一种检测去甲肾上腺素的生物发光探针及其制备方法和用途

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测去甲肾上腺素的生物发光探针及其制备方法和用途。


背景技术：

2.近年来随着社会压力的增加，抑郁症患者的数量有了显着增加，全球范围内抑郁症患者已超过2.64亿。抑郁症与大脑中去甲肾上腺素(norepinephrine,ne)水平的下降密切相关，ne是合成单胺类儿茶酚胺类神经递质的中心物质，由多巴胺和肾上腺素在苯乙醇胺n-甲基转移酶(pmnt)的催化下合成。但是，去甲肾上腺素的结构与性质与另外两种儿茶酚胺神经递质—肾上腺素(epinephrine,ep)和多巴胺(dopamine,da)非常相似，因此特异性地捕捉并检测去甲肾上腺素充满了挑战。
3.关于检测生物体内去甲肾上腺素的方法正在不断发展，传统方法如比色法和放射免疫法干扰较多，无法满足生物样品的分析；随着分析仪器的发展，相继有了更灵敏特异的方法，如荧光光谱法、高效液相色谱与毛细管电泳法等，但是这些方法都存在不少问题，如：检测限达不到要求，检测灵敏度低，反应时间长，抗干扰能力差，不能用于活体动态可视化检测等。
[0004][0005]
山西大学化学化工学院的阴彩霞课题组(na z,fangjun h,yongkang y,and caixia y.specific fluorescent probe based on“protect-deprotect”tovisualize the norepinephrine signaling pathway and drug intervention tracers.j.am.chem.soc.2020,142,17751-17755.)报道了一种检测去甲肾上腺素的荧光探针，该探针可以特异性地检测去甲肾上腺素并对其进行体内成像。该报道采用了“保护-脱保护”策略：较长发射波长的花青(cyanine)染料被修饰上了水溶性磺酸盐，且被连接离去基团硫酚的碳酸酯保护；去甲肾上腺素中特殊的β-羟乙基胺部分可通过亲核取代和分子内亲核反应使保护基团离去，释放出荧光团，从而实现了去甲肾上腺素的特异性红色荧光检测。该报道还实现了钾离子刺激下去甲肾上腺素神经信号转导的成像，并首次对抗抑郁药刺激后大鼠大脑中的去甲肾上腺素水平进行实时荧光成像。但是，一方面，该荧光探针需要一定波长的入射光激发，导致其有光漂白、光刺激和激发光的背景干扰，同时引起激发光波长较短，较难透过深层组织，无法实现活体无创检测。另一方面，为了满足体内不同生理
环境下的应用需求，需要开发出一种在宽ph值范围内的生理环境下具有优异的发光稳定性的探针。
[0006]
因此，开发出一种不仅能够实现活体无创检测去甲肾上腺素，而且具有优异的发光稳定性的生物发光探针具有重要意义。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种不仅能够实现活体无创检测去甲肾上腺素，而且具有优异的发光稳定性的生物发光探针及其制备方法和用途。
[0008]
本发明提供了一种式i所示的化合物、或其盐、或其立体异构体：
[0009][0010]
其中，r1、r2、r3、r4、r5分别独立地选自氢、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基。
[0011]
进一步地，所述化合物如式ii所示：
[0012][0013]
其中，r1、r3、r4、r5分别独立地选自氢、羧基、c1～c3烷基。
[0014]
进一步地，所述化合物的结构式如式iii所示：
[0015][0016]
本发明还提供了式iii所示的化合物的制备方法，它包括如下步骤：
[0017]
[0018]
步骤1：将原料i、原料ii与原料iii在有机溶剂中反应，得到中间体iv；
[0019]
步骤2：将中间体ⅳ与d-半胱氨酸在溶剂中反应，得到式iii所示化合物。
[0020]
进一步地，步骤1中，所述有机溶剂为甲苯，所述反应是在碱的存在下进行的，所述原料i、原料ii、原料iii和碱的摩尔比为(1～4)：(0.5～1)：(0.5～1)：(2～4)：所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为(2～4)：(20～40)mmol/ml；所述反应是在惰性气体氛围中进行的，所述反应的温度为0～120℃，反应的时间为1～7h；
[0021]
和/或，步骤2中，所述反应包括以下步骤：将中间体ⅳ溶于有机溶剂中，加入含d-半胱氨酸的甲醇水溶液，在惰性气体氛围中反应；所述中间体iv与d-半胱氨酸的摩尔比为(0.5～1)：(1～2)；所述有机溶剂为甲醇和二氯甲烷的混合溶液，中间体iv与有机溶剂的摩尔体积比为(0.5～1)：(10～20)mmol/ml；所述中间体iv与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为(0.5～1)：(3～6)mmol/ml；所述反应的温度为0～100℃，反应的时间为0.5～4h。
[0022]
进一步地，步骤1中，所述碱为有机碱；所述原料i、原料ii、原料iii和碱的摩尔比为1.2：1：1：2；所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为1.2：20mmol/ml；所述反应的温度为50～90℃，反应的时间为3～5h；
[0023]
和/或，所述步骤2中，中间体ⅳ与d-半胱氨酸的摩尔比为1：1；中间体iv与有机溶剂的摩尔体积比为0.5：5mmol/ml；中间体iv与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为1：4mmol/ml；所述甲醇和二氯甲烷的混合溶液中，甲醇和二氯甲烷的体积比为1：(1～3)；所述含d-半胱氨酸的甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为(1～2)：1；所述反应的温度为25℃，反应的时间为0.5h。
[0024]
进一步地，所述碱为三乙胺。
[0025]
本发明还提供了一种去甲肾上腺素特异性检测试剂盒，它包含上述的化合物、或其盐、或其立体异构体。
[0026]
本发明还提供了上述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备检测去甲肾上腺素的生物发光探针或试剂盒中的用途。
[0027]
进一步地，所述生物发光探针或试剂盒能够检测体外或体内的去甲肾上腺素水平。
[0028]
本发明的生物发光探针具有优异的稳定性，试验结果表明，在ph为1.0～7.4的范围内，本发明的生物发光探针都具有优异的稳定性，能够满足体内不同生理环境下的应用需求。本发明通过对本探针具体的合成方法学探究和尝试中，在第二步的合成后处理过程中，本发明采取低温萃取，低温旋干的方法，可以大大提高探针在水相及不同有机相的稳定性，最后探针保存于4℃冰箱中，使得探针可长时间保持稳定。
[0029]
本发明的生物发光探针采用了“turn-on”策略：d-luciferin(d-萤光素)底物离去碳酸酯连接基团硫酚；在去甲肾上腺素中β-羟乙基胺部分通过亲核取代和分子内亲核反应使保护基团离去，释放d-luciferin，在萤光素酶、atp、o2和mg
2+
的作用下，通过酶催化的化学反应，将生物体内的化学能转化为光能。
[0030]
本发明的生物发光探针对去甲肾上腺素具有高选择性和高响应性，能够特异性地识别去甲肾上腺素，其灵敏度高，检出限低，可用于去甲肾上腺素的精密检测。
[0031]
本发明的探针无需外部激发光，避免了光漂白、光刺激和激发光的背景干扰，具有
更高的灵敏度，同时由于该探针是通过把化学能转化为光能来达到检测目的，可实现活体无创检测。
[0032]
本发明首次实现了对抗抑郁药刺激后小鼠大脑中的去甲肾上腺素水平的实时活体无创检测，首次采用高灵敏度、实时监测、无侵入性的方法实现了对去甲肾上腺素的检测。本发明去甲肾上腺素生物发光探针能在活体水平对外源性去甲肾上腺素进行可视化追踪，去甲肾上腺素异常表达涉及神经、肿瘤、血压及心脏疾病相关疾病患者进行动态可视化分析，有利于临床上对去甲肾上腺素的检测，具有广阔的应用前景。
[0033]
本发明的生物发光探针制备方法简单，原料易得，适合扩大化生产。
[0034]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0035]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0036]
图1为实施例1制备的生物发光探针的1h nmr图谱。
[0037]
图2为实施例1制备的生物发光探针的
13
c nmr图谱。
[0038]
图3为实施例1制备的生物发光探针的esi-hrms图谱。
[0039]
图4为实施例1制备的生物发光探针的hplc图谱。
[0040]
图5为本发明生物发光探针对不同神经递质的选择情况。
[0041]
图6为本发明生物发光探针对不同浓度的去甲肾上腺素溶液的响应情况。其中，a图为探针溶液于不同浓度的去甲肾上腺素溶液中作用的生物发光强度，b图为探针在0-250μm的去甲肾上腺素溶液中的响应回归曲线。
[0042]
图7为小鼠注射外源性去甲肾上腺素或氟西汀溶液后生物发光信号情况。其中a图为氟西汀给药组与空白对照组对生物发光体系的影响，b图为氟西汀给药组与空白对照组生物强度量化，c图为去甲肾上腺素给药组与空白对照组对生物发光体系影响，d图为去甲肾上腺素给药组与空白对照组生物强度量化。
[0043]
图8为尾静脉注射0.2ml 100μm的去甲肾上腺素溶液和100μm生物发光探针溶液后，小鼠体内生物发光信号强度随时间的变化情况。其中a图为实验组与对照组在给予生物发光探针后生物发光强度随时间的变化，b图为实验组与对照组去甲肾上腺素随着时间变化的强度量化，c图为给予生物发光探针后第18min实验组与对照组生物发光强度量化比较。
[0044]
图9为小鼠体内生物发光信号强度随外源性去甲肾上腺素的变化情况。其中，a图为注射不同浓度去甲肾上腺素的实验组与对照组在给予生物发光探针后第18min的生物发光强度变化，b图为注射不同浓度去甲肾上腺素的实验组与对照组在给予生物发光探针后第18min的生物强度量化。
[0045]
图10为本发明生物发光探针在药物刺激去甲肾上腺素内源性生成小鼠中的成像情况。其中，a图为注射不同浓度氟西汀的实验组与对照组在给予生物发光探针后第18min的生物发光强度变化，b图为注射不同浓度氟西汀的实验组与对照组在给予生物发光探针
后第18min的生物强度量化。
具体实施方式
[0046]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0047]
实施例1、本发明生物发光探针的制备
[0048]
合成路线如下：
[0049][0050]
步骤1：将1.2mmol原料i与1mmol原料iii于20ml甲苯中中混合溶解，加入2mmol有机碱三乙胺(tea)，在氮气保护下于120℃反应3h，然后将反应体系冷却至50℃，加入1mmol原料ii，于50℃℃条件下反应2h，得到中间体ⅳ157mg，收率为62.3％。
[0051]
中间体ⅳ：mp:91.0-91.4℃.
11
h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.33(dd,j＝5.6,3.2hz,2h),7.67(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.33(d,j＝8.4hz,2h),2.36(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ206.75,171.22,150.27,149.34,137.48,136.26,125.22,123.12,115.82,113.24,37.48,29.45,27.83.
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ177.56,145.32,135.15,133.77,133.24,131.76,129.12,127.43,126.14,125.65,116.32,116.08,14.61.
[0052]
步骤2：将1mmol中间体ⅳ溶解于10ml甲醇和二氯甲烷的混合溶液中(甲醇和二氯甲烷的体积比为1:1.5)，然后在0℃下缓慢滴加4ml含1mmol d-半胱氨酸的甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)，在氮气保护下于25℃下反应0.5h，得含探针粗产物的反应液。将反应液用盐酸调节ph至5，析出固体后过滤、干燥，即得本发明生物发光探针49mg，收率为41.7％。
[0053]
本发明生物发光探针：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.90(d,j＝8.6hz,1h),7.49
–
7.41(m,3h),7.31(d,j＝7.8hz,2h),7.04(d,j＝8.6hz,1h),3.77
–
3.72(m,1h),3.53(dd,j＝9.6,8.6hz,2h),2.35(s,3h).
113
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ168.79,166.89,151.24,149.65,140.75,135.56,135.16,130.68,125.12,123.94,122.17,121.77,117.45,116.03,107.16,82.23,21.26.esi-ms calcd.for c
19h14
n2o4s3(m+h)
+
431.0116,found 431.0184.
[0054]
本发明生物发光探针的表征图谱见图1～4。
[0055]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0056]
试验例1、本发明生物发光探针对去甲肾上腺素的选择性
[0057]
1、试验方法
[0058]
(1)溶液的配制
[0059]
溶剂：50mm的tris-hcl缓冲溶液(ph 7.4，含10mm mgcl2)。
[0060]
生物发光探针溶液的配制：首先用dmso将实施例1制备的生物发光探针溶解，得到
浓度为10mm的探针储备液；然后利用溶剂tris-hcl缓冲溶液将探针储备液稀释成浓度为25μm的探针溶液。
[0061]
酶工作液的配制：60μg的商品化荧光素酶(luciferase)冰上溶于3ml tris-hcl缓冲溶液，加入2mm的atp，即得(现配现用)。
[0062]
(2)本发明生物发光探针对去甲肾上腺素选择性试验步骤
[0063]
分别准备含去甲肾上腺素(5mm)、甲肾上腺素(5mm)、多巴胺(5mm)、5-五羟色胺(5mm)、γ-氨基丁酸(5mm)、l-半胱氨酸(500μm)、同型半胱氨酸(100μm)、还原型谷胱甘肽(10μm)、赖氨酸(500μm)、丝氨酸(500μm)、苏氨酸(500μm)的神经递质溶液，前述神经递质溶液是将对应神经递质固体分别单独溶解于tris-hcl缓冲溶液所得，浓度均为25μm，是探针浓度的10倍。将50μl前述神经递质溶液分别与等体积浓度为25μm的探针溶液于96孔板37℃孵育30min，随后每个实验孔加入50μl酶工作液，加入酶工作液后1min之内立即用小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupled device，ccd)拍摄记录各孔的生物发光信号，测量孔板内的生物发光现象以及光子数变化情况。
[0064]
2、试验结果
[0065]
本发明生物发光探针对不同的神经递质的选择情况如图5所示。由图5可知：本发明生物发光探针对去甲肾上腺素的选择性很高，生物发光信号是其他神经递质的9倍以上。
[0066]
上述实验结果说明本发明生物发光探针对去甲肾上腺素具有优异的特异性和选择性，可用于检测去甲肾上腺素。
[0067]
试验例2、本发明生物发光探针对去甲肾上腺素的响应性
[0068]
1、试验方法
[0069]
(1)溶液的配制
[0070]
溶剂：50mm的tris-hcl缓冲溶液(ph 7.4，含10mm mgcl2)。
[0071]
去甲肾上腺素溶液的配制：利用上述溶剂配制去甲肾上腺素，得到不同浓度的去甲肾上腺素溶液，去甲肾上腺素浓度分别为0μm、1μm、2μm、5μm、10μm、25μm、50μm、100μm、250μm、500μm和1000μm。
[0072]
生物发光探针溶液的配制：按照试验例1所述的方法配制浓度为25μm的探针溶液，首先用dmso将实施例1制备的生物发光探针溶解，得到浓度为10mm的探针储备液；然后利用tris-hcl缓冲溶液将探针储备液稀释成浓度为25μm的生物发光探针溶液。
[0073]
酶工作液的配制：与试验例1相同。
[0074]
(2)本发明生物发光探针对去甲肾上腺素的响应性试验步骤
[0075]
将50μl生物发光探针溶液和50μl不同浓度的去甲肾上腺素溶液混合，于96孔板37℃孵育60min，随后每个实验孔加入50μl酶工作液，加入酶工作液后1min之内立即用小动物活体成像系统的ccd检测器拍摄记录各孔的生物发光信号，测量孔板内的生物发光现象以及光子数变化情况。
[0076]
2、试验结果
[0077]
本发明生物发光探针对不同浓度的去甲肾上腺素溶液的响应情况如图6所示。由图6可知：本发明生物发光探针对去甲肾上腺素的响应性很好，响应回归曲线说明在去甲肾上腺素浓度为0～250μm范围内，底物去甲肾上腺素与探针相互作用之后，所检测到的生物发光信号与去甲肾上腺素浓度呈现出良好的线性关系，r2＝0.991说明两者的相关性很强，
且探针对去甲肾上腺素的检测限可达1μm。
[0078]
上述实验结果说明本发明生物发光探针在检测去甲肾上腺素时灵敏度很高，可检测出浓度很低的去甲肾上腺素，可用于去甲肾上腺素的精密检测。
[0079]
试验例3、小鼠注射外源性去甲肾上腺素或氟西汀对生物发光体系的影响
[0080]
1、试验方法
[0081]
(1)试验动物：transgenic fvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。
[0082]
(2)试验分组：
[0083]
实验组(去甲肾上腺素或氟西汀)：先尾静脉注射0.2ml去甲肾上腺素溶液(生理盐水配制的去甲肾上腺素溶液(10mm)或氟西汀溶液(50mg/kg)，再尾静脉注射0.2ml市售羟基萤光素(50μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为50μm的溶液)，体内孵育10min；
[0084]
空白对照组(vehicle)：先腹腔注射0.2ml生理盐水，再腹腔注射0.2ml市售羟基萤光素(100μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为100μm的溶液)，体内孵育10min。
[0085]
(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupled device，ccd)每隔3min拍摄一次，持续30min，每次曝光时间1s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。
[0086]
2、试验结果
[0087]
小鼠注射外源性去甲肾上腺素或氟西汀溶液后生物发光信号如图7所示。由图7可知：实验组和空白对照组中小鼠的生物发光信号变化类似，组间无显著性差异。
[0088]
上述实验结果表明注射外源性去甲肾上腺素或氟西汀可对活体动物的生物发光成像无影响。
[0089]
试验例4、小鼠体内生物发光信号强度随外源性去甲肾上腺素浓度及时间变化
[0090]
1、试验方法
[0091]
(1)试验动物：transgenic fvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。
[0092]
(2)试验分组：
[0093]
实验组：尾静脉注射0.2ml含不同浓度的去甲肾上腺素溶液(生理盐水配制的去甲肾上腺素溶液，浓度分别为100μm、200μm和500μm)，再尾静脉注射等体积实施例1制备的生物发光探针溶液(100μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为10μm的溶液)；
[0094]
对照组(vehicle)：尾静脉注射0.2ml生理盐水，再尾静脉注射等体积实施例1制备的生物发光探针溶液(100μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为100μm的溶液)。
[0095]
(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupled device，ccd)每隔3min拍摄一次，持续60min，每次曝光时间1s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。
[0096]
2、试验结果
[0097]
小鼠体内生物发光信号强度随外源性去甲肾上腺素浓度的变化如图8和9所示。由图可知：对照组仅有微弱生物发光信号；而实验组有显著性增强的生物发光信号，该信号强度与外源性去甲肾上腺素浓度呈现正相关关系，且外源注射去甲肾上腺素小鼠的生物发光强度在18min达到最大。
[0098]
上述实验结果表明，本发明的生物发光探针能够用来可视化分析活体内外源性去甲肾上腺素水平动态变化。
[0099]
试验例5、本发明生物发光探针在药物刺激去甲肾上腺素内源性生成小鼠中的成像应用
[0100]
1、试验方法
[0101]
(1)试验动物：transgenic fvb-luc+mice(山东大学药学院提供，稳定表达luciferease的转基因小鼠，雄性，6～8周龄，22～26g)。
[0102]
(2)试验分组：
[0103]
实验组：根据参考文献(na z,fangjun h,yongkang y,and caixia y.specific fluorescent probe based on“protect-deprotect”tovisualize the norepinephrine signaling pathway and drug intervention tracers.j.am.chem.soc.2020,142,17751-17755.)利用氟西汀建立去甲肾上腺素高表达小鼠模型。实验组根据不同的氟西汀给药剂量分为：1mg/kg组，50mg/kg组，100mg/kg组。然后尾静脉注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(200μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为200μm的溶液)；
[0104]
对照组：正常未处理小鼠尾静脉注射0.2ml实施例1制备的生物发光探针溶液(100μm，先用dmso配制成10mm储备液，再用生理盐水配制成浓度为100μm的溶液)。
[0105]
(3)成像条件：小动物活体成像系统的ccd检测器(charge-coupled device，ccd)每隔3min拍摄一次，持续30min，每次曝光时间1s，拍摄每个时间段的发光情况并记录这段时间内的总光子数。
[0106]
2、试验结果
[0107]
本发明生物发光探针在药物刺激去甲肾上腺素内源性生成小鼠中的成像情况如图10所示。由图10可知：对照组小鼠体内生物发光信号强度较为平缓，实验组小鼠体内生物发光信号强度与对照组相比显著增强，并且随着氟西汀的浓度的提高越来越强。
[0108]
氟西汀是一种临床上用于治疗抑郁症的药物，它能够刺激去甲肾上腺素内源性生成。上述实验结果表明，本发明的生物发光探针不仅能够用来可视化分析活体内外源性去甲肾上腺素水平动态变化，还能够用来可视化分析活体内内源性去甲肾上腺素的动态生成水平，能够用来辅助筛选抗抑郁药物。
[0109]
试验例6、本发明生物发光探针的稳定性测试
[0110]
1、试验方法
[0111]
取10mm的探针(实施例1制备的)储备液，分别用ph＝1.0,4.5,6.6,7.4溶液稀释探针的终浓度为100μm，样品置于37℃下孵箱中，分别于t＝0,15,30,60,90,120min不同时间点取样通过hplc进行检测，使用归一化法计算探针的相对含量，t＝0时检测得到的探针为100％，其他时间点计算相对比值(与t＝0时比较)。
[0112]
2、试验结果
[0113]
表1.在生理条件下不同ph值的缓冲溶液中生物发光探针含量变化(单位：％)
[0114][0115][0116]
结果如表1所示，可以看出，在ph为1.0～7.4的溶剂中本发明的生物发光探针在0-120min都具有优异的稳定性，能够满足体内不同生理环境下的应用需求。
[0117]
综上，本发明提供了一种检测去甲肾上腺素的生物发光探针及其制备方法和用途。本发明生物发光探针对去甲肾上腺素具有高选择性和高响应性，能够特异性地识别去甲肾上腺素，其灵敏度高，检出限低，可用于去甲肾上腺素的精密检测。在ph为1.0～7.4的范围内，本发明的生物发光探针都具有优异的稳定性，能够满足体内不同生理环境下的应用需求。同时，本发明去甲肾上腺素生物发光探针还能在活体水平对外源性去甲肾上腺素进行可视化追踪，对去甲肾上腺素异常表达涉及神经、肿瘤、血压及心脏疾病相关疾病患者进行动态可视化分析，有利于临床上对去甲肾上腺素的检测，具有广阔的应用前景。

技术特征：
1.式i所示的化合物、或其盐、或其立体异构体：其中，r1、r2、r3、r4、r5分别独立地选自氢、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基。2.根据权利要求1所述的化合物、或其盐、或其立体异构体，其特征在于：所述化合物如式ii所示：其中，r1、r3、r4、r5分别独立地选自氢、羧基、c1～c3烷基。3.根据权利要求2所述的化合物、或其盐、或其立体异构体，其特征在于：所述化合物的结构式如式iii所示：4.权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：步骤1：将原料i、原料ii与原料iii在有机溶剂中反应，得到中间体iv；步骤2：将中间体ⅳ与d-半胱氨酸在溶剂中反应，得到式iii所示化合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述有机溶剂为甲苯，所述反应是在碱的存在下进行的，所述原料i、原料ii、原料iii和碱的摩尔比为(1～4)：(0.5～1)：(0.5～1)：(2～4)：所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为(2～4)：(20～40)mmol/ml；所
述反应是在惰性气体氛围中进行的，所述反应的温度为0～120℃，反应的时间为1～7h；和/或，步骤2中，所述反应包括以下步骤：将中间体ⅳ溶于有机溶剂中，加入含d-半胱氨酸的甲醇水溶液，在惰性气体氛围中反应；所述中间体iv与d-半胱氨酸的摩尔比为(0.5～1)：(1～2)；所述有机溶剂为甲醇和二氯甲烷的混合溶液，中间体iv与有机溶剂的摩尔体积比为(0.5～1)：(10～20)mmol/ml；所述中间体iv与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为(0.5～1)：(3～6)mmol/ml；所述反应的温度为0～100℃，反应的时间为0.5～4h。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述碱为有机碱；所述原料i、原料ii、原料iii和碱的摩尔比为1.2：1：1：2；所述原料i与有机溶剂的摩尔体积比为1.2：20mmol/ml；所述反应的温度为50～90℃，反应的时间为3～5h；和/或，所述步骤2中，中间体ⅳ与d-半胱氨酸的摩尔比为1：1；中间体iv与有机溶剂的摩尔体积比为0.5：5mmol/ml；中间体iv与含d-半胱氨酸的甲醇水溶液的摩尔体积比为1：4mmol/ml；所述甲醇和二氯甲烷的混合溶液中，甲醇和二氯甲烷的体积比为1：(1～3)；所述含d-半胱氨酸的甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为(1～2)：1；所述反应的温度为25℃，反应的时间为0.5h。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述碱为三乙胺。8.一种去甲肾上腺素特异性检测试剂盒，其特征在于：它包含权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐、或其立体异构体。9.权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备检测去甲肾上腺素的生物发光探针或试剂盒中的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述生物发光探针或试剂盒能够检测体外或体内的去甲肾上腺素水平。

技术总结
本发明提供了一种检测去甲肾上腺素的生物发光探针及其制备方法和用途，属于生物检测领域。本发明生物发光探针对去甲肾上腺素具有高选择性和高响应性，能够特异性地识别去甲肾上腺素，其灵敏度高，检出限低，可用于去甲肾上腺素的精密检测。在pH为1.0～7.4的范围内，本发明的生物发光探针都具有优异的稳定性，能够满足体内不同生理环境下的应用需求。同时，本发明去甲肾上腺素生物发光探针还能在活体水平对外源性去甲肾上腺素进行可视化追踪，对去甲肾上腺素异常表达涉及神经、肿瘤、血压及心脏疾病相关疾病患者进行动态可视化分析，有利于临床上对去甲肾上腺素的检测，具有广阔的应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：冯萍 康婷 杨钟力 柯博文 左泽平 甘宇
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2022.03.23
技术公布日：2023/10/7