测定方法和测定系统与流程

测定方法和测定系统
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求日本专利申请2021-30947号(2021年2月26日申请)的优先权，在此引入该申请的公开整体以供参照。
技术领域
3.本公开涉及微生物的定量的测定方法和测定系统。


背景技术：

4.以往，已知有对样品进行基因的扩增、并检测扩增后的基因的方法(例如，参照专利文献1)。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2015-43702号公报


技术实现要素：

8.发明所要解决的课题
9.要求提高基于基因的检测结果测定微生物量时的便利性。
10.本公开的目的在于提供能够提高微生物量测定中的便利性的测定方法和测定系统。
11.用于解决课题的手段
12.一些实施方式涉及的测定方法是测定检体试样中所含的微生物的存在量的测定方法，该测定方法包括：对所述检体试样中所含的微生物进行浓缩精制的步骤；从浓缩精制的微生物中提取核酸的步骤；
13.在提取的核酸中添加包含所述提取的核酸的杂交反应所需的盐类和表面活性剂的杂交反应液以供于所述杂交反应的步骤；测定杂交的核酸的发光量的步骤；基于所述核酸的发光量的测定值推定所述提取的核酸的量的步骤；以及基于所述提取的核酸的量的推定值计算所述检体试样中所含的微生物的存在量的步骤。通过这种方式，在不实施pcr(polymerase chain reaction：聚合酶链式反应)工序的情况下推定核酸的量。由于在不实施pcr工序的情况下推定核酸的量，因此减少了pcr反应效率对于核酸的量的推定值的影响。由于减少了pcr反应效率的影响，因此提高了基于核酸的量的推定值而实施的靶微生物的定量测定精度。结果，提高了微生物测定中的便利性。
14.在一个实施方式中，在所述测定方法中，在供于所述杂交反应的步骤中，可以在微阵列(micro array)所具有的多个点(spot)分别将所述提取的核酸供于杂交反应；在所述测定杂交的核酸的发光量的步骤中，可以测定所述微阵列所具有的各点的发光量。通过这种方式，同时定量且高灵敏度地测定了多种微生物。结果，提高了微生物测定中的便利性。
15.在一个实施方式中，在所述测定方法中，在供于所述杂交反应的步骤中，可以使固
定于所述微阵列所具有的各点的固相面上且被荧光分子修饰的探针捕获所述核酸。通过这种方式，将与各点接液的检体样品中所含的核酸的量作为各点的亮度值来测定。结果，提高了微生物的定量测定的精度。
16.一些实施方式涉及的测定系统测定检体试样中所含的微生物的存在量。所述测定系统具备：对检体试样中所含的微生物进行浓缩精制的微生物浓缩装置；从在所述微生物浓缩装置中浓缩精制的微生物中提取核酸的核酸提取装置；将在所述核酸提取装置中提取的核酸供于所述杂交反应的杂交反应装置；以及测定在所述杂交反应装置中与探针杂交的核酸的发光量、并基于所述核酸的发光量的测定值推定所述提取的核酸的量的核酸检测装置。所述核酸检测装置使运算装置基于所述提取的核酸的量的推定值计算所述检体试样中所含的微生物的存在量，并获取所述运算装置的计算结果作为所述微生物的存在量的测定结果。通过这种方式，在不实施pcr(polymerase chain reaction)工序的情况下推定核酸的量。由于在不实施pcr工序的情况下推定核酸的量，因此减少了pcr反应效率对于核酸的量的推定值的影响。由于减少了pcr反应效率的影响，因此提高了基于核酸的量的推定值而实施的靶微生物的定量测定精度。结果，提高了微生物测定中的便利性。
17.在一个实施方式涉及的所述测定系统中，所述微生物浓缩装置可以通过阴电荷膜法对所述检体试样中所含的微生物进行浓缩精制。通过这种方式，相对于利用孔径小于靶微生物的过滤器进行的通常的过滤，堵塞等的影响小，能够处理大容量的样品，从而可以期待提高浓缩率。
18.发明的效果
19.根据本公开涉及的测定方法和测定系统，提高了微生物量测定中的便利性。
附图说明
20.[图1]是示出比较例涉及的利用qpcr法的定量测定的步骤例的流程图。
[0021]
[图2]是示出比较例涉及的多重qpcr(multiplex qpcr)的前工序的步骤例的流程图。
[0022]
[图3]是示出比较例涉及的利用微阵列法的定量测定的步骤例的流程图。
[0023]
[图4]是示出比较例涉及的微阵列法的前工序的步骤例的流程图。
[0024]
[图5]是示出一个实施方式涉及的测定方法的步骤例的流程图。
[0025]
[图6]是示出一个实施方式涉及的测定系统的构成例的框图。
具体实施方式
[0026]
以下，参照附图对本公开涉及的实施方式进行说明。本公开的一个实施方式涉及的测定方法是测定检体试样中所含的至少2种微生物的存在量的方法。
[0027]
(比较例)
[0028]
首先，对相对于本实施方式涉及的测定方法的比较例进行说明。作为同时定量测定检体试样中的多种微生物量的方法的比较例，以下说明了多重qpcr(quantitative polymerase chain reaction)法和微阵列法。
[0029]
《利用qpcr法的定量测定》
[0030]
图1示出了利用qpcr法的定量测定的步骤例。从检体试样中提取核酸并进行精制
(步骤s901)。在精制的试样中添加反应液(步骤s902)。通过将反应液添加到与检体试样不同的已知浓度的标准核酸中来制备检量用试样(步骤s903)。进行来自检体试样的核酸和标准核酸的实时pcr(real-time pcr)测定(步骤s904)。进行将已知浓度的标准核酸的实时pcr测定的ct值与来自检体试样的核酸的ct值进行比较的数据分析(步骤s905)。基于通过数据分析推定的检体试样的核酸量，计算微生物量(步骤s906)。
[0031]
步骤s903的检量用的已知浓度的标准核酸的制备例如通过以下方式执行：制备1/10稀释系列、或者在包含来自检体试样的核酸浓度的范围内进行制备。检量用的已知浓度的标准核酸的制备需要预先在与装置规格相对应的浓度范围内执行，以使得浓度成为qpcr装置的检测下限以上、且不会因反应抑制而失去定量性。
[0032]
来自检体试样的核酸可以以稀释系列作为样品，其预先在与装置规格相对应的浓度范围内制备，以使得浓度成为qpcr装置的检测下限以上、且因反应抑制而失去定量性。
[0033]
在qpcr反应中，为了测定核酸扩增，使用嵌入剂(intercalator)(非特异性染色双链核酸的荧光试剂)或荧光核酸探针。荧光核酸探针也称为taqman探针。
[0034]
图2示出了作为用于以qpcr法为基础实施用于同时检测多种核酸的多重qpcr所需的前工序的构建引物组(prime set)的步骤例。首先，从靶微生物所具有的基因或其他核酸中选定靶微生物特有的核酸作为靶核酸(步骤s911)。接着，获取在步骤s911的步骤中选定的靶核酸的核酸序列(步骤s912)。靶核酸的核酸序列可以从公开的核酸序列数据库等中包含的核酸序列获取，也可以通过核酸测序等方法获取。
[0035]
接着，基于在步骤s912的步骤中获取的靶核酸序列，设计用于扩增靶核酸所需的引物序列(步骤s913)。引物序列的引物长度被设计成在正向引物与反向引物中tm值相等。tm值也被称为熔解温度，表示引物与靶序列以50％的比例形成双链的温度。另外，执行pcr扩增反应以确认所设计的引物能否有效地扩增靶核酸。pcr扩增反应基于公知的信息在添加了反应所需的模板核酸、碱基类、延伸酶、以及酶反应所需的盐类的缓冲液中执行。另外，pcr扩增反应以适合所使用的酶的温度循环进行控制，所述温度循环由退火、延伸、热变性解离3个步骤构成。温度循环可以由在相同温度下执行延伸和热变性解离的2个步骤构成。
[0036]
在pcr扩增反应之后，判定确认项目是否满足以确认是否通过凝胶电泳等生成了pcr扩增产物(步骤s914)。作为确认项目，可以列举出扩增量、扩增长度、有无非特异产物的扩增、或有无引物二聚体的生成等。在确认项目不满足条件的情况下，执行引物的改良或重新设计。然后，确认改良或重新设计的引物是否能够扩增靶核酸。将设计为确认项目满足条件的引物确定为个别单独引物。
[0037]
另外，在要同时检测多种核酸的情况下，需要针对各种核酸构建个别单独引物。在针对所有的靶核酸构建个别单独引物后，在混合了针对各种核酸构建的个别单独引物的引物组中执行pcr扩增。然后，为了确认在利用引物组进行的pcr扩增中是否生成了pcr扩增产物，判定满足了确认项目。利用引物组进行的pcr扩增的确认项目可以与利用个别单独引物进行的pcr扩增的确认项目相同。
[0038]
在确认项目由于在引物组的pcr扩增中(例如)生成非特异产物等而不满足条件的情况下(步骤s914：no)，返回步骤s913的步骤，重新设计个别单独引物。在确认项目满足条件的情况下(步骤s914：yes)，不产生非特异产物的引物组的构建完成(步骤s915)。
[0039]
以上所述的qpcr法具有以下问题点。由于每个靶核酸种类在不同的波长下检测，
因此由于荧光波长的限制，同时检测的种类数被限制为6种左右。用于制作不产生非特异pcr扩增产物的引物而执行的设计、试制以及评价所花费的开发成本和时间增加。特别是在多重qpcr中，用于确认多种引物的交叉反应所花费的开发成本和时间增加。在稀释系列中同时将多个检量用标准样品供于反应所导致的反应数的增加会增加试剂等的消耗品成本和工夫。由于每个靶核酸的pcr反应效率不同，因此每个靶核酸需要检量用标准样品。因此反应数增多。反应数的增加会增加试剂等的消耗品成本和工夫。例如，在检测5种菌的情况下，需要组合5个检体试样和用于5点检量的标准样品的25种反应。在构建引物组之后，用于追加靶微生物所花费的开发成本和时间增加。根据未知检体的污染引起的非特异产物的扩增的有无、或引物二聚体的生成的有无，产生假阳性检测或定量性的降低。样品中所含的酶反应的抑制剂改变pcr反应效率。pcr反应效率的变化降低了qpcr的定量性。
[0040]
《利用微阵列法的定量测定》
[0041]
图3示出了利用微阵列法的定量测定的步骤例。从检体试样中提取核酸并进行精制(步骤s921)。在精制的试样中添加pcr反应液(步骤s922)。将试样供于pcr扩增反应并进行标记(步骤s923)。向pcr扩增的试样中添加杂交反应液(步骤s924)。在微阵列上的探针中，将来自检体试样的核酸供于杂交反应(步骤s925)。通过清洗除去反应液(步骤s926)。为了获取供于杂交反应的探针的图像，扫描微阵列上的探针(步骤s927)。将杂交固定于探针上的标记的光量数值化，执行与预先获取的已知浓度的标准核酸中的标记的光量进行比较的数据分析(步骤s928)。基于通过数据分析推定的核酸量，计算微生物量(步骤s929)。
[0042]
为了在步骤s923中将试样供于pcr扩增反应，需要如在关于qpcr法的说明中所述的那样构建引物组的工序。通常，在微阵列中使用的引物中，以使pcr扩增产物标记化的方式标记了荧光分子等标记。
[0043]
图4示出了作为以微阵列法为基础用于同时检测多种核酸所需的前工序的探针构建步骤例。首先，从靶微生物所具有的基因或其他核酸中选定对靶微生物特异性的靶核酸(步骤s931)。接着，获得选定的靶核酸的核酸序列(步骤s932)。接着，设计并试制用于从核酸序列检测靶核酸所需的探针序列(步骤s933)。通过将所试制的探针供于针对个别核酸的杂交反应，判定所试制的探针是否具有检测能力(步骤s934)。在所试制的探针针对个别核酸不具有检测能力的情况下(步骤s934：no)，返回步骤s933的步骤，重新设计探针序列。在所试制的探针针对个别核酸具有检测能力的情况下(步骤s934：yes)，判定所试制的探针针对包含多种核酸的试样是否具有检测能力(步骤s935)。在所试制的探针针对包含多种核酸不具有检测能力的情况下(步骤s935：no)，返回步骤s933的步骤，重新设计探针序列。在所试制的探针针对包含多种核酸的试样具有检测能力的情况下(步骤s935：yes)，探针组的构建完成(步骤s936)。
[0044]
在步骤s934和s935的判定中，确认的项目例如包括与探针杂交固定的标记的光量。确认的项目不限于此，包括用于排除假阳性因素的项目，例如除靶核酸以外的核酸是否杂交固定、或引物是否进行杂交固定的交叉反应等。
[0045]
在步骤s932的核酸序列的获得中，可以从公知公开的核酸序列数据库等中获得对应的核酸序列。另外，靶核酸序列也可以单独通过核酸测序等方法获得。在步骤s933的探针序列的设计中，探针长度被设计成探针组的每个探针的tm值相等。在步骤s934和s935中所执行的杂交反应基于公知的信息在添加了反应所需的盐类或表面活性剂的缓冲液中实施。
另外，杂交反应通过在适合设计的探针的tm值的温度下孵育(incubate)来实施。
[0046]
另外，考虑使用核酸序列测量用装置(dna芯片)测量靶的方法，该核酸序列测量用装置设置有附加有荧光分子的荧光探针和附加有对荧光分子的荧光进行消光的消光分子的消光探针作为检测探针。通过该方法，能够在不进行对靶的荧光分子的附加和dna芯片的清洗(用于除去未被捕获的靶等的清洗)的情况下测量靶。
[0047]
以上所述的微阵列法具有以下问题点。在包括pcr工序的微阵列检测中，除靶核酸以外的核酸的杂交固定、或用于制作没有引物的杂交固定的交叉反应的探针的设计、试制及评价所花费的开发成本和时间增加。在包括pcr工序的微阵列检测中，每个靶核酸的pcr反应效率不同会影响微生物量的计算的定量性。在包括pcr工序的微阵列检测中，样品中所含的酶反应的抑制剂改变pcr反应效率。pcr反应效率的变化降低了微生物量的计算的定量性。由于清洗工序，因杂交的靶核酸的损失或微阵列上相邻样品的污染而产生假阳性。假阳性的发生降低了定量性。微阵列的灵敏度比qpcr低。因此，除去pcr工序时的检测下限高。
[0048]
如上所述，作为测定检体试样中所含的微生物量的方法的比较例，可以考虑各种方法。各种方法具有如上所述的问题点。鉴于上述的问题点，以下对本公开涉及的测定方法进行说明。
[0049]
(本公开涉及的实施方式)
[0050]
本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了pcr工序的微阵列检测，能够定量且高灵敏度地同时测定多种微生物。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了包括检体试样的浓缩精制工序的pcr工序的微阵列检测，能够高灵敏度地测定靶微生物。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了pcr工序的微阵列检测，能够排除pcr反应效率的影响而定量地测定靶微生物。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了标记化的微阵列检测，能够排除标记化效率的影响而定量地测定靶微生物。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行微阵列检测，即使在靶微生物种类增加的情况下也能够以与qpcr相比检查成本不增加的方式进行测定。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了pcr工序的微阵列检测，减少了引物的开发成本和时间。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了pcr工序的微阵列检测，减少了pcr反应的试剂等的消耗品成本和工夫。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了pcr工序的微阵列检测，能够消除探针开发涉及的与引物的交叉反应而使开发变得容易，结果能够减少开发成本。另外，本公开的一个实施方式涉及的测定方法通过执行除去了清洗工序的微阵列检测，能够减少由清洗引起的假阳性风险或定量性降低风险。
[0051]
(测定方法的步骤例)
[0052]
本公开的一个实施方式涉及的测定方法以图5和图6所示例的流程图的步骤来执行。首先，参照图5对微阵列检测的实施例的工序进行说明。
[0053]
为了从检体试样中回收靶微生物，对检体试样进行浓缩精制(步骤s1)。从浓缩精制的靶微生物中提取核酸(步骤s2)。在提取了核酸的试样中添加杂交反应液(步骤s3)。将添加了杂交反应液的核酸提取液供于杂交反应(步骤s4)。在步骤s4的步骤中，核酸提取液与呈点状固定于微阵列上的探针接液。为了获取杂交反应后的微阵列的各探针的荧光图像，对微阵列进行微阵列扫描(步骤s5)。获取荧光图像以测定杂交后的核酸的发光量。执行
将从荧光图像得到的各点的亮度值与预先获取的已知浓度的标准核酸中的点的亮度值进行比较的数据分析(步骤s6)。亮度值对应于核酸的发光量的测定值。基于通过数据分析推定的核酸的量，计算微生物量(步骤s7)。通过数据分析推定的核酸的量对应于提取的核酸的量的推定值。
[0054]
如图6所示，执行本实施方式涉及的测定方法的测定系统1具备微生物浓缩装置10、核酸提取装置20、杂交反应装置30、以及核酸检测装置40。在图6中，结合各构成要素的实线箭头表示包含靶微生物或靶核酸的试样的流动。测定系统1从试样的流动的上游向下游依次具备微生物浓缩装置10、核酸提取装置20、杂交反应装置30以及核酸检测装置40。在图6中，虚线箭头表示从核酸检测装置40输出测定结果。
[0055]
微生物浓缩装置10通过阴电荷膜法对靶微生物实施浓缩精制。浓缩精制的检体样品是将附着于包含微生物的液体或固体上的微生物分散在液体中而成的样品。包含细菌和病毒等的水中微生物具有以下性质：在表面电荷为弱酸性的区域中存在等电点，在中性至碱性的水域中带负电荷、在酸性的水域中带正电荷。阴电荷膜法可以利用该性质从水中捕获微生物。相对于利用孔径小于靶微生物的过滤器进行的通常的过滤，阴电荷膜法发挥堵塞等的影响小、能够处理大容量的样品、期待提高浓缩率等效果。
[0056]
阴电荷膜法也可以基于下述文献中记载的方法来执行。
[0057]
文献：h.katayama他2002.development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater(一种病毒浓缩方法的建立及其在沿海海水中的肠道病毒和诺沃克病毒检测中的应用).applied and environmental microbiology 2002vol.68.p.1033-1039
[0058]
核酸提取装置20可以通过通常实施的使用了市售试剂盒的化学或物理处理来实施提取精制。化学的核酸提取处理可以通过苯酚、分解微生物的细胞膜的酶、表面活性剂、用于使核酸稳定化的盐类、使核酸酶失活而防止核酸分解的螯合剂、或含有ph缓冲液的缓冲剂等的作用，或者对这些作用施加热处理等来实施。物理的核酸提取处理可以通过均质器杵(homogenizer pestle)、超声波装置、冷冻破碎装置、珠子振荡、或高压式均质器等来实施。所提取的核酸可以根据需要通过酚氯仿提取、氯仿提取、乙醇沉淀、市售试剂盒化的旋转柱法或磁珠法等方法进行精制。在核酸提取液中添加杂交反应液。杂交反应液包含核酸杂交所需的盐类和表面活性剂。例如可以使用最终浓度5
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ssc等的缓冲液。
[0059]
杂交反应装置30将添加有杂交反应液的核酸提取液在与探针接液的状态下供于杂交反应。在杂交反应装置30中，将核酸提取液放入保持样品的腔室等中，该样品与设定在微阵列上的多种探针的点集合体即1个或多个探针块(block)1对1设置，从而使核酸提取液与微阵列上的探针块接液。
[0060]
微阵列具有多个点。被荧光分子修饰的探针固定在各点的固相面上。核酸提取液与呈点状固定于微阵列上的探针接液。核酸提取液中所含的核酸通过与接液的探针杂交而被捕获。即，杂交反应装置30通过杂交反应使核酸被探针捕获。
[0061]
杂交反应可以通过在相对于探针的tm值设定适当温度的状态下进行孵育来促进。另外，杂交反应也可以通过振荡或旋转来促进，以辅助在孵育过程中核酸在样品中的扩散。杂交反应例如可以通过在遮光状态下在60℃孵育30分钟来促进。
[0062]
核酸检测装置40具备微阵列扫描仪50、记录装置60以及运算装置70。
[0063]
微阵列扫描仪50获取微阵列的固定有探针的点的荧光图像。微阵列扫描仪50将荧光图像作为检测信号输出到记录装置60或运算装置70。在微阵列是透明基材的情况下，微阵列扫描仪50在杂交反应后从与微阵列的点面相反的面扫描点。在微阵列是不透明基材的情况下，微阵列扫描仪50在杂交反应后从腔室的底面扫描点。在这种情况下，与上述腔室的微阵列平行的面需要是透明的。
[0064]
运算装置70基于从微阵列扫描仪50输出的荧光图像信号计算点亮度值。点亮度值可以根据点部的图像识别的图像上的区域指定和点部的各像素的亮度值的平均值来计算。另外，运算装置70根据预先在任意的杂交反应时间后获取的已知浓度的标准核酸中的点的亮度值和核酸浓度的检量线来推定检体样品的核酸浓度。运算装置70可以包括能够计算荧光图像的亮度值的任意运算元件或运算模块。点亮度值也可以基于微阵列扫描仪50的装置规格，变换为光量等任意的值。点亮度值也可以作为由杂交反应装置30执行的靶核酸与探针的杂交反应中的多个时间点的亮度值来测定。杂交反应进行期间的亮度值可以随着反应的进行而增加。亮度值的增加在靶核酸与探针的杂交反应达到平衡状态的时间点停止。在亮度值的增加停止的状态下定量变得不可能。运算装置70通过在多个时间点获取亮度值，能够根据在靶核酸为高浓度时杂交反应达到平衡状态之前的亮度值来推定核酸浓度。
[0065]
另外，运算装置70也可以基于多个时间点的亮度值通过检量线对靶核酸进行定量。运算装置70也可以不计算亮度值，而是基于图像的原始数据(raw data)或对图像进行滤波处理或运算处理而得的信号，对靶核酸进行定量。在这种情况下，基于信号的靶核酸的定量可以作为从利用多变量分析或机器学习的定量模型中获取的计算结果而执行。另外，靶核酸的定量也可以与利用本方法的定量结果同时获取参照值并反馈给定量模型。
[0066]
运算装置70可以根据靶核酸的定量结果，参考已报道的每1个细胞的核酸数的文献值等来计算微生物量。运算装置70也可以获取在定量模型构建中预先对已知浓度的标准微生物实施了本公开的测定方法时的点的亮度值和微生物浓度的检量线，基于检量线计算检体试样的微生物浓度。微生物量的计算也可以作为从利用多变量分析或机器学习的定量模型中获取的计算结果而执行。微生物量的计算也可以与利用本方法的定量结果同时获取参照值并反馈给定量模型。
[0067]
微生物量不限于运算装置70，也可以由运算装置70的外置装置计算。即，核酸检测装置40可以在内部具备的运算装置70或外置的装置中计算微生物量，并获取其计算结果作为微生物的存在量的测定结果。
[0068]
记录装置60适当保存来自微阵列扫描仪50的图像信号并输出到运算装置70。另外，记录装置60可以适当保存来自运算装置70的靶核酸的定量结果或微生物的定量结果。
[0069]
测定系统1还可以进一步具备显示装置。显示装置可以从运算装置70或记录装置60获取靶核酸或微生物的定量结果并进行显示。
[0070]
使用的探针可以使用专利文献1(日本特开2015-43702号公报)中记载的探针。具体而言，探针可以具有附加了荧光分子的荧光探针和附加了消光分子的消光探针，荧光探针与消光探针结合，使得荧光分子的荧光被消光分子消光。在添加了作为测量对象的靶的情况下，这样构成的探针通过杂交消除荧光探针与消光探针的结合而发出荧光。荧光探针可以任意设定荧光色素等标记。基于荧光探针中所使用的荧光色素的吸收波长和荧光波长特性，选择微阵列扫描仪50的激发波长和荧光检测波长。
[0071]
微阵列扫描仪50不限于上述的实施方式，为了检测来自微阵列上的点的荧光，也可以构成为包含荧光显微镜、共聚焦显微镜、渐逝场荧光检测装置、薄膜斜光照明显微镜、光片照明显微镜、结构化照明显微镜、或多光子激发显微镜等。
[0072]
如上所述，根据本实施方式涉及的测定方法，通过微阵列检测，可以定量且高灵敏度地同时测定多种微生物。另外，通过包括检体试样的浓缩精制工序的微阵列检测，可以高灵敏度地测定靶微生物。另外，通过除去了pcr工序的微阵列检测，减少了pcr反应效率的影响。由于减少了pcr反应效率的影响，靶微生物的定量测定精度提高。另外，通过微阵列检测，即使在靶微生物种类增加的情况下，与qpcr相比检查成本也难以增加。另外，通过除去了pcr工序的微阵列检测，减少了开发引物所花费的成本和时间。另外，通过除去了pcr工序的微阵列检测，减少了pcr反应的试剂等的消耗品成本和pcr反应的工夫。另外，通过除去了pcr工序的微阵列检测，消除了与探针开发涉及的引物的交叉反应。由于没有交叉反应，开发变得容易，并且开发成本减少。另外，通过除去了标签化工序的微阵列检测，减少了标记效率的影响。由于减少了标记效率的影响，对靶微生物的定量测定精度提高。另外，通过除去了清洗工序的微阵列检测，减少了由清洗引起的假阳性风险或定量性降低风险。
[0073]
作为比较例，微阵列检测的微生物量根据最终杂交的核酸量，基于a：微生物的回收效率、b：核酸提取精制效率、c：pcr反应效率、d：杂交效率、e：由清洗引起的损失、以及f：每1个细胞的核酸量参照值的经过来计算。通过在本实施方式涉及的测定方法中不实施pcr反应和清洗，可以减少因样品而引起的效率变化大的c：pcr反应效率、和容易因操作技巧而产生差异的e：由清洗引起的损失的影响。通过这种方式，定量测定精度提高。
[0074]
作为以上的结果，根据本实施方式涉及的测定方法，微生物测定中的便利性提高。
[0075]
(应用例)
[0076]
本实施方式涉及的测定方法可以如下应用。例如，本实施方式涉及的测定方法可以在荧光量测量中的干式图像测定、生物芯片的荧光量液中观察、或连续反应中的实时观察等中使用。作为具体的实施例，本实施方式涉及的测定方法可以用于利用核酸分析的菌种判别、癌基因、动植物判别、或肠内细菌的检查等。
[0077]
另外，本实施方式涉及的测定方法可以水平展开到自来水、食品或饮用水等其他领域。在这种情况下，可以根据各应用的微生物量来设定检体样品的采样量。
[0078]
运算装置70能够基于预先在任意的杂交反应时间后获取的已知浓度的标准核酸中的点的亮度值和核酸浓度的检量线，推定检体样品的核酸浓度。核酸浓度的推定方法不限于此。例如，在靶核酸与其标记的数目为1:1等定量比率的情况下，点的亮度值与杂交核酸的数目相关。另外，在使用专利文献1记载的探针的情况下，同样地点的亮度值与杂交核酸的数量也以1:1相关。运算装置70可以通过定量地获取点的亮度值，并与标记分子数一定的标准点的亮度值进行比较，从而定量核酸浓度。另外，运算装置70通过将点的亮度值作为光量的绝对值来计算，能够根据点的光量和标记的理论光量来计算杂交核酸的数量。光量的绝对值的计算需要设定为各装置参数，可以通过使用标准光源等使传感器或光学系统标准化，以对相对于传感器亮度值的光量进行赋值。
[0079]
本公开不限于上述实施方式中特定的构成，在不脱离权利要求书所记载的公开要旨的范围内可以进行各种变形。例如，包含在各步骤中的功能等能够以逻辑上不矛盾的方式进行再构成。另外，可以将多个步骤组合成1个，或者分割1个步骤。
[0080]
符号的说明
[0081]
1测定系统(10：微生物浓缩装置、20：核酸提取装置、30：杂交反应装置、40：核酸检测装置、50：微阵列扫描仪、60：记录装置、70：运算装置)

技术特征：
1.一种测定方法，其是测定检体试样中所含的微生物的存在量的测定方法，该测定方法包括：对所述检体试样中所含的微生物进行浓缩精制的步骤；从浓缩精制的微生物中提取核酸的步骤；在提取的核酸中添加包含所述提取的核酸的杂交反应所需的盐类和表面活性剂的杂交反应液以供于所述杂交反应的步骤；测定杂交的核酸的发光量的步骤；基于所述核酸的发光量的测定值推定所述提取的核酸的量的步骤；以及基于所述提取的核酸的量的推定值计算所述检体试样中所含的微生物的存在量的步骤。2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，在供于所述杂交反应的步骤中，在微阵列所具有的多个点分别将所述提取的核酸供于杂交反应；在所述测定杂交的核酸的发光量的步骤中，测定所述微阵列所具有的各点的发光量。3.根据权利要求2所述的测定方法，其中，在供于所述杂交反应的步骤中，使固定于所述微阵列所具有的各点的固相面上且被荧光分子修饰的探针捕获所述核酸。4.一种测定系统，其是测定检体试样中所含的微生物的存在量的测定系统，该测定系统具备：对检体试样中所含的微生物进行浓缩精制的微生物浓缩装置；从在所述微生物浓缩装置中浓缩精制的微生物中提取核酸的核酸提取装置；在所述核酸提取装置中提取的核酸中添加包含所述提取的核酸的杂交反应所需的盐类和表面活性剂的杂交反应液以供于所述杂交反应的杂交反应装置；以及测定在所述杂交反应装置中与探针杂交的核酸的发光量、并基于所述核酸的发光量的测定值推定所述提取的核酸的量的核酸检测装置，所述核酸检测装置使运算装置基于所述提取的核酸的量的推定值计算所述检体试样中所含的微生物的存在量，并获取所述运算装置的计算结果作为所述微生物的存在量的测定结果。5.根据权利要求4所述的测定系统，其中，所述微生物浓缩装置通过阴电荷膜法对所述检体试样中所含的微生物进行浓缩精制。

技术总结
一种测定检体试样中所含的微生物的存在量的测定方法，包括：对检体试样中所含的微生物进行浓缩精制的步骤；从浓缩精制的微生物中提取核酸的步骤；在提取的核酸中添加包含提取的核酸的杂交反应所需的盐类和表面活性剂的杂交反应液以供于杂交反应的步骤；测定杂交的核酸的发光量的步骤；基于核酸的发光量的测定值推定提取的核酸的量的步骤；以及基于提取的核酸的量的推定值计算检体试样中所含的微生物的存在量的步骤。物的存在量的步骤。物的存在量的步骤。


技术研发人员：宫内祐树 田口朋之
受保护的技术使用者：横河电机株式会社
技术研发日：2022.01.05
技术公布日：2023/10/7