰，建立了野生和栽培的白及药材的特征图谱，野生药材相似度均达0.94以上，栽培药材相似度达到0.90以上，野生药材与栽培药材比较相似度差异较大(周海婷，陈志敏，李文兵，权亮，张希，胡昌江，赵永峰.野生与栽培白及hplc指纹图谱建立及天麻素与militarine含量测定[j].中药材，2018，41(11)：2527-2533)。郑江萍等提取9个指纹图谱共有峰建立了白及的高效液相指纹图谱，通过相似度评价软件对不同产地的白及进行比较和归类，又通过聚类分析比较各产地之间的差异。发现湖北竹溪和湖北竹山的白及样品中militarine含量较高。通过主成分分析对白及的hplc信号进行特征提取，建立特征信号峰与白及质量间的对应关系，为科学评价与有效控制白及药材质量提供了新方法(郑江萍，雷震，黄良永.白及药材hplc指纹图谱研究[j].中国药师，2013，16(11)：1611-1614.)。
[0008]
关于白及配方颗粒的质量研究主要集中在薄层鉴别和含量测定上，通过薄层色谱，测定白及多糖、肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯等的含量对白及配方颗粒、药材进行质量评价，存在无法整体、全面地体现白及配方颗粒质量的问题。在特征图谱或指纹图谱研究方面，目前仅有一篇文献对白及配方颗粒展开了指纹图谱研究。张蕾建立了白及饮片指纹图谱共有模式，标定了13个共有指纹峰，各批次样品平均相似度大于0.902。依据此方法对10批白及配方颗粒(6个厂家)不同批次白及配方颗粒进行hplc指纹图谱研究，发现其共有指纹峰数量减少为11个，且指纹图谱相似度较低。分别将各批配方颗粒与饮片及水提液的共有模式进行比较，有4批次与饮片相似度较低(小于0.1)，推测可能与白及药材来源、制备工艺差别及制备过程中发生化学成分的损失有关，白及配方颗粒的hplc指纹图谱需要扩大样品量进一步研究(张蕾.白及配方颗粒质量标准初步研究[d].广州中医药大学，2012.)。
[0009]
市面上白及混伪品众多，有水白及、扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄花白及、小白及、黄精、云南独蒜兰、山慈菇、玉竹等，因此关于白及真伪品鉴别的研究文献也十分丰富。常规的区分方式有性状鉴别、理化鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、紫外光谱鉴别，也有通过多糖含量高低区分白及和伪品水白及。特征图谱、指纹图谱方面有部分文献报道。李正坤建立了以儿茶素为内标的白及药材uplc指纹图谱，得到14个共有峰，检测发现36批白及药材的相似度均在0.8以上，而3批伪品(水白及、乌龟及、黄叉及)的相似度均低于0.2，由此可区分白及正品和三种伪品(李正坤.白及药材质量评价研究[d].北京中医药大学，2020)。杨红燕等人建立了山慈菇药材指纹图谱方法，可以直观地判断山慈菇与白及、山兰、扁白及的真伪(杨红燕，项微微，李玲燕.hplc法指纹图谱在山慈菇真伪鉴别中的应用[j].浙江中医杂志，2020，55(01)：72-73)。翟萌建立了白及与其混淆品、伪品的高效液相色谱鉴别方法，通过对比高效液相色谱图中特征性色谱峰的保留时间不同，可区分白及正品与其混淆品、伪品，但未进一步生成特征图谱，形成统一可量化的质量标准(翟萌.白及与其混淆品、伪品的生药学对比
研究[d].成都中医药大学，2012)。此外，还有基于智能视觉技术、近红外光谱技术的快速辨识，its2序列二级结构比较鉴别，dna分子鉴定等。综上所述，关于白及真伪品鉴别的研究方向十分丰富，但这些技术手段具有一定局限性。目前白及真伪鉴别研究方面未见有关通过特征图谱技术形成的统一评价标准。


技术实现要素：

[0010]
发明目的：为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种精密度高，重复性、稳定性好，特征峰信息量丰富，能有效保证白及药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量稳定性的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法及应用，具有操作简单、检测成本低、检测效率高等优势，并为白及药材真伪鉴别提供有效依据。
[0011]
技术方案：本发明提供了一种白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法及应用，其中，白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法包括如下步骤：
[0012]
1)供试品溶液的制备：所述供试品是白及或其药物制剂，所述白及或其药物制剂包括白及药材、白及饮片、白及标准汤剂或白及配方颗粒；
[0013]
2)对照溶液的制备：所述对照溶液包括对照药材参照物溶液以及对照品参照物溶液；所述对照品参照物溶液采用的对照品是1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯以及4-(葡萄糖氧基).肉桂酸葡萄糖氧基苄酯；所述对照药材参照物溶液采用的对照药材是白及对照药材；
[0014]
3)将对照溶液以及供试品溶液分别注入液相色谱中，获取特征图谱；
[0015]
所述液相色谱采用的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm～2.2μm；以乙腈为流动相a，以0.008％～0.015％磷酸溶液为流动相b，采用梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml～0.35ml；柱温为15℃～25℃；采用紫外检测器检测，检测波长为265nm～285nm。
[0016]
作为优选，本发明所采用的步骤3)中特征图谱中，供试品溶液的色谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物溶液色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰2、峰7的保留时间应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应；与4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯参照物相对应的峰为s1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6与s1峰的相对保留时间；与1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯参照物相对应的峰为s2峰，计算特征峰8、峰9、峰10与s2峰的相对保留时间；白及药材、饮片、标准汤剂或配方颗粒的相对保留时间均应在规定值的
±
10％之内，峰1的规定值为0.63、峰3的规定值为1.09、峰4的规定值为1.22、峰5的规定值为1.30、峰6的规定值为1.34、峰8的规定值为1.24、峰9的规定值为1.40以及峰10的规定值为1.61。
[0017]
作为优选，本发明所采用的步骤3)中液相色谱采用的条件为色谱柱采用poroshell ec-c18，所述色谱柱的规格是100mm
×
2.1mm，1.9μm；以乙腈为流动相a，以0.01％磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为20℃；检测波长为270nm。
[0018]
作为优选，本发明所采用的步骤3)中梯度洗脱的方式是：
[0019]
0～4分钟，流动相a的比例是从15％递增至24％，流动相b的比例是从85％降至76％；
[0020]
4～6分钟，流动相a的比例是从24％递增至32％，流动相b的比例是从76％降至68％；
[0021]
6～11分钟，流动相a的比例是从32％递增至38％，流动相b的比例是从68％降至62％；
[0022]
11～13分钟，流动相a的比例是从38％递增至55％，流动相b的比例是从62％降至45％；
[0023]
13～15分钟，流动相a的比例是从55％递增至80％，流动相b的比例是从45％降至20％；
[0024]
15～16分钟，流动相a的比例是80％，流动相b的比例是20％。
[0025]
作为优选，本发明所采用的步骤3)是采用超高效液相色谱仪进行测定的液相色谱；所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液的注入量均是1μl～4μl。
[0026]
作为优选，本发明所采用的步骤1)的具体实现方式是：
[0027]
取白及药材或饮片粉末，过筛后称量0.5g～3g，置具塞锥形瓶中，加水、甲醇或体积浓度为30％～80％的甲醇水溶液20ml～100ml，超声或加热回流或振荡处理15～60min，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述超声提取的功率为250w～600w、频率为35khz～45khz；
[0028]
取白及标准汤剂粉末或配方颗粒粉末约0.1g～2g，置具塞锥形瓶中，加水、甲醇或体积浓度为30％～80％的甲醇水溶液10ml～25ml，超声或加热回流或振荡处理15～60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述超声提取的功率为250w～600w、频率为35khz～45khz。
[0029]
作为优选，本发明所采用的步骤1)中：
[0030]
白及药材或饮片供试品溶液的制备如下进行：将白及药材或饮片粉末过三号筛后取1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及药材或饮片供试品溶液；
[0031]
白及标准汤剂供试品溶液的制备如下进行：取白及标准汤剂粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇15ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及标准汤剂供试品溶液；
[0032]
白及配方颗粒供试品溶液的制备如下进行：取白及配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及配方颗粒供试品溶液；
[0033]
所述超声处理采用的功率均是250w，超声处理采用的频率均是40khz。
[0034]
作为优选，本发明所采用的步骤2)中对照溶液的具体制备方式是：取白及对照药材0.5g～2.0g，加入水25ml进行超声提取，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇水溶液15ml提取，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，分别加稀乙醇、80％甲醇水溶液溶解，作为对照品参照物溶液；所述1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的浓度是0.10～0.20mg/ml，所述4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯的
浓度是20～80μg/ml。
[0035]
基于前述白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法在白及或其药物制剂质量检测时的应用，具体是当白及的特征图谱或其药物制剂的特征图谱中含有uplc特征图谱中相对应的10个特征峰，则判定白及或其药物制剂在特征图谱这一质量检测项目上合格。
[0036]
基于前述白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法在鉴别和/或区分白及与伪品时的应用；所述伪品是扁白及、蝴蝶及、乌龟及和/或黄精；具体是通过特征峰数目和相对峰面积比值将白及与伪品进行区分，具体是通过特征峰五个特征峰(峰3、峰4、峰5、峰6和峰9)的有无以及峰7/峰1相对峰面积值大于8时，将白及与伪品进行区分。
[0037]
有益效果：本发明建立了一组快速、全面、稳定、专属性强的白及质量检测方法，该方法较前人文献，其优势在于：
[0038]
1)本发明建立的白及药材、饮片和配方颗粒的特征图谱具有较强的专属性，可将白及、白及伪品(扁白及)、白及伪品(蝴蝶及)、白及伪品(乌龟及)、白及伪品(黄精)进行区分，为白及药材、饮片和配方颗粒的真伪鉴别提供依据。
[0039]
2)本发明所提供的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，以白及对照药材以及化学对照品为参照，建立了含有10个特征峰的特征图谱，指认了3个特征峰，特征峰信息量丰富，比较全面地反映了白及所含化学成分的种类和数量，能够更加有效地体现出白及中成分的整体性和综合作用。同时白及药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱研究中均有对应的特征峰，更能充分体现从原料到制剂成品的一致性，为白及配方颗粒及上游原料中特征成分的溯源提供了依据，确保白及配方颗粒到原料的质量有效、可追溯，也为产业化过程的质量控制提供有力保障。
[0040]
3)本发明所提供的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法较前人特征图谱的研究，能够在20分钟以内实现特征图谱的检测，大大降低了检测的时间成本，更有利于白及配方颗粒的质量控制。
[0041]
4)本发明所提供的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法采用超高液相色谱法进行特征图谱的检测，更加全面，且操作简单。其色谱峰能够实现较好分离，色谱峰峰形好，特征图谱信息较为丰富。经过方法学验证，精密度高，重复性、稳定性好，检测成本低，检测效率高，可为规范白及配方颗粒的生产提供重要保障。
附图说明
[0042]
图1为白及配方颗粒不同波长检测色谱图；
[0043]
图2为白及配方颗粒不同色谱柱检测色谱图；
[0044]
图3为白及配方颗粒不同柱温检测色谱图；
[0045]
图4为白及配方颗粒不同流速检测色谱图；
[0046]
图5为白及药材提取溶剂考察色谱图；
[0047]
图6为白及配方颗粒提取溶剂考察色谱图；
[0048]
图7为白及配方颗粒特征图谱色谱峰指认uplc图谱；
[0049]
图8为白及配方颗粒特征谱图整体性试验uplc图谱；
[0050]
图9为3批白及配方颗粒uplc图谱叠加图；
[0051]
图10为21批白及标准汤剂uplc图谱叠加图；
[0052]
图11为21批白及饮片uplc图谱叠加图；
[0053]
图12为21批白及药材uplc图谱叠加图；
[0054]
图13为白及配方颗粒uplc对照特征图谱；
[0055]
图14为白及标准汤剂uplc对照特征图谱；
[0056]
图15为白及饮片uplc对照特征图谱；
[0057]
图16为白及药材uplc对照特征图谱；
[0058]
图17为伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材与白及药材特征图谱叠加图。
具体实施方式
[0059]
本实施例提供了一种白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，具体内容如下：
[0060]
色谱条件参数：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以乙腈为流动相a，以0.01％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30ml；柱温为20℃；检测波长为270nm。
[0061]
参照物溶液的制备：取白及对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，精密称定，分别加稀乙醇、80％甲醇制成每1ml含1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯0.15mg、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0062]
供试品溶液的制备：
[0063]
取白及药材或饮片粉末适量(过三号筛)，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及药材或饮片供试品溶液。
[0064]
取白及标准汤剂粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇15ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及标准汤剂供试品溶液。
[0065]
取白及配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及配方颗粒供试品溶液。
[0066]
测定法：分别精密吸取对照药材参照物溶液4μl、对照品参照物溶液2μl、供试品溶液1～2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0067]
下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细的说明。
[0068]
实施例一：实验条件的筛选及确定
[0069]
本实施例所描述的具体的实验条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0070][0071]
1.1仪器与试药
[0072]
agilent technologies 1290infinity超高效液相色谱仪；waters-acquiyt-uplc-h-class超高效液相色谱仪；kq-250e超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；mettler toledo xp6百万分之一天平(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)；me204e/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；gkc控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；hy-4振荡器(金坛市科兴仪器厂)；milli-q iq型纯水系统(millipore公司)；as165w型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)；乙腈(色谱纯，thermo fisher公司)；磷酸(色谱纯，aladdin公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
[0073]
4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品、手参苷ix对照品购于成都普思生物科技股份有限公司，批号分别为ps012009、ps220811-05。
[0074]
1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品购于中国食品药品检定研究院，批号为112061-202001。
[0075]
白及对照药材购自中国食品药品检定研究院，批号为121262-201706。
[0076]
白及配方颗粒、白及药材由江阴天江药业有限公司提供。
[0077]
1.2检测波长的确定
[0078]
取白及配方颗粒适量，研细，取1g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，记录190～400nm范围内的吸收光谱(见下图)。采集样品在240nm，270nm和300nm下的色谱图，如图1所示。结果表明，在270nm波长下峰的个数较多，响应较大，基线也较平稳，因此选用270nm作为检测波长。
[0079]
1.3色谱条件的确定
[0080]
经过前期的流动相比例优化，不同流动相和色谱柱的考察，最终确定白及配方颗粒特征图谱的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以乙腈为流动相a，以0.01％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为20℃；检测波长为270nm。
[0081]
[0082]
1.4系统适应性考察
[0083]
(1)色谱柱考察
[0084]
取白及配方颗粒样品，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别采用acclaim
tm
rslc 120c18(thermo，2.1mm
×
100mm，2.2μm)；acquitybeh c18(waters，2.1mm
×
100mm，1.7μm)；poroshell ec-c18(agilent，2.1mm
×
100mm，1.9μm)3种色谱柱，分别进样1μl，记录相应色谱图，结果见表1、图2。
[0085]
表1 色谱柱考察(相对保留时间)
[0086][0087]
结果表明：poroshell ec-c18、acquitybeh c18色谱柱测得各特征峰的相对保留时间相近，各特征峰分离度较好，说明耐用性良好。本实验选择poroshell ec-c18(agilent，2.1mm
×
100 mm，1.9μm)色谱柱进行后续研究。
[0088]
(2)柱温考察
[0089]
取同一批号样品，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，以poroshell ec-c18(agilent，2.1mm
×
100mm，1.9μm)为色谱柱，考察15℃、20℃、25℃三个温度，分别进样1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表2、图3。
[0090]
表2 柱温考察(相对保留时间)
[0091][0092]
结果表明，柱温在15℃～25℃范围内，各色谱峰分离良好，耐用性较好，本次实验选择柱温20℃进行后续研究。
[0093]
(3)流速考察
[0094]
取同一批号样品，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，以poroshell ec-c18(agilent，2.1mm
×
100mm，1.9μm)为色谱柱，考察流速为每分钟0.25ml、每分钟0.30ml、每分钟0.35ml时三个流速，分别进样1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表3、图4。
[0095]
表3 流速考察(相对保留时间)
[0096][0097]
结果表明，流速在0.25ml/min～0.35ml/min范围内，各色谱峰分离良好，耐用性较好，本次实验选择流速为每分钟0.30ml进行后续研究。
[0098]
1.5参照物溶液的制备
[0099]
取白及对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，精密称定，分别加稀乙醇、80％甲醇制成每1ml含1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯0.15mg、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0100]
1.6供试品溶液的制备
[0101]
1.6.1白及药材供试品溶液
[0102]
(1)不同提取溶剂的考察
[0103]
取本品粉末(批号：yc112108023)适量(过三号筛)，取约1.5g，平行五份，置具塞锥形瓶中，分别加水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇各25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积值/称样量，结果见下表4、图5。
[0104]
表4 不同提取溶剂的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0105][0106]
结果表明：采用80％甲醇作为提取溶剂时，白及药材特征峰总峰面积值/称样量较高。但甲醇的加入导致峰10峰面积增长明显，峰5和峰6明显降低，与标准汤剂和配方颗粒特征图谱差别较大，综合考虑，确定提取溶剂为水。
[0107]
(2)不同提取方式的考察
[0108]
取本品粉末(批号：yc112108023)适量(过三号筛)，取约1.5g，平行三份，置具塞锥形瓶中，加水25ml，分别振摇提取、超声处理(功率250w，频率40khz)、加热回流30分钟，放
冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积值/称样量，结果见表5。
[0109]
表5 不同提取方式的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0110][0111]
结果表明：采用超声处理提取时，白及药材中特征峰峰面积值/称样量较高，确定提取方法为超声提取。
[0112]
(3)不同提取时间的考察
[0113]
取本品粉末(批号：yc112108023)适量(过三号筛)，取约1.5g，平行四份，置具塞锥形瓶中，加水25ml，分别超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积值/称样量，结果见表6。
[0114]
表6 不同提取时间的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0115][0116]
结果表明：超声处理45分钟时，白及药材中特征峰峰面积值/称样量较高，确定提取时间为45分钟。
[0117]
(4)不同提取体积的考察
[0118]
取本品粉末(批号：yc112108023)适量(过三号筛)，取约1.5g，平行四份，置具塞锥形瓶中，分别加水20ml、25ml、50ml、100ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积值/称样量，结果见表7。
[0119]
表7 不同提取体积的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0120]
[0121]
结果表明：提取效率随提取体积的增大而提高，从提取充分和节省溶剂的角度考虑，确定提取体积为50ml。
[0122]
(5)供试品溶液制备方法的确定
[0123]
根据上述研究结果，最终确定白及药材特征图谱的供试品溶液制备方法为：
[0124]
取白及药材粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0125]
1.6.2白及配方颗粒供试品溶液
[0126]
(1)不同提取溶剂的考察
[0127]
取本品(批号：21100149)适量，研细，取1g，平行五份，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、80％甲醇、50％甲醇、30％甲醇和水各20ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液1μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表8、图6。
[0128]
表8 不同提取溶剂的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0129][0130]
结果表明，以80％甲醇为提取溶剂时，色谱峰的提取效率较高，因此选择80％甲醇作为提取溶剂。
[0131]
(2)不同提取方式的考察
[0132]
取本品(批号：21100149)适量，研细，取1g，平行三份，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，密塞，分别振摇提取、超声处理(功率250w，频率40khz)、加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液1μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表9。
[0133]
表9 不同提取方式的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0134][0135]
结果表明，采用三种处理方式所得的色谱峰数目一致，提取效率相近。考虑到实验操作简便性，选择超声处理作为提取方式。
[0136]
(3)不同提取时间的考察
[0137]
取本品(批号：21100149)适量，研细，取1g，平行四份，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，密塞，分别超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液1μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表10。
[0138]
表10 不同提取时间的提取效率比较(峰面积/称样量)
[0139][0140][0141]
结果表明，不同提取时间的提取效率没有明显区别，从提取完全和节省时间的角度考虑，提取时间定为30分钟。
[0142]
(4)不同提取体积的考察
[0143]
取本品(批号：21100149)适量，研细，取1g，平行三份，置具塞锥形瓶中，分别加入80％甲醇15ml、20ml、25ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液1μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算特征峰峰面积/称样量*体积/20，结果见表11。
[0144]
表11 不同提取体积的提取效率比较(峰面积/称样量*提取体积/20)
[0145][0146]
结果表明，不同提取体积的提取效率没有明显增加，从充分提取与节省溶剂的角度综合考虑，确定提取体积为20ml。
[0147]
(5)供试品溶液制备方法的确定
[0148]
根据上述研究结果，确定白及配方颗粒特征图谱的供试品溶液制备方法为：
[0149]
取白及配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0150]
1.7特征图谱方法学研究
[0151]
(1)色谱峰指认及专属性考察
[0152]
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白及配方颗粒供试品溶液。
[0153]
参照物溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白及对照药材参照物溶液。另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品参照物溶液。再取4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品、手参苷ix对照品适量，精密称定，分别加80％甲醇制成每1ml含4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯40μg、手参苷ix30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0154]
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺白及配方颗粒阴性对照溶
液。
[0155]
对白及配方颗粒特征图谱峰进行定位。如图7所示。
[0156]
结果表明：阴性溶液在与供试品溶液色谱图中各特征峰的保留时间处没有色谱峰，说明溶剂及辅料对白及配方颗粒的测定无干扰，以本法测定白及配方颗粒具有专属性。
[0157]
(2)整体性考察
[0158]
在确定的色谱条件上，延长洗脱时间，考察在既定的色谱条件系统下，是否会残留杂质峰对后续样品造成影响，结果见图8。
[0159]
结果表明：延长一倍洗脱时间，无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析亦无影响。
[0160]
(3)精密度考察
[0161]
取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备成供试液，连续进样6次，每次1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表12。
[0162]
表12 精密度考察(相对保留时间)
[0163][0164][0165]
结果表明，各特征峰的相对保留时间的rsd均小于1％，精密度良好。
[0166]
(4)重复性考察
[0167]
取同一批号样品，平行6份，按供试品溶液制备方法制备成供试液，分别进样1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表13。
[0168]
表13 重复性考察(相对保留时间)
[0169]
[0170]
结果表明，各特征峰的相对保留时间的rsd均小于1％，重复性良好。
[0171]
(5)中间精密度考察
[0172]
取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备成供试液，由两个实验员a、b分别按照正文项下的要求处理3份，分别在agilent、waters仪器上进样1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表14。
[0173]
表14 中间精密度考察(相对保留时间)
[0174][0175][0176]
结果表明：不同分析人员在不同色谱仪下操作，相对保留时间rsd在3％内，均在规定值的
±
10％范围之内，中间精密度良好。
[0177]
(6)稳定性考察
[0178]
取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备成供试液，分别于0、2、4、6、8、10、12、18、24h小时进样1μl，记录其特征峰保留时间，按照正文要求计算相对保留时间，结果见表15。
[0179]
表15 稳定性考察(相对保留时间)
[0180][0181]
结果表明，各特征峰的相对保留时间的rsd均小于1％，供试液在24小时内稳定性良好。
[0182]
实施例二：白及配方颗粒、标准汤剂、饮片、药材的检测和对照图谱的建立
[0183]
取白及配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0184]
取白及标准汤剂粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0185]
取白及饮片粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0186]
取白及药材粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0187]
取白及对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，精密称定，分别加稀乙醇、80％甲醇制成每1ml含1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯0.15mg、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0188]
分别精密吸取对照溶液和白及配方颗粒、标准汤剂、饮片、药材供试品溶液1～4μl，注入液相色谱仪，色谱条件：色谱柱为poroshell ec-c18(1.9μm，2.1mm
×
100mm)；以乙腈为流动相a，以0.01％磷酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为20℃；检测波长为270nm。
[0189][0190][0191]
(1)制备3批白及配方颗粒、21批白及标准汤剂、21批白及饮片、21批白及药材供试品溶液；
[0192]
(2)按照本发明检测白及配方颗粒的uplc特征图谱的方法对所述供试品溶液分别进行检测，得到3批白及配方颗粒uplc特征图谱、21批白及标准汤剂uplc特征图谱、21批白及饮片uplc特征图谱、21批白及药材uplc特征图谱；
[0193]
(3)将得到的3批白及配方颗粒uplc特征图谱、21批白及标准汤剂uplc特征图谱、21批白及饮片uplc特征图谱、21批白及药材uplc特征图谱分别导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，建立白及配方颗粒、白及标准汤剂、白及饮片、白及药材的对照图谱。见表16～19、图9～12。
[0194]
实验结果：
[0195]
表16 3批白及配方颗粒样品测定结果(相对保留时间)
[0196][0197]
表17 21批白及标准汤剂样品测定结果(相对保留时间)
[0198][0199][0200]
表1821批白及饮片样品测定结果(相对保留时间)
[0201][0202]
表1921批白及药材样品测定结果(相对保留时间)
[0203]
[0204][0205]
3批白及配方颗粒、21批白及标准汤剂、21批白及饮片、21批白及药材均显示相同的10个共有特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰2、峰7的保留时间应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应。与4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯参照物相对应的峰为s1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6与s1峰的相对保留时间；与1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯参照物相对应的峰为s2峰。计算特征峰8、峰9、峰10与s2峰的相对保留时间；白及配方颗粒、标准汤剂、饮片、药材的相对保留时间均应在规定值的
±
10％之内，规定值为：0.63(峰1)、1.09(峰3)、1.22(峰4)、1.30(峰5)、1.34(峰6)1.24(峰8)、1.40(峰9)、1.61(峰10)。
[0206]
建立的白及配方颗粒、标准汤剂、饮片、药材对照图谱可以用于较为准确地控制白及配方颗粒质量，有效保证从白及原料到制剂成品的整体质量的稳定性。见图13～16。
[0207]
实施例三：白及真、伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材鉴别
[0208]
s11.取伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材粉末(过三号筛)适量，取约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0209]
s12.取白及对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80％甲醇15ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，精密称定，分别加稀乙醇、80％甲醇制成每1ml含1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯0.15mg、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0210]
s13.分别精密吸取对照溶液和伪品(扁白及)、伪品(蝴蝶及)、伪品(乌龟及)、伪品
(黄精)药材供试品溶液2～4μl，注入液相色谱仪，色谱条件：色谱柱为poroshell ec-c18(2.1mm
×
100mm，1.9μm)；以乙腈为流动相a，以0.01％磷酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为20℃；检测波长为270nm。
[0211][0212][0213]
(1)制备3批伪品(扁白及)、3批伪品(蝴蝶及)、3批伪品(乌龟及)、3批伪品(黄精)药材供试品溶液；
[0214]
(2)按照本发明检测白及药材的uplc特征图谱的方法对所述供试品溶液进行检测，分别得到伪品(扁白及)、伪品(蝴蝶及)、伪品(乌龟及)、伪品(黄精)药材各3个uplc特征图谱；
[0215]
(3)将得到的3批伪品(扁白及)、3批伪品(蝴蝶及)、3批伪品(乌龟及)、3批伪品(黄精)药材uplc特征图谱分别导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”来建立对应伪品药材的对照图谱；
[0216]
(4)比较白及药材与其伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材的uplc对照图谱，并以峰1为参照，比较白及与其伪品药材中峰a、峰b、峰c、峰d、峰7的相对峰面积差异，对白及和其伪品进行区别。见表20、图17。
[0217]
结果表明：白及和其伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材的色谱峰具有较大差异。白及药材呈现10个共有特征峰，其余四个伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)药材色谱图只呈现3个共有特征峰(峰1、峰7、峰8)，即白及药材中的峰3、峰4、峰5、峰6、峰9在伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)中均不存在；峰2在其余四个伪品药材对应保留时间处虽有色谱峰出现，但峰面积极低，且紫外吸收光谱与白及不同，不属于共有峰。此外，白及药材色谱图中不存在峰a、峰b、峰c、峰d。因此，可通过峰3、峰4、峰5、峰6、峰9特征峰的有无将白及与其伪品进行区分。
[0218]
进一步分析比较白及和其伪品之间的差异，以峰1为参照峰，比较白及真、伪品药材中峰7的相对峰面积差异，分析及结果如下：
[0219]
表20白及、伪品(扁白及)、伪品(蝴蝶及)、伪品(乌龟及)、伪品(黄精)药材样品相对峰面积
[0220][0221][0222]
结果表明，白及与伪品中峰7/峰1的相对峰面积有较大的差异，当峰7/峰1相对峰面积大于8时，可判定为白及，峰7/峰1相对峰面积小于8时，可判定为伪品(扁白及、蝴蝶及、乌龟及、黄精)。
[0223]
综上所述，本白及特征图谱方法中峰3、峰4、峰5、峰6、峰9，五个特征峰的有无以及峰7/峰1相对峰面积》8时，可将可白及和其伪品进行有效区分。

技术特征：
1.一种白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：1）供试品溶液的制备：所述供试品是白及或其药物制剂，所述白及或其药物制剂包括白及药材、白及饮片、白及标准汤剂或白及配方颗粒；2）对照溶液的制备：所述对照溶液包括对照药材参照物溶液以及对照品参照物溶液；所述对照品参照物溶液采用的对照品是1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯以及4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯；所述对照药材参照物溶液采用的对照药材是白及对照药材；3）将对照溶液以及供试品溶液分别注入液相色谱中，获取特征图谱；所述液相色谱采用的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm～2.2μm；以乙腈为流动相a，以0.008%~0.015%磷酸溶液为流动相b，采用梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml~0.35ml；柱温为15℃~25℃；采用紫外检测器检测，检测波长为265nm~285nm。2.根据权利要求1所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤3）中特征图谱中，供试品溶液的色谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物溶液色谱中的10个特征峰的保留时间相对应，其中峰2、峰7的保留时间应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应；与4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯参照物相对应的峰为s1峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6与s1峰的相对保留时间；与1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯参照物相对应的峰为s2峰，计算特征峰8、峰9、峰10与s2峰的相对保留时间；白及药材、饮片、标准汤剂或配方颗粒的相对保留时间均应在规定值的
±
10%之内，峰1的规定值为0.63、峰3的规定值为1.09、峰4的规定值为1.22、峰5的规定值为1.30、峰6的规定值为1.34、峰8的规定值为1.24、峰9的规定值为1.40以及峰10的规定值为1.61。3.根据权利要求2所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤3）中液相色谱采用的条件为色谱柱采用poroshell ec-c18，所述色谱柱的规格是100mm
×
2.1mm，1.9μm；以乙腈为流动相a，以0.01%磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为20℃；检测波长为270nm。4.根据权利要求3所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤3）中梯度洗脱的方式是：0～4分钟，流动相a的比例是从15%递增至24%，流动相b的比例是从85%降至76%；4～6分钟，流动相a的比例是从24%递增至32%，流动相b的比例是从76%降至68%；6～11分钟，流动相a的比例是从32%递增至38%，流动相b的比例是从68%降至62%；11～13分钟，流动相a的比例是从38%递增至55%，流动相b的比例是从62%降至45%；13～15分钟，流动相a的比例是从55%递增至80%，流动相b的比例是从45%降至20%；15～16分钟，流动相a的比例是80%，流动相b的比例是20%。5.根据权利要求4所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤3）是采用超高效液相色谱仪进行测定的液相色谱；所述对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液以及供试品溶液的注入量均是1μl~4μl。6.根据权利要求1-5任一项所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤1）的具体实现方式是：
取白及药材或饮片粉末，过筛后称量0.5g~3g，置具塞锥形瓶中，加水、甲醇或体积浓度为30%～80%的甲醇水溶液20ml~100ml，超声或加热回流或振荡处理15~60min，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80%甲醇15ml，密塞，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述超声提取的功率为250w~600w、频率为35khz~45khz；取白及标准汤剂粉末或配方颗粒粉末约0.1g~2g，置具塞锥形瓶中，加水、甲醇或体积浓度为30%～80%的甲醇水溶液10ml~25ml，超声或加热回流或振荡处理15~60min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述超声提取的功率为250w~600w、频率为35khz~45khz。7.根据权利要求6所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤1）中：白及药材或饮片供试品溶液的制备如下进行：将白及药材或饮片粉末过三号筛后取1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，超声处理45分钟，放冷，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80%甲醇15ml，密塞，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及药材或饮片供试品溶液；白及标准汤剂供试品溶液的制备如下进行：取白及标准汤剂粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇15ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及标准汤剂供试品溶液；白及配方颗粒供试品溶液的制备如下进行：取白及配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇20ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得白及配方颗粒供试品溶液；所述超声处理采用的功率均是250w，超声处理采用的频率均是40khz。8.根据权利要求7所述的白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤2）中对照溶液的具体制备方式是：取白及对照药材0.5g~2.0g，加入水25ml进行超声提取，离心，取上清液浓缩至近干，残渣加80%甲醇水溶液15ml提取，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品、4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯对照品适量，分别加稀乙醇、80%甲醇水溶液溶解，作为对照品参照物溶液；所述1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的浓度是0.10~0.20mg/ml，所述4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯的浓度是20~80μg/ml。9.权利要求1-8任一项所述白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法在白及或其药物制剂质量检测时的应用，具体是当白及的特征图谱或其药物制剂的特征图谱中含有uplc特征图谱中相对应的10个特征峰，则判定白及或其药物制剂在特征图谱这一质量检测项目上合格。10.权利要求1-8任一项所述白及或其药物制剂的uplc特征图谱的构建方法在鉴别和/或区分白及与伪品时的应用；所述伪品是扁白及、蝴蝶及、乌龟及和/或黄精；具体是通过特征峰五个特征峰峰3、峰4、峰5、峰6和峰9的有无以及峰7/峰1相对峰面积值大于8时，将白及与伪品进行区分。

技术总结
本发明属于药物质量控制领域，涉及一种白及或其药物制剂的UPLC特征图谱的构建方法及应用，包括供试品溶液以及对照溶液的制备；将对照溶液以及供试品溶液分别注入液相色谱中，获取特征图谱；液相色谱采用的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm～2.2μm；以乙腈为流动相A，以0.008%~0.015%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml~0.35ml；柱温为15℃~25℃；采用紫外检测器检测，检测波长为265nm~285nm。本发明具有操作简单、检测成本低、检测效率高等优势，并可为白及药材真伪鉴别提供有效依据。药材真伪鉴别提供有效依据。药材真伪鉴别提供有效依据。


技术研发人员：郑谭 袁健 祝倩倩 王协和 李松 陈盛君 张钰萍 翟燕娟 周海琴
受保护的技术使用者：江阴天江药业有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/7