一种用于结直肠癌治疗的shPD-L1/DTX共载型靶向递送制剂及其制备方法和应用

一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于靶向纳米药物递送系统技术领域，具体涉及一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.结直肠癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率在全球恶性肿瘤发病率中排名第四位，死亡率居恶性肿瘤死因的第二位，且呈上升趋势，严重危害人类生命和健康。近年来，程序性细胞死亡受体配体-1（programmed cell death-ligand 1，pd-l1）参与肿瘤免疫而在癌症治疗领域受到广泛关注。pd-l1又称cd274，是免疫反应中重要的负性调控因子，在结直肠癌、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤中高表达，癌细胞通过pd-1/pd-l1通路逃离t细胞介导的免疫监视。目前，关于pd-l1的药物研发已广泛开展，阻断pd-l1介导的肿瘤耐受亦成为肿瘤治疗的研究热点。尽管多种上市的pd-l1抗体药物对某些癌症治疗确实有益，但是由于恶性肿瘤具有浸润性快速生长、容易转移和复发等特点，仅靠单一用药，难以实现治疗肿瘤的同时又兼顾患者的生存质量。因此，利用不同治疗方式的疗效叠加/协同提高总体疗效成为一种有效的解决方案，例如：基因药物shpd-l1和化学药物联合治疗。
3.多西他赛（docetaxel，dtx）是一种从红豆杉树皮中提取的二萜生物碱类化合物，可通过诱导和促进微管蛋白聚合，抑制解聚，从而抑制肿瘤细胞有丝分裂，达到治疗癌症的目的。作为一种广谱抗癌药物，dtx对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤和淋巴瘤等多种肿瘤均有疗效。但是，由于水溶性差、生物利用度低、毒副作用大和注射剂辅助溶剂引起的过敏反应等，dtx在临床应用中面临众多问题。本发明采用合成的阳离子高聚物ddmat-pdeam-co-pcb-s-s-pcl（dssp）制备纳米胶束，负载疏水性药物dtx，解决dtx水溶性差和毒副作用大的问题，然后通过静电吸附作用吸附shpd-l1实现shpd-l1/dtx共载，外层包裹阴离子生物活性多糖透明质酸用于保护shpd-l1和实现cd44+肿瘤（如：结直肠癌）主动靶向，最终构建得到shpd-l1/dtx共载型纳米制剂ha/shpd-l1/dtx/dssp（hpddssp），将基因药物shpd-l1和化学药物dtx靶向共递送至结直肠癌，减少对正常组织的毒副作用。同时发挥shpd-l1和dtx的抗结直肠癌治疗作用，有望提高shpd-l1和dtx的抗癌治疗效果，并减少毒副作用，目前尚没有该方面的相关文献报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂及其制备方法，该方法制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂应用于结直肠癌治疗，能够实现基因药物shpd-l1和化学药物dtx对结直肠癌靶向递送及治疗。
5.本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂，其特征在于：首先将dtx负载于dssp胶束中得到dtx/dssp纳米胶束，该dtx/dssp纳米胶束中dtx的重量百分含量为2%-20%，然后将shpd-l1通过静电吸附作
用负载于dtx/dssp纳米胶束表面形成shpd-l1/dtx/dssp纳米粒，该shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中shpd-l1的重量百分含量为1%-5%；最后将透明质酸包裹于shpd-l1/dssp/dtx纳米粒外层用于实现cd44高表达肿瘤主动靶向和保护shpd-l1，最终形成ha/shpd-l1/dtx/dssp共载型靶向递送纳米制剂，该ha/shpd-l1/dtx/dssp共载型靶向递送纳米制剂中透明质酸的重量百分含量为10%-60%。
6.进一步限定，所述shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中shpd-l1干扰序列为：gacctatatgtggtagagtatttcaagagaatactctaccacatataggtctt，如seq id no.1所示，所用载体为psgu6/gfp/neo。
7.本发明所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂的制备方法，其特征在于具体过程为：将dtx和dssp溶解于丙酮或四氢呋喃中，在搅拌条件下匀速滴加去离子水中，于室温继续搅拌得到dtx/dssp纳米胶束溶液；将shpd-l1加至dtx/dssp纳米胶束溶液中，混匀后静置得到shpd-l1/dtx/dssp纳米粒；将透明质酸溶解于去离子水中得到透明质酸浓溶液，取shpd-l1/dtx/dssp纳米粒并加入透明质酸浓溶液，混匀后静置得到ha/shpd-l1/dtx/dssp（hpddssp）共载型靶向递送纳米制剂。
8.本发明所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂用于静脉给药后靶向递送至结直肠癌，用于结直肠癌靶向治疗。
9.本发明所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
10.本发明与现有技术相比具有以下有益效果和优点：（1）本发明制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂，实现shpd-l1和dtx共载，制备方法简单易行；（2）本发明制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂，体外红细胞溶血率低，体外和体内生物安全性高，且能显著降低化学药物dtx的毒副作用；（3）本发明制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂，具有cd44+肿瘤（如：结直肠癌）主动靶向，以及肿瘤微环境中高透明质酸酶、谷胱甘肽和活性氧的多功能响应性；（4）本发明制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂，可显著提高shpd-l1和dtx的体外和体内抗结直肠癌疗效。
11.综上所述，本发明制备shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂并应用于抗结直肠癌治疗，不仅为临床提供高效的基因药物和化学药物靶向共递送体系，更为结直肠癌及其它肿瘤治疗提供新的思路和策略。
附图说明
12.图1为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂的粒径和电位图，平均粒径和pdi值分别为164.1
ꢀ±ꢀ
2.318nm和0.17
ꢀ±ꢀ
0.01，电位为-26.8
ꢀ±ꢀ
0.2mv。
13.图2为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂的对红细胞的影响及溶血率测定。
14.图3为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性评估中对小鼠体重的影响。
15.图4为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性评估中对小鼠血生化和血常规各个指标的影响。
16.图5为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性评
估中对小鼠主要组织（心、肝、脾、肺和肾）的影响（h&e）。
17.图6为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂结直肠癌肿瘤细胞摄取。
18.图7为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂荷瘤小鼠活体成像（a）、肿瘤组织荧光定量（b）、离体组织（心、肝、脾、肺、肾和肿瘤）成像（c）、离体组织荧光定量（d）和离体肿瘤组织冰冻切片荧光拍照（e）。
19.图8为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂肿瘤微环境多功能响应粒径和体外释放数据。
20.图9为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂肿瘤微环境多功能响应tem拍摄图。haase（110 iu/ml，b）、haase+gsh（10mm，c）和haase+h2o2（10mm，d）分别作用于本发明制备的靶向递送纳米制剂（a）2h，tem观察并拍照。
21.图10为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂体外抗结直肠癌治疗效果（mtt）。
22.图11为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂体内抗结直肠癌治疗小鼠体重（a）、瘤重（b）、瘤体积及代表性离体瘤拍照（c）、各个治疗组瘤体积变化（d-h）和肿瘤组织pd-l1免疫组化、h&e、ki67免疫组化和tunel检测（i）。
具体实施方式
23.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
24.称取dssp（98mg）、dtx（2mg）溶解于2ml丙酮中，缓慢匀速滴加100ml去离子水中，磁力搅拌12h得到dtx/dssp溶液。待丙酮挥发完全后，得到dtx/dssp纳米粒。取200μl dtx/dssp溶液，加入shpd-l1（2μg）混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx/dssp纳米粒。再在shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中加入30μl的ha水溶液（4mg/ml），混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂。
实施例
25.称取dssp（96mg）、dtx（4mg）溶解于2ml丙酮中，缓慢匀速滴加100ml去离子水中，磁力搅拌12h得到dtx/dssp溶液。待丙酮挥发完全后，得到dtx/dssp纳米粒。取200μl dtx/dssp溶液，加入shpd-l1（2.5μg）混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx/dssp纳米粒。再在shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中加入15μl的ha水溶液（4mg/ml），混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂。
实施例
26.称取dssp（80mg）、dtx（20mg）溶解于2ml丙酮中，缓慢匀速滴加100ml去离子水中，磁力搅拌12h得到dtx/dssp溶液。待丙酮挥发完全后，得到dtx/dssp纳米粒。取200μl dtx/
dssp溶液，加入shpd-l1（10μg）混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx/dssp纳米粒。再在shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中加入5μl的ha水溶液（4mg/ml），混匀后静置30min，得到shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂。
27.表1 模拟肿瘤微环境，dtx从制剂中的累计释放量条件累计释放量（%）ph7.445.41
±
1.00ph6.848.18
±
1.08ph6.8+haase75.38
±
2.33ph5.066.30
±
2.39ph5.0+haase79.60
±
4.52ph5.0+haase+gsh92.28
±
4.20ph5.0+haase+h2o298.07
±
2.99图1为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂的粒径和电位图，平均粒径和pdi值分别为164.1
ꢀ±ꢀ
2.318nm和0.17
ꢀ±ꢀ
0.01，电位为-26.8
ꢀ±ꢀ
0.2mv。
28.图2为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂的对红细胞的影响及溶血率测定。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂溶血率《5%，可用于尾静脉注射给药。
29.图3为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性评估中对小鼠体重的影响。t检验结果显示，游离dtx组小鼠体重和对照组具有统计学差异（p 《 0.05），体重分别为24.2
ꢀ±ꢀ
3.50g和30.5
ꢀ±ꢀ
1.65g；其余无统计学差异，说明共载型靶向递送纳米制剂能够减轻化学药物dtx的毒副作用。
30.图4为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性中对小鼠血生化和血常规各个指标的影响。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂对血液各个指标无显著影响。
31.图5为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂生物安全性评估中对小鼠主要组织（心、肝、脾、肺和肾）的影响（h&e）。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂组实验动物主要组织无明显病理变化。
32.图6为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂结直肠癌肿瘤细胞摄取。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂较游离荧光探针组细胞摄取能力较强；ha预处理结直肠癌细胞30min，纳米制剂摄取能力有所降低；提示该靶向递送纳米制剂显著提高药物的肿瘤细胞摄取能力，且由于ha-cd44受体配体作用具有结直肠癌主动靶向能力。
33.图7为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂荷瘤小鼠活体成像（a）、肿瘤组织荧光定量（b）、离体组织（心、肝、脾、肺、肾和肿瘤）成像（c）、离体组织荧光定量（d）和离体肿瘤组织冰冻切片荧光拍照（e）。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂可显著增加荧光探针在肿瘤部位的积累，具有显著的结直肠癌肿瘤主动靶向能力；降低荧光探针在肝和肾部位的积累，可降低肝脏和肾脏毒性，延长药物体内作用时间；增强肿瘤组织渗透能力，可通过ha-haase作用深入渗透至肿瘤组织内部，提高肿瘤治疗效果。
34.图8为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂肿瘤微环境多功能响应粒径和体外释放数据。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂具有显著的haase、gsh
和ros响应能力，可在偏酸性、高透明质酸酶、高谷胱甘肽和高活性氧（肿瘤组织典型特征）环境中释放药物。
35.图9为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂肿瘤微环境多功能响应tem拍摄图。haase（110 iu/ml，b）、haase+gsh（10 mm，c）和haase+h2o2（10mm，d）分别作用于本发明制备的靶向递送纳米制剂（a）2 h，tem观察并拍照。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂具有显著的haase、gsh和ros响应能力，其自主装形态可在haase、haase+gsh和haase+h2o2发生解聚，进而释放基因和化学药物。
36.图10为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂体外抗结直肠癌治疗效果（mtt）。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂可显著增加基因药物shpd-l1和化学药物dtx的体外抗结直肠癌疗效。
37.图11为本发明实施例2制备的shpd-l1/dtx共载型靶向递送纳米制剂体内抗结直肠癌治疗小鼠体重（a）、瘤重（b）、瘤体积及代表性离体瘤拍照（c）、各个治疗组瘤体积变化（d-h）和肿瘤组织pd-l1免疫组化、h&e、ki67免疫组化和tunel检测（i）。结果显示：制备的靶向递送纳米制剂可显著提高结直肠癌疗效，抑制肿瘤组织中pd-l1表达和肿瘤细胞增殖，提高肿瘤细胞凋亡和死亡比例。
38.以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
39.sequence listing《110》 新乡医学院《120》 一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂及其制备方法和应用《160》1《170》patentin version 3.3《210》seq id no:1《211》53《212》dna《213》 人工序列（artificial sequence）《400》seq id no:1gacctatatg tggtagagta tttcaagaga atactctacc acatataggt ctt 53

技术特征：
1.一种用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂，其特征在于：首先将dtx负载于dssp胶束中得到dtx/dssp纳米胶束，该dtx/dssp纳米胶束中dtx的重量百分含量为2%-20%，然后将shpd-l1通过静电吸附作用负载于dtx/dssp纳米胶束表面形成shpd-l1/dtx/dssp纳米粒，该shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中shpd-l1的重量百分含量为1%-5%；最后将透明质酸包裹于shpd-l1/dssp/dtx纳米粒外层用于实现cd44高表达肿瘤主动靶向和保护shpd-l1，最终形成ha/shpd-l1/dtx/dssp共载型靶向递送纳米制剂，该ha/shpd-l1/dtx/dssp共载型靶向递送纳米制剂中透明质酸的重量百分含量为10%-60%。2. 根据权利要求1所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂，其特征在于：所述shpd-l1/dtx/dssp纳米粒中shpd-l1干扰序列如seq id no.1所示，所用载体为psgu6/gfp/neo。3.一种权利要求1所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂制备方法，其特征在于具体过程为：将dtx和dssp溶解于丙酮或四氢呋喃中，在搅拌条件下匀速滴加去离子水中，于室温继续搅拌得到dtx/dssp纳米胶束溶液；将shpd-l1加至dtx/dssp纳米胶束溶液中，混匀后静置得到shpd-l1/dtx/dssp纳米粒；将透明质酸溶解于去离子水中得到透明质酸浓溶液，取shpd-l1/dtx/dssp纳米粒并加入透明质酸浓溶液，混匀后静置得到ha/shpd-l1/dtx/dssp共载型靶向递送纳米制剂。4.权利要求1或2所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂用于静脉给药后靶向递送至结直肠癌，用于结直肠癌靶向治疗。5.权利要求1或2所述的用于结直肠癌治疗的shpd-l1/dtx共载型靶向递送制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于结直肠癌治疗的shPD-L1/DTX共载型靶向递送制剂及其制备方法和应用，将DTX负载于DSSP胶束中得到DTX/DSSP纳米胶束；将shPD-L1通过静电吸附作用负载于DTX/DSSP纳米胶束表面形成shPD-L1/DTX/DSSP纳米粒；将透明质酸包裹于shPD-L1/DSSP/DTX纳米粒外层形成shPD-L1/DTX共载型靶向递送纳米制剂。本发明制备的共载型靶向递送制剂不仅实现基因药物shPD-L1和化学药物DTX共载，而且具有CD44+肿瘤主动靶向能力，可将shPD-L1和DTX共同靶向递送至结直肠癌，提高结直肠癌治疗效果。果。果。


技术研发人员：侯雪艳 史永利 白金涛 上官璟芳 马素英 阎玺庆 杨雪 张涛
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：2023.07.03
技术公布日：2023/10/7