一种漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法与流程

1.本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法。


背景技术：

2.叔丁基对苯二酚（tbhq）是一种无毒的油溶性抗氧化剂，通过清除或淬灭自由基有效延缓油脂的氧化劣变，被广泛应用于食用植物油中。然而，过量摄入tbhq可能会对机体造成一系列有害影响，包括畸形、癌症等。目前，我国对其在食用油中的最高法律限量为0.2 g/kg，欧盟和日本对其在所有食品中都是禁用的。因此，有必要对食用油中tbhq的添加量进行严格监控。目前，现行有效的国家标准 gb/t 5009.30-2003 规定糕点和植物油等食品中tbhq的检测方法，该方法中需要制备层析柱净化后用溶剂解析，相关步骤繁琐，试剂耗材损耗量大，回收率低等。
3.纳米酶是指具有天然酶催化活性的纳米材料。其成本低、易储存、酶活性可调节控制。其中，漆酶是一类在催化中心含有四个铜离子的多铜氧化酶，可以通过四个电子转移催化底物的氧化，如酚类、多酚类、胺类等。最近，一些含铜纳米材料被探索其类漆酶活性，但由于酶活性低，现有报道能氧化的酚类物质有限，基本仅限于氯酚、苯酚类，少数报道双酚a的氧化。纳米酶的重要优点是其活性可以通过表面修饰来调节，例如调节尺寸、形状、掺杂剂和表面电荷。为了提高催化剂的活性、选择性、稳定性和灵敏度，对纳米材料进行表面修饰是必不可少的。针对目前研究的漆酶纳米酶催化能力及氧化底物的局限性的现状，本发明通过合成超小尺寸及磷钨酸及多巴胺双配体制备含铜漆酶纳米酶，大大提高了漆酶纳米酶活性及对底物氧化的选择性。


技术实现要素：

4.本发明公开了一种漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法，该方法以磷钨酸及氯化铜为前驱，微波法合成具有类漆酶纳米酶活性的含铜磷钨酸纳米酶（cu-pws），将多巴胺（da）作为第二配体掺杂到cu-pws纳米酶中，形成一种新型的漆酶模拟酶（cu-pws/da）。通过比较，cu-pws/da纳米酶具有优异的仿漆酶活性、较高的稳定性和催化动力学性质。多巴胺的掺入加快了电子传递速率，从而达到增强催化活性的目的。cu-pws/da选择性氧化叔丁基-4-羟基茴香醚（tbhq）为醌类化合物，再与4-氨基安替比林（4-ap）络合形成红色醌亚胺染料，在500 nm处有紫外吸收峰，从而建立了tbhq的比色快速检测方法，将本方法应用于食用油脂中tbhq的检测分析，结果与gb5009.32-2016 食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂测定的结果相符；本发明方法只能选择性快速氧化tbhq，同类合成酚类抗氧化剂没有干扰，检出限达0.01 mg/kg，方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。
5.本发明涉及漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法，包括以下
步骤：包括以下步骤：（1）在检测体系中加入tbhq、4-氨基安替比林（4-ap）溶液、cu-pws/da纳米酶，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，于500 nm波长处测定吸光度，建立吸光度与tbhq浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；（2）提取检测样品中tbhq，获得样品测定液，在cu-pws/da纳米酶+tmb体系中，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，加入样品测定液，于500 nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中tbhq含量；所述cu-pws/da纳米酶制备包括：0.25-0.30g磷钨酸、溶于30-35ml纯水，加入0.30-0.35g cucl2，常温搅拌30-40 min后，转移到聚四氟乙烯罐中，置于微波消解仪中，140℃加热3-4 h，冷却至室温，离心，过0.22μm滤膜，在得到滤液中加入300-350 μl氨水，搅拌10-15 min后，加入0.15-0.20 g多巴胺，常温搅拌10-12 h后，在60℃的条件下真空干燥24-48 h，即得cu-pws/da纳米酶。
6.所述的tbhq溶液浓度范围在0.125
–
345.3
ꢁ
mg/kg，cu-pws/da溶液的浓度为0.1 mg/ml，添加量为50-100 μl；4-ap溶液浓度为50 mmol/l，添加量为20-50 μl；氨水的密度为0.91 g/cm3。
7.所述的离心是在8000-10000 r/min下处理10-15 min。
8.本发明的优点在于：1、本发明利用具有高负电荷、独特螯合性质和多样结构的金属-氧化物阴离子、具有独特的电子转移性质和调控纳米材料电荷组成的能力磷钨酸与cu
2+
为原料制备纳米材料（cu-pws），将多巴胺（da）作为第二配体掺杂到cu-pws纳米酶中，形成一种新型的漆酶模拟酶（cu-pws/da），cu-pws/da具有优异的仿漆酶活性、较高的稳定性和催化动力学性质，同时，多巴胺的引入提高了纳米酶与底物的亲和力，加快了电子传递速率，从而达到增强活性的目的；2、合成的模拟漆酶纳米酶，能选择性氧化叔丁基-4-羟基茴香醚（tbhq）为醌类化合物，再与4-氨基安替比林（4-ap）络合形成红色醌亚胺染料，在500 nm处有紫外吸收峰，从而建立了tbhq的比色快速检测方法，米-氏动力学方程表明，合成cu2o-ce-tcpp模拟漆酶活性在超声作用下，米氏常数最小，超声大大甚至大于天然漆酶的亲和力；3、本发明建立的方法用于食用油脂中tbhq检测，具有检测可靠、简便、快速的特点，与相关国标方法比较，具有检测结果一致性。
附图说明
9.图1为实施例1中合成cu-pws的tem图；图2为实施例1中合成cu-pws/da的tem图；图 3为实施例1中cu-pws及cu-pws/da氧化tbhq+4-ap紫外-可见吸收光谱；图4为实施例1中cu-pws的米氏动力学曲线；图 5 为实施例1中cu-pws/da的米氏动力学曲线；图6为实施例1中cu-pws/da氧化tbhq线性紫外-可见吸收光谱图；图7为cu-pws/da氧化tbhq线性回归方程；
图8为共存物质对tbhq的影响结果。
实施方式
10.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
11.实施例1：花生油样品中tbhq的测定1、cu-pws/da纳米酶制备：0.25-0.30g磷钨酸、溶于30-35ml纯水，加入0.30-0.35g cucl2，常温搅拌30-40 min后，转移到聚四氟乙烯罐中，置于微波消解仪中，140℃加热3-4 h，冷却至室温，离心，过0.22μm滤膜，在得到滤液中加入300-350 μl氨水，搅拌10-15 min后，加入0.15-0.20 g多巴胺，常温搅拌10-12 h后，在60℃的条件下真空干燥24-48 h，即得cu-pws/da纳米酶；同时制备不加入氨水及多巴胺的滤液为cu-pws；图1及图2为cu-pws及cu-pws/da电镜图，从图中可以看出，合成的纳米酶呈均匀的不规则形状，多巴胺的引入并未改变材料的形状，高分辨tem显示材料晶格间距为0.25nm，与报道的石墨烯（100）面相同；2、cu-pws及cu-pws/da纳米酶漆酶活性评价：以tbhq为底物，4-氨基安替比林（4-ap）为显色试剂，测定了漆酶的模拟酶活性。在图3中，在4-ap存在下，tbhq可被cu-pws或cu-pws/da氧化成醌类似物红色产物，在500 nm处产生明显的吸收峰。cu-pws/da的吸光度明显大于cu-pws。同时进行了米氏催化动力学参数测定（图4和图5），cu-pws及cu-pws/da的米氏常数分别为0.74 mm-1
和0.45 mm-1
，表明超cu-pws/da与底物的亲和力强于cu-pws；3、tbhq工作曲线制作：在5 ml具塞比色管中加入0.1mg/ml cu-pws/da纳米酶100
µ
l、1mg/ml 4-氨替吡啉（4-ap）100
µ
l、浓度在2.25~300 mg/kg范围内的tbhq标准溶液，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，测定400-700 nm的紫外吸收谱图，见图6, 以tbhq浓度为横坐标，吸光度a为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，见图7；回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1；
12.4、方法特异性考察：将tbhq和其他抗氧化剂混合作为混合抗氧化剂，检测共存抗氧化剂在上述检测体系中对tbhq的影响，tbhq浓度为10mg/kg，以上干扰物质浓度为50mg/kg，图7是共存抗氧化剂及不饱和脂肪酸（丁基羟基茴香醚bha)、没食子酸丙酯（pg）、2 , 6
‑ꢀ
二叔丁基对甲基苯酚（bht）及亚麻油、蓖麻油、油酸和花生酸对tbhq的影响结果，从图中可以看出，cu-pws/da体系氧化tbhq有较好的选择特异性，仅有tbhq有明显的氧化反应，其它物质几乎没有，方法测定tbhq具有好的选择特异性；5、花生油样品中tbhq的测定（1）样品处理：准确称取花生油2.00 g于25ml比色管中，加入6ml体积浓度95％的乙醇溶液，涡旋1 min充分混匀，静置片刻，于90℃水浴中加热10 s促使其分层；将上层清液用吸管转移到浓缩瓶中，再用6 ml 95％乙醇溶液重复提取2次，合并提取液并定容到25 ml，得待测样品液；
（2）样品测定：在5 ml具塞比色管中加入0.1mg/mlcu-pws/da纳米酶100
µ
l、1mg/ml 4-氨替吡啉（4-ap）100
µ
l及步骤（3）的待测样品液1ml，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，于500 nm波长处测定吸光度a，代入步骤（1）回归方程，计算样品中tbhq的含量为0.56mg/kg；（3）回收率与精密度实验：在大豆调和油样品中分别添加2个不同浓度的tbhq标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差rsd，结果见表2，测得tbhq的加标回收率在95.8％～102.7％，rsd在2.8％～3.3％，本方法有好的准确性和精密度。
13.表2 样品加标回收率及rsd（n = 3）
14.实施例2：玉米油样品中tbhq的测定1、cu-pws/da纳米酶制备：同实施例1；2、tbhq工作曲线制作：同实施例1；3、玉米油样品中tbhq的测定：同实施例1，玉米油样品中tbhq的含量为10.12 mg/kg；实施例3：菜籽油中tbhq的测定1、cu-pws/da纳米酶制备：同实施例1；2、tbhq工作曲线制作：同实施例1；3、菜籽油中tbhq的测定：同实施例1，菜籽油中tbhq的含量为12.34 mg/kg；实施例4：核桃油中tbhq的测定1、cu-pws/da纳米酶制备：同实施例1；2、tbhq工作曲线制作：同实施例1；3、核桃油中tbhq的测定：同实施例1，核桃油中tbhq的含量为1.08 mg/kg。
15.将实施例1-4用本发明方法与国家标准gb5009.32-2016 食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定方法进行比对，结果见表3；从结果可以看出，两种方法结果一致；
16.本发明建立的tbhq测定法具有处理步骤少，快速、简便，不需要gb5009.32-2016样品净化处理，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。

技术特征：
1.一种漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在检测体系中加入tbhq、4-氨基安替比林（4-ap）溶液、cu-pws/da纳米酶，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，于500 nm波长处测定吸光度，建立吸光度与tbhq浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；（2）提取检测样品中tbhq，获得样品测定液，在cu-pws/da纳米酶+tmb体系中，加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液，反应5-10 min，加入样品测定液，于500 nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中tbhq含量；所述cu-pws/da纳米酶制备包括：0.25-0.30g磷钨酸、溶于30-35ml纯水，加入0.30-0.35g cucl2，常温搅拌30-40 min后，转移到聚四氟乙烯罐中，置于微波消解仪中，140℃加热3-4 h，冷却至室温，离心，过0.22μm滤膜，在得到滤液中加入300-350 μl氨水，搅拌10-15 min后，加入0.15-0.20 g多巴胺，常温搅拌10-12 h后，在60℃的条件下真空干燥24-48 h，即得cu-pws/da纳米酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，tbhq溶液浓度范围在0.125
–
345.3
ꢁ
mg/kg，cu-pws/da溶液的浓度为0.1 mg/ml，添加量为50-100 μl；4
‑ꢀ
ap溶液浓度为50 mmol/l，添加量为20-50 μl；氨水的密度为0.91 g/cm3。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：离心是在8000-10000 r/min下处理10-15 min。

技术总结
本发明公开了一种漆酶模拟酶检测食用油脂中叔丁基-4-羟基茴香醚的方法，该方法以磷钨酸及氯化铜为前驱，微波法合成具有类漆酶纳米酶活性的含铜磷钨酸纳米酶（Cu-PWs），将多巴胺（DA）作为第二配体掺杂到Cu-PWs纳米酶中，形成一种新型优异的仿漆酶活性（Cu-PWs/DA）。Cu-PWs/DA选择性氧化叔丁基-4-羟基茴香醚（TBHQ）为醌类化合物，再与4-氨基安替比林（4-AP）络合形成红色醌亚胺染料，在500 nm处有紫外吸收峰，从而建立了TBHQ的比色快速检测方法。本发明方法只能选择性快速氧化TBHQ，同类合成酚类抗氧化剂没有干扰，检出限达0.581 mg/kg，方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。点。


技术研发人员：杨亚玲 李秋兰 杨德志
受保护的技术使用者：云南伦扬科技有限公司
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/10/7