一种qPCR反应程序中指示溶液存在的方法与流程

一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法
技术领域
1.本发明涉及qpcr技术领域，具体为一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法。


背景技术：

2.核酸聚合酶链式（pcr）反应是最常用的分子生物学技术。因通常反应制备移液操作的体积非常小，如0.1-0.2μl，扩增反应的总体积也大多仅10~30μl；且考虑到核酸扩增反应的高灵敏度，避免空气中尘埃或气溶胶污染，或降低病原微生物感染风险，实验操作人员常常会在一定相对物理隔离环境下，如超净工作台或生物安全柜内进行反应制备操作，甚至是标准pcr实验室，佩戴面罩和护目镜进行操作。这样的条件给实际反应制备操作带来了诸多困难。通过肉眼观察，操作无色透明液体，难以分辨或确认包括极微量液体移液，识别或判断液位高低，易造成反应溶液制备错误或缺漏，以至于实验或检测失败，浪费样本和其他无谓资源损耗。
3.简单地通过在组分中添加可见色素，用于指示溶液的存在，即可解决微小体积移液确认，液位识别等相关问题，降低发生阳性液体外贱可能产生的污染的概率。因此在非荧光pcr检测中，已经有了这样的应用。比如：添加分子生物学研究中常用的色素，如溴酚蓝、靛蓝、菁染料甲酚红等，但在荧光定量pcr（qpcr）的方法中，因为色素的光吸收或荧光发射特征，干扰荧光信号的收集和检测，造成对靶标检测的干扰，无法准确报告样本含量水平。因此，如何在荧光定量pcr（qpcr）中指示溶液存在，又不会对荧光定量pcr反应过程带来影响，是本领域急需解决的一个重要技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，包括：待测dna样本模板，所述待测dna样本模板的稀释液中含有惰性染料物质，所述惰性染料物质的浓度范围为：1/800000~1/1600000g/ml，所述的惰性染料物质包括两种，且二者的质量比例为1:1。
6.优选的，所述的惰性染料物质包括溴酚蓝、靛蓝、甲酚红、橙黄或二甲苯青中的任意一种。
7.优选的，所述惰性染料物质的浓度为1/800000g/ml。
8.优选的，所述的惰性染料物质包括溴酚蓝和二甲苯青。
9.优选的，所述qpcr反应程序中荧光通道为fam、hex/vic、rox、cy3中的任意一种。
10.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：提供的试剂添加物为几种惰性染料物质，在一定浓度范围内，对常见荧光定量pcr检测的fam、hex/vic、rox、cy3等荧光通道信号收集没有显著影响。通过适量添加该组合物，反应试剂组分液体呈现蓝色或蓝绿色，肉眼明显可见，在多种实验操作场景下，可有效提高肉眼识别水平，提高操作效率，减少操作
的误差。
11.本发明中浓度确认较为简单直接，不需要进行多次调节或稀释，直接以终浓度的量化值作为配液标准，不会造成多次配液之间的误差。
12.本发明中是在发现单独着色物质对反应中其他荧光检测通道有影响的情况下，通过混合两种着色物质，在降低着色剂终浓度的情况下，保障肉眼可见色素，且不影响最终检测通道量值的报告。
13.本发明的作用机理为：荧光定量pcr反应或其组成试剂中通过添加特定水平色素，以达到试剂组分或反应溶液便于通过肉眼观察，提高实验操作的便利，且不对实验结果造成干扰。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.以下实施例中，实验材料来源为：溴酚蓝（厂家：阿拉丁试剂，货号b109645）；二甲苯青（厂家：阿拉丁试剂，货号a605504）；甲酚红（厂家：阿拉丁试剂，货号c100244）；供试细胞株（名称：expi 293f，代次：p4，来源：上海甲贝医药）；293细胞dna提取试剂盒（厂家：天根生物，货号dp-304）；abstar taq酶（厂家：生工生物，货号b110005）；5倍的反应缓冲液（5
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buffer）（厂家：生工生物，货号b110005）；dntp混合液（dntp mix）（规格10mm，厂家：诺唯赞，货号p031）；rox染料（厂家：生工生物，货号b541010）上游引物如seq id no：1所示：5'-ccttcctgtgtccatgtgat-3'；下游引物如seq id no：2所示：5'-gatgagttatgtccttgtag-3'；探针核苷酸序列如seq id no：3所示：fam-tgttcaattccactatagtgagaa-bhq1。
16.实施例1：确定肉眼可见的色素浓度范围。
17.分别称取甲酚红、二甲苯青和溴酚蓝各0.5g，分别溶解至100ml灭菌超纯水中，配成终浓度均为0.005g/ml的色素母液。测试前，先将三种母液各自按照5μl母液+495μl灭菌超纯水的配制方法稀释100倍，再将稀释100倍之后的溶液分别按照10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍的梯度进行稀释，最后与灭菌超纯水比对，观察颜色。
18.通过观察颜色，可以看出，随着稀释倍数增加，甲酚红颜色的红色逐渐变淡，80倍、90倍的稀释已接近无色，但是70倍的稀释可以肉眼明显观察到颜色；二甲苯青和溴酚蓝的青色和蓝色逐渐变淡，80倍、90倍的稀释已接近无色，但是70倍的稀释可以肉眼明显观察到颜色。
19.所以，以下实施例在最后稀释10倍~70倍之间的范围做进一步的实验验证，此时，最后稀释10倍~70倍对应的浓度范围为：1/200000~1/1400000g/ml。
20.实施例2：分别选取实施例1中的二甲苯青和溴酚蓝最后稀释30倍（对应浓度为1/600000g/ml）的溶液作为dna样本稀释液备用。
21.1、供试材料：根据293细胞dna提取试剂盒说明书对供试细胞株培养之后的293细胞进行基因组dna的提取，提取的dna经过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测试以鉴定dna质量以及测定dna浓度，根据分光光度计测定的浓度，用te缓冲液将提取之后的dna稀释至30ng/μl，此时的dna样本作为本次实施例应用样本，保存条件为-20℃。
22.分光光度计法检测得出，提取的293细胞dna满足od260/od280介于1.8至2.0，od260/od230大于2.0，表明提取的293细胞dna完整无降解，且纯度合格。
23.取15支干净的1.5ml离心管，其中5支分别加入90μl含溴酚蓝的稀释液，另外5支中分别加入90μl含二甲苯青的稀释液，最后5支加入90μl超纯水。实验开始前，使用超纯水，将30ng/μl的293细胞dna样本按照10倍梯度进行稀释，得到3000pg/μl、300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl的梯度稀释样本，分别将此梯度样本按照10μl样本+90μl稀释液的比例，加入至已经添加90μl不同溶液的1.5ml离心管中，震荡混匀后，瞬时离心，用作qpcr反应dna模板样本，此时的293细胞dna样本浓度分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl、0.03pg/μl。
24.2、实时荧光定量pcr：实时荧光定量pcr在abi7500上进行，测试上样样本为经过稀释之后的293细胞dna样本，样本浓度分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl、0.03pg/μl，每个样本设置2重复。
25.每个重复体系为30μl，包括10μl不同浓度的293细胞dna样本模板，9.1μl灭菌超纯水、上下游引物各1μl、探针0.5μl、abstar taq酶0.5μl、5倍的反应缓冲液6μl、1.5μl dntp 混合液、0.4μlrox染料；其中，这些引物探针在30μl体系中的终浓度为：上下游引物0.33μm，探针0.167μm；上游引物核苷酸序列如seq id no：1所示，具体为：5'-ccttcctgtgtccatgtgat-3'；下游引物核苷酸序列如seq id no：2所示，具体为：5'-gatgagttatgtccttgtag-3'；探针的核苷酸序列如seq id no：3所示，具体为：fam-tgttcaattccactatagtgagaa-bhq1。
26.表1
27.反应程序如上表1。
28.荧光定量pcr中，样本检测ct值与样本浓度成反比，样本浓度越高，检测ct值越小。添加二甲苯青或者溴酚蓝之后，扩增曲线相比较于未添加色素的样本扩增均有提前。
29.表2
30.表3
31.如上表2与表3所示，与未添加色素的对照组相比，添加色素后，检测ct值明显提前，且回算浓度与理论浓度相比超出15%，表明此浓度色素添加对qpcr的检测存在较大影响。
32.实施例3：分别选取实施例1中的二甲苯青和溴酚蓝最后稀释40倍（对应浓度为1/800000g/ml）的溶液作为dna样本稀释液备用。
33.其他步骤参照实施例2，实验结果如下：荧光定量pcr中，样本检测ct值与样本浓度成反比，样本浓度越高，检测ct值越小。扩增ct值与未添加色素对照较为接近，添加色素物质之后，扩增曲线相比较于未添加色素的样本扩增性能相当，且曲线拟合较好。表明先将色素先稀释至1/800000g/ml后，再以9:1的比例与待测dna模板样本进行混合，肉眼可见明显颜色，且不影响qpcr扩增反应。
34.表4
35.表5
36.如上表4与表5所示，与未添加色素的对照组相比，添加色素后，回算浓度偏差均在10%以内，表明此浓度色素添加未对qpcr的检测存在较大影响。
37.实施例4：分别选取实施例1中的二甲苯青和溴酚蓝最后稀释20倍（对应浓度为1/400000g/ml），然后将二者按照1:1的比例混合后的溶液作为dna样本稀释液备用。
38.其他步骤参照实施例2，实验结果如下：荧光定量pcr中，样本检测ct值与样本浓度成反比，样本浓度越高，检测ct值越小。扩增ct值与未添加色素对照较为接近，添加色素物质之后，扩增曲线相比较于未添加色素的样本扩增性能相当，且曲线拟合较好。表明包含浓度为1/800000g/ml二甲苯青和浓度为1/800000g/ml溴酚蓝混合液，再以9:1的比例与待测dna模板样本进行混合，肉眼可见明显颜色，且不影响qpcr扩增反应。
39.表6
40.如上表6所示，与未添加色素的对照组相比，添加两种色素后，回算浓度偏差均在10%以内，表明此浓度色素添加未对qpcr的检测存在较大影响。
41.实施例5：实施例3和实施例4的dna样本稀释液肉眼观察比较。
42.1、选取实施例4的样本稀释液将其按照300μl、200μl、100μl、50μl装量依次分装，并与300μl装量的未添加色素试剂进行对比，结果发现：相比较于未添加色素的300μl装量样本，50μl微量液体也能表现出较高的可辨识度，这样就防止实际使用过程中因体积过少或在隔离环境中操作引起的观察不佳、操作失误等现象。
43.2、选取实施例3的样本稀释液将其按照300μl、200μl、100μl、50μl装量依次分装，
与实施例4对应体积的试剂进行对比，结果发现，相较于实施例3，实施例4中同体积的微量液体能表现出更高的可辨识度。
44.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
45.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，包括：待测dna样本模板，其特征在于，所述待测dna样本模板的稀释液中含有惰性染料物质，所述惰性染料物质的浓度范围为：1/800000~1/1600000g/ml，所述的惰性染料物质包括两种，且二者的质量比例为1:1。2.根据权利要求1所述的一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，其特征在于，所述的惰性染料物质包括溴酚蓝、靛蓝、甲酚红、橙黄或二甲苯青中的任意一种。3.根据权利要求2所述的一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，其特征在于，所述惰性染料物质的浓度为1/800000g/ml。4.根据权利要求3所述的一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，其特征在于，所述的惰性染料物质包括溴酚蓝和二甲苯青。5.根据权利要求1所述的一种qpcr反应程序中指示溶液存在的方法，其特征在于，所述qpcr反应程序中荧光通道为fam、hex/vic、rox、cy3中的任意一种。

技术总结
本发明涉及qPCR技术领域，具体公开了一种qPCR反应程序中指示溶液存在的方法。待测DNA样本模板的稀释液中含有惰性染料物质，所述惰性染料物质的浓度范围为：1/800000~1/1600000g/mL，对常见荧光定量PCR检测的FAM、HEX/VIC、ROX、CY3等荧光通道信号收集没有显著影响。通过适量添加该组合物，反应试剂组分液体呈现蓝色或蓝绿色，肉眼明显可见，在多种实验操作场景下，可有效提高肉眼识别水平，提高操作效率，减少操作的误差。减少操作的误差。


技术研发人员：张鹏程 陈敏 陈旭 陈刚
受保护的技术使用者：苏州依科赛生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/7