菌酶协同剂及其在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用的制作方法

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1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种菌酶协同剂及其在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用。


背景技术：

2.我国蛋白饲料资源，尤其是优质蛋白饲料原料严重短缺，粮油饲料资源需求量达3.5亿，进口量达到1/3，居世界第一。我国棉花种植面积超过3000khm2以上，除棉花外，棉花的种子-棉籽，是重要的油料来源。经过机械提油后，每吨棉籽可产生45％左右的棉籽饼粕副产物。棉籽粕中粗蛋白含量约为35～47％，仅次于豆粕(42～48％)，经过水解后可得到17种氨基酸，氨基酸组成比例优于其他饼粕，除蛋氨酸含量稍显不足外，其他几种氨基酸均达到国际粮农组织(fao)推荐标准。棉籽粕还富含维生素，尤其是维生素e和b1含量较高。同时，棉籽粕价格相对价廉，是优质蛋白饲料的潜在代替品。
3.中国专利申请cn107058435a公开了一种从棉籽粕中提取蛋白质的方法，其步骤包括：a、将棉籽粕粉碎后兑水混合，进行离心分离；b、过滤溶液，除去残渣，再进行碱溶，并加入蛋白酶，加热保持温度在40-50℃，溶液ph值在7.5-8.0，加热时间在3-5h；c、将温度快速升至80-90℃，进行灭菌灭酶处理后停止加热；d、再向溶液中加入氯化钠，搅拌均匀后，将溶液进行浓缩、干燥，即可得到棉籽粕中的蛋白质。中国专利申请cn101121744a公开了一种脱酚棉籽蛋白萃取方法，是以脱绒、剥壳、调质、轧坯、烘干后的棉仁坯片为原料，以极性溶剂和非极性溶剂为萃取剂，集中在一个容器内连续加入原料和分步连续加入两种萃取剂，经过低温浸提、分离得到混合油、混合酚液和湿粕，混合油再经全负压蒸发浓缩得到毛棉油，混合酚液经真空精馏浓缩得到棉酚浓缩液，湿粕经真空脱溶、调质，得到脱酚棉籽蛋白。
4.然而，棉籽粕中含有的内源性毒素-游离棉酚，不仅阻碍营养物质的消化吸收，还会给动物的生长、发育、繁殖等方面带来负面影响，严重制约棉籽粕在畜禽生产中的应用。而且棉籽粕中含有的难溶性蛋白质不易降解，不利于提高畜禽胃肠道的有效吸收与消化。上述问题已成为本领域亟需解决的共性问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种菌酶协同剂及其在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用，以解决棉籽粕作为畜禽饲料中棉酚含量高、可溶性蛋白含量低的问题。本发明通过以开菲尔菌群、枯草芽孢杆菌协同蛋白酶共同发酵棉籽粕，可以显著提高棉籽粕发酵液中水溶性蛋白含量，降低棉酚的含量，从而改善棉籽粕发酵的品质，推动棉籽粕蛋白饲料对进口优质饲料的部分替代。
6.本发明的技术方案是：
7.一种菌酶协同剂，包括复合菌剂和蛋白酶，所述复合菌剂包括开菲尔菌群和枯草芽孢杆菌。
8.进一步地，所述复合菌剂中开菲尔菌群和枯草芽孢杆菌的质量比为1:0.5～1:2。
9.进一步地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
10.进一步地，所述复合菌剂和蛋白酶的质量比为6～14：0.5～5。
11.本发明的另一目的在于提供所述的菌酶协同剂在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用。
12.本发明的再一目的在于提供菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，包括以下步骤：
13.将上述菌酶协同剂接种至棉籽粕发酵基，发酵，具体步骤为：
14.(1)制备开菲尔菌群种子液：将冷藏保存的开菲尔菌群按1～5％的接种量接种于lb液体培养基中培养，在28～35℃，100～180r/min条件下发酵12～16h；
15.(2)制备枯草芽孢杆菌种子液：将冷藏保存的枯草芽孢杆菌菌种按1～5％的接种量接种于lbs液体培养基中培养，在30～40℃，200～250r/min条件下发酵8～12h；
16.(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按一定质量比进行混匀，接种至棉籽粕液态发酵培养基中，添加蛋白酶，在25℃～35℃，150～250r/min条件下发酵6～36h，得发酵后棉籽粕。
17.进一步地，所述步骤(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1：0.5～1：2的质量比进行混匀。
18.进一步地，所述步骤(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1：2的质量比进行混匀。
19.进一步地，所述步骤(3)按接种量6～14％接种至棉籽粕液态发酵培养基中。
20.进一步地，所述步骤(3)蛋白酶的添加量为棉籽粕液态发酵培养基质量的0.5～5％。
21.开菲尔菌群为商业菌株，购买自北京川秀科技有限公司，为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌的混合物。
22.与现有技术相比，本发明具有以下优势：
23.(1)本发明提供了一种操作简单、简便易行、温和的微生物复合菌群结合蛋白酶解水解棉籽粕蛋白的方法。
24.(2)本发明提供的菌酶协同发酵方法，利用开菲尔菌群中的乳杆菌、酵母菌的共同作用，能将游离棉酚降解为无毒性酚类物质，使棉籽粕中游离棉酚的含量降低，同时生成的小分子酚类物质具有显著的抗血管紧张酶的抑制作用与抗氧化作用。
25.(3)本发明提供的菌酶协同发酵方法，开菲尔菌群中酵母菌与枯草芽孢杆菌是优良的微生物蛋白质来源，同时结合蛋白酶酶解作用将难溶性蛋白质降解为水溶性的多肽与小肽，有效提高棉籽粕饲料中水溶性蛋白的含量，有助于提高畜禽胃肠道的有效吸收与消化。
26.(4)本发明提供的菌酶协同发酵方法，开菲尔菌群中的乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌与枯草芽孢杆菌协同发酵，形成代谢产物的互相转化与利用，生成多种有益的小分子挥发性脂肪酸、小肽等，作为饲料优良的能量来源。
附图说明：
27.图1为不同开菲尔菌与枯草芽孢杆菌比例对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性
蛋白含量的影响图；
28.图2为不同菌株接种量对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量的影响图；
29.图3为不同发酵时间对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量的影响图；
30.图4为发酵前后棉籽粕的ace抑制剂活性与dpph自由基淬灭活性的比较。
具体实施方式
31.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
32.本发明中所用原料如无特殊说明均为市售。如枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌atcc6633，购买于上海保藏生物技术中心。碱性蛋白酶，购买自合肥千盛生物科技有限公司，cas：9014-01-1，碱性蛋白酶活力150～200u/mg。
33.实施例1、一种菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法
34.所述菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，包括以下步骤：
35.(1)制备开菲尔菌群种子液：将冷藏保存的开菲尔菌群按1％的接种量接种于lb液体培养基中培养，在28℃，100r/min条件下发酵12h，所述lb液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l；所述lb液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lb液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，121℃灭菌20min；
36.(2)制备枯草芽孢杆菌种子液：将冷藏保存的枯草芽孢杆菌菌种按1％的接种量接种于lbs液体培养基中培养，在30℃，250r/min条件下发酵12h，所述lbs液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l；所述lbs液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lbs液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l，调节ph至7.2，121℃灭菌20min；
37.(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1:0.5、1:1、1:2、1:3或1:4的质量比进行混匀，按接种量6％接种至棉籽粕液态发酵培养基中(2％棉籽粕的水溶液)，添加棉籽粕液态发酵培养基质量0.5％的碱性蛋白酶，在25℃，150r/min条件下发酵18h。
38.实施例2、一种菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法
39.所述菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，包括以下步骤：
40.(1)制备开菲尔菌群种子液：将冷藏保存的开菲尔菌群按1％的接种量接种于lb液体培养基中培养，在35℃，180r/min条件下发酵16h，所述lb液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l；所述lb液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lb液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，121℃灭菌20min；
41.(2)制备枯草芽孢杆菌种子液：将冷藏保存的枯草芽孢杆菌菌种按1％的接种量接种于lbs液体培养基中培养，在40℃，250r/min条件下发酵16h，所述lbs液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l；所述lbs液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lbs液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l，调节ph至7.2，121℃灭菌20min；
42.(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1:2的质量比进行混匀，按接种量6％、8％、10％、12％或14％接种至棉籽粕液态发酵培养基中(含2％棉籽粕)，添加棉籽粕液态发酵培养基质量5％的碱性蛋白酶，在35℃，250r/min条件下发酵36h。
43.实施例3、一种菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法
44.所述菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，包括以下步骤：
45.(1)制备开菲尔菌群种子液：将冷藏保存的开菲尔菌群按1％的接种量接种于lb液体培养基中培养，在32℃，140r/min条件下发酵14h，所述lb液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l；所述lb液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lb液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，121℃灭菌20min；
46.(2)制备枯草芽孢杆菌种子液：将冷藏保存的枯草芽孢杆菌菌种按1％的接种量接种于lbs液体培养基中培养，在35℃，250r/min条件下发酵15h，所述lbs液体培养基的成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l；所述lbs液体培养基的配制方法为：用蒸馏水配制lbs液体培养基，其中蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，可溶性淀粉20g/l，调节ph至7.2，121℃灭菌20min；
47.(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1:2的质量比进行混匀，按接种量8％接种至棉籽粕液态发酵培养基中(含2％棉籽粕)，添加棉籽粕液态发酵培养基质量2％的碱性蛋白酶，在28℃，250r/min条件下发酵6h、12h、18h、24h、30h或36h。
48.试验例一、游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量检测
49.1、实验样品：采用实施例1-3的方法发酵后棉籽粕。
50.2、实验方法：参照标准gb/t 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》对实验样品中水溶性蛋白含量进行检测。参照标准gbt13086-2020《饲料中游离棉酚的测定方法》对实验样品中游离棉酚含量进行检测。实施例1中将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1:0.5、1:1、1:2、1:3或1:4的质量比进行混匀，记为开菲尔菌:枯草芽孢杆菌比例分别为1:0.5、1:1、1:2、1:3或1:4。
[0051][0052]
3、实验结果如表1以及图1-4所示。
[0053]
表1：棉酚脱除效果与水溶性蛋白含量检测结果
[0054][0055][0056]a:游离棉酚含量为三次平行实验数据的平均值
[0057]b:水溶性蛋白含量为三次平行实验数据的平均值
[0058]
不同开菲尔菌与枯草芽孢杆菌比例对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量的影响图如图1所示。由图1以及表1可以看出，开菲尔菌与枯草芽孢杆菌的质量比对发酵后棉籽粕的水溶性蛋白含量有很大影响，只有当开菲尔菌与枯草芽孢杆菌的质量比在1:0.5～1:2范围内，才能达到显著的提高棉籽粕发酵液中水溶性蛋白含量以及降低游离棉酚的含量的效果。
[0059]
不同菌株接种量对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量的影响图如图2所示。由图2以及表1可以看出，微生物接种量对发酵后棉籽粕的水溶性蛋白含量有很大影响，只有当接种量范围在8～14％时，才能达到显著的提高棉籽粕发酵液中水溶性蛋白含量以及降低棉酚的含量的效果。
[0060]
不同发酵时间对发酵棉籽粕游离棉酚去除率与水溶性蛋白含量的影响图如图3所示。由图3以及表1可以看出，发酵时间对发酵后棉籽粕的棉酚去除率、水溶性蛋白含量有很大影响，只有当发酵时间在18～36h时，才能达到显著的提高棉籽粕发酵液中水溶性蛋白含
量以及降低棉酚的含量的效果。
[0061]
由此可见，发酵条件的优化需要同时考虑到对棉酚的去除与水溶性蛋白含量两个变量的影响，需要兼顾棉酚的去除率与水溶性蛋白含量。
[0062]
试验例二、ace抑制活性与dpph自由基淬灭活性
[0063]
1、实验样品：发酵前棉籽粕、实施例3发酵30h后棉籽粕。
[0064]
2、实验方法：
[0065]
采用aigma-aldrich检测试剂盒(货号cs0002)，参照试剂盒说明书，检测实验样品的血管紧张素转换酶(iace)抑制活性。参照标准gb/t 39100-2020《多肽抗氧化性测定—dpph和abts法》检测实验样品的dpph活性。
[0066]
3、实验结果如图4所示。
[0067]
发酵前后棉籽粕的ace抑制剂活性与dpph自由基淬灭活性的比较如图4所示。由图4可以看出，采用本发明实施例3发酵后棉籽粕发酵液较未发酵棉籽粕的抗iace与dpph活性均有显著提升。由此可见，采用本发明方法能够使生成的小分子酚类物质具有显著的抗血管紧张酶的抑制作用与抗氧化作用。

技术特征：
1.一种菌酶协同剂，其特征在于，包括复合菌剂和蛋白酶，所述复合菌剂包括开菲尔菌群和枯草芽孢杆菌。2.权利要求1所述的菌酶协同剂，其特征在于，所述复合菌剂中开菲尔菌群和枯草芽孢杆菌的质量比为1:0.5～1:2。3.权利要求1所述的菌酶协同剂，其特征在于，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。4.权利要求1所述的菌酶协同剂，其特征在于，所述复合菌剂和蛋白酶的质量比为6～14：0.5～5。5.如权利要求1-4任一项所述的菌酶协同剂在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用。6.一种菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4任一项所述菌酶协同剂接种至棉籽粕发酵基，发酵，具体步骤为：(1)制备开菲尔菌群种子液：将冷藏保存的开菲尔菌群按1～5％的接种量接种于lb液体培养基中培养，在28～35℃，100～180r/min条件下发酵12～16h；(2)制备枯草芽孢杆菌种子液：将冷藏保存的枯草芽孢杆菌菌种按1～5％的接种量接种于lbs液体培养基中培养，在30～40℃，200～250r/min条件下发酵8～12h；(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按一定质量比进行混匀，接种至棉籽粕液态发酵培养基中，添加蛋白酶，在25℃～35℃，150～250r/min条件下发酵6～36h，得发酵后棉籽粕。7.如权利要求6所述的菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1：0.5～1：2的质量比进行混匀。8.如权利要求7所述的菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)将步骤(1)所得开菲尔菌群种子液与步骤(2)所得枯草芽孢杆菌种子液按1：2的质量比进行混匀。9.如权利要求6所述的菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)按接种量6～14％接种至棉籽粕液态发酵培养基中。10.如权利要求6所述的菌酶协同发酵提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)蛋白酶的添加量为棉籽粕液态发酵培养基质量的0.5～5％。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种菌酶协同剂及其在提高棉籽粕水解可溶性蛋白含量的应用。本发明的菌酶协同剂，包括复合菌剂和蛋白酶，所述复合菌剂包括开菲尔菌群和枯草芽孢杆菌。本发明通过以开菲尔菌群、枯草芽孢杆菌协同蛋白酶共同发酵棉籽粕，可以显著提高棉籽粕发酵液中水溶性蛋白含量，降低棉酚的含量，从而改善棉籽粕发酵的品质，推动棉籽粕蛋白饲料对进口优质饲料的部分替代。蛋白饲料对进口优质饲料的部分替代。蛋白饲料对进口优质饲料的部分替代。


技术研发人员：刘国庆 陈小燕 崔志英 倪霜 赵大伟
受保护的技术使用者：广东希普生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/7