脑损伤治疗的制作方法

1.本发明涉及治疗脑病，更具体地通过在脑组织损伤部位促进神经免疫应答的活性治疗脑病。
2.发明背景
3.脑病一般因损伤或损害神经组织所致，并且这类损伤可能是奠定或界定神经系统疾病症状的主因。以举例方式，当患者罹患中风时，脑内血管阻塞或爆裂(例如出血)。因此，脑组织中的神经细胞耗尽否则原本通过健康供血提供的氧，变得受损或死亡，从而损伤神经细胞活性。这种神经活性缺乏可能导致诸多症状，包括肌肉虚弱、麻痹、身体一侧感觉丧失、言语困难、意识模糊，视力问题、眩晕、平衡与协调丧失及在一些出血性中风(hemorrhagic stroke)时，突发重度头痛。
4.在又一个例子中，脑传染性疾病可能导致奠定脑组织损伤基础的细胞死亡。在细菌性脑膜炎中，细菌如肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)可以侵入脑膜(有助于保护脑和脊髓组织免遭损伤的膜)，后续的脑膜损伤导致神经细胞死亡。如果病毒抵达和侵袭脑，则神经组织损伤可以由病毒的脑细胞裂解效应(例如在巨细胞病毒情况下)、诱导的凋亡(例如在水泡性口炎病毒(vsv)情况下)或者因谷氨酸、dna和其他脑损伤诱导物释放所致的继发性损伤引起。
5.在脑癌患者中，肿瘤可以通过挤压和施加压力至神经细胞，对脑内神经组织造成物理损伤。在转移性病例中，损伤也可能由肿瘤移动引起。
6.尽管存在减轻源自这类神经损伤的患者症状的治疗选项，但比较而言，这些选项中鲜有以促进修复神经组织实际损伤(或利于所述修复)的方式起作用。例如，在中风时，唯一治疗选项是局部再通和全身性溶栓(其目标是恢复血液流动以减轻神经损伤)。但是，这类治疗选项不适于全部患者，和/或可能仍造成进一步损伤。
7.本发明解决了上文提到的一个或多个问题。
8.发明简述
9.更详细地，本发明基于令人惊讶的发现：当施用至遭遇脑病所致神经系统的组织损伤的患者时，梭菌神经毒素促进神经组织损伤区域内的免疫细胞(例如神经免疫细胞)活性。也就是说，梭菌神经毒素可以出人意料地用来促进神经免疫活性作为防止/修复罹患脑病的患者中神经组织损伤的手段。
10.更具体地，本文中展示在已经接受一剂梭菌神经毒素的患者中小胶质细胞(位于脑组织损伤区域附近)的活性得以促进。小胶质细胞是脑中参与清除受损神经组织和异物的关键巨噬细胞。这代表梭菌神经毒素令人惊讶的一种实用性，后者在下文介绍。
11.梭菌属(clostridia)细菌产生高度强效和特异性的蛋白质毒素，这些毒素可以(暂时)损伤被送达的神经元和其他细胞。这类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(c.tetani)(tent)和肉毒梭菌(c.botulinum)(bont)血清型a-g和x产生的神经毒素(参见wo2018/009903a2)以及由巴拉迪梭菌(c.baratii)和丁酸梭菌(c.butyricum)产生的那些神经毒素。
12.在梭菌神经毒素当中有一些已知最强效的毒素。以举例方式，取决于血清型，肉毒神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的中位致死剂量(ld
50
)值。破伤风毒素和肉毒毒素均通过抑制受累神经元的功能、尤其抑制神经递质释放发挥作用。尽管肉毒毒素在神经肌肉接头处发挥作用并且抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统发挥作用。
13.在自然界，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，所述单链多肽通过蛋白酶剪切事件受翻译后修饰，以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的特异性切割位点(经常称作活性位点)处。正是这种双链(dichain)形式是毒素的活性形式。两条链称为重链(h链)(其具有大约100kda的分子量)和轻链(l链)(其具有大约50kda的分子量)。h链包含n-末端转运组分(hn结构域)和c-末端靶向组分(hc结构域)。切割位点位于l链和转运结构域组分之间。在hc结构域与其靶神经元结合并且结合的毒素借助内体内化进入细胞后，hn结构域转运l链跨过内体膜并进入胞质溶胶，并且l链提供蛋白酶功能(也称作非细胞毒性蛋白酶)。
14.梭菌神经毒素提供非细胞毒性蛋白酶活性。非细胞毒性蛋白酶通过蛋白酶解切割称作snare蛋白的胞内转运蛋白(例如snap-25、vamp或突触融合蛋白)发挥作用。首字母缩略词snare衍生自术语可溶性nsf接合受体(soluble nsf attachment receptor)，其中nsf意指n-乙基马来酰亚胺敏感因子(n-ethylmaleimide-sensitive factor)。snare蛋白对胞内小泡融合不可或缺，并且因此对分子借助小泡转运从细胞分泌不可或缺。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对snare蛋白显示高度的底物特异性。因此，一旦递送至目的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶就能够抑制自靶细胞的细胞性分泌。梭菌神经毒素的l链蛋白酶是切割snare蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
15.考虑到snare蛋白的普遍存在性质，梭菌神经毒素如肉毒毒素已经成功地用于广泛类型的疗法中。发明人已经展示梭菌神经毒素通过促进神经免疫活性治疗脑病的出人意料的实用性。
16.脑病的共同特征是宿主自身神经免疫应答通过清除和/或预防脑组织损伤，对构成脑病基础的损伤做出反应。在传染性疾病的情况下，(例如)可能存在其中巨噬细胞(例如小胶质细胞)移行至感染部位并吞噬正在入侵的病原体的天然应答。巨噬细胞是免疫系统中以称作吞噬的过程吞没并消化细胞碎片、外来物质、微生物、癌细胞和其他非宿主物质的白血细胞类型。
17.当发生神经元细胞死亡时，小胶质细胞通过移行至损伤(损害)部位做出反应，在那里它们吞噬细胞碎片。因此，小胶质细胞可以通过移除由物理损伤引起的脑组织(例如脑肿瘤)，对脑病有反应。例如，小胶质细胞吞噬可以清除死细胞，后者否则可能释放有毒物质至其环境并且因而加重组织损伤。还已经报道，小胶质细胞在防御脑肿瘤方面直接发挥作用。另外，已经报告小胶质细胞参与
‘
突触修剪过程(synaptic pruning)’，其中它们吞没突触物质，从而有助于预防在一些神经发育疾病中常见的突触异常。
18.因此，通过促进响应于神经组织损伤的神经免疫活性，梭菌神经毒素施用有利地实用于治疗脑病。
19.详细说明
20.本发明的宽泛方面提供以下任一者：
[0021]-一种用于治疗脑病的方法中的梭菌神经毒素；
[0022]-一种治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素；
[0023]-梭菌神经毒素在制造药物以治疗患者脑病的用途。
[0024]
本发明的宽泛方面提供以下任一者：
[0025]-一种用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中的梭菌神经毒素。
[0026]-一种治疗患者脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素；
[0027]-梭菌神经毒素在制造药物以治疗患者脑组织损伤(例如神经组织损伤)的用途。
[0028]
本发明的宽泛方面提供以下任一者：
[0029]-一种用于治疗脑感染的方法中的梭菌神经毒素；
[0030]-一种治疗患者脑感染的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素；
[0031]-梭菌神经毒素在制造药物以治疗患者脑感染的用途。
[0032]
梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答，治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答来治疗脑病，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答，治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答来治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0033]
梭菌神经毒素可以通过(例如响应于神经组织损伤)促进小胶质细胞活性来治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞活性来治疗脑病，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过(例如响应于神经组织损伤)促进小胶质细胞活性来治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞活性来治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0034]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑组织损伤(例如神经组织损伤)部位，治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑组织损伤部位，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑组织损伤(例如神经组织损伤)部位，治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)来治疗脑组织损伤，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0035]
梭菌神经毒素可以通过促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性来治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性来治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性来治疗脑组织损伤，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0036]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处清除细胞碎片，治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处清除细胞碎片，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处清除细胞碎片，治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑组织损伤部位(例
如神经组织损伤)处清除细胞碎片来治疗脑组织损伤，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0037]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染，治疗脑病。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染来治疗脑病，用于治疗脑病的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染，治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染来治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)，用于治疗脑组织损伤(例如神经组织损伤)的方法中。
[0038]
梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进神经免疫(例如小胶质细胞)应答来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0039]
梭菌神经毒素可以通过(例如响应于感染)促进小胶质细胞活性，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞活性来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过(例如响应于感染)促进小胶质细胞活性，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞活性来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0040]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑感染部位，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑感染部位，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑感染部位，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞移行至脑感染部位来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0041]
梭菌神经毒素可以通过促进脑感染部位处的小胶质细胞吞噬活性，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进脑感染部位处的小胶质细胞吞噬活性，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进脑感染部位处的小胶质细胞吞噬活性，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进脑感染部位处的小胶质细胞吞噬活性来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0042]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑感染部位处清除细胞碎片，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑感染部位处清除细胞碎片，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑感染部位处清除细胞碎片，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞在脑感染部位处清除细胞碎片来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0043]
梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染来治疗脑病，用于治疗脑感染的方法中。梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染，治疗脑感染。例如，梭菌神经毒素可以通过促进小胶质细胞应答于感染来治疗脑感染，用于治疗脑感染的方法中。
[0044]
在一个方面，提供一种梭菌神经毒素，其通过促进神经免疫应答用于治疗患者脑病的方法中。也就是说，一个方面提供用于促进神经免疫应答来治疗脑病的梭菌神经毒素。
[0045]
在一个相关方面，提供一种通过促进神经免疫应答而治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素。也就是说，一个方面提供一种用于促进神经免疫应答来治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素。
[0046]
在又一个方面，提供梭菌神经毒素在制造药物以通过促进神经免疫应答治疗患者脑病的用途。也就是说，一个方面提供梭菌神经毒素在制造用于促进神经免疫应答治疗患者脑病的药物中的用途。
[0047]
因此，本文所述的梭菌神经毒素促进神经免疫应答。从而，梭菌神经毒素实用于治疗脑病。如本文所用的术语“脑病”(可以本文中与术语“脑损伤”同义使用)是可以通过促进患者中的神经免疫应答加以治疗的病症。脑病可以由脑组织损伤(例如神经组织损伤)造成。额外地或备选地，脑病可以造成神经组织损伤。就这一点而论，促进神经免疫应答活性可以具有促进修复神经组织损伤的效果，因此增强从脑病中康复。
[0048]
术语“脑组织损伤”可以在本文中与术语“脑组织损害”同义使用。术语“神经组织损伤”可以在本文中与术语“神经组织损害”同义使用。
[0049]
在一个实施方案中，神经免疫应答可以定义为小胶质细胞应答。因此，梭菌神经毒素促进脑中的小胶质细胞活性。
[0050]
小胶质细胞代表中枢神经系统(尤其脑)中的巨噬细胞样细胞群体。一般认为它们是能够策划强力炎症反应的免疫哨兵。小胶质细胞还参与突触组织架构、发育期间营养性神经元支持、在正在发育的脑中吞噬凋亡性细胞、髓鞘质周转、控制神经元兴奋性、吞噬性残片移除以及脑保护与修复。
[0051]
在一个方面，提供一种梭菌神经毒素，其通过促进(例如脑中)小胶质细胞活性用于治疗患者脑病的方法中。也就是说，一个方面提供用于促进(例如脑中)小胶质细胞活性来治疗脑病的梭菌神经毒素。在脑组织(例如神经组织)损伤情况下，可以促进小胶质细胞活性来修复(或清除)受损组织。小胶质细胞(例如巨噬细胞)活性的非限制性实例包括神经损伤或脑组织损伤部位处的吞噬活性(例如清除细胞碎片)。
[0052]
因此，不希望受理论约束，基于其预测本发明的一个观测效果是能够促进神经免疫应答响应于神经损伤(这可以由脑病造成，或实际上造成脑病)，来清除/修复这类损伤的能力。因此，尽管个体的内源神经免疫应答可能已经行动起来并且起到对付神经损伤的作用，但本发明对这类应答提供有利的
‘
强化’，这可能与更快启动神经免疫应答、增加神经免疫细胞召集至神经损伤部位和/或增加神经免疫细胞对治疗损伤的活性相关。作为结果，从损伤(例如神经组织损伤)中增强的恢复可以随之而来。
[0053]
为了展示这类技术效果，发明人将“双光子(two-photon)”成像和激光技术与转基因小鼠模型偶联，从而允许直接在脑体内场景下高分辨率跟踪动物自身小胶质细胞的活性。在其小胶质细胞内部表达gfp的动物模型(cx3cr1-gfp小鼠)允许借助荧光光学显微镜检查对细胞成像和追踪。
[0054]
为了诱导代表在本文所述
‘
脑病’中(例如在脑感染中)出现的神经损伤，发明人使用在脑中提供不同/焦点的激光诱导损伤的双光子显微镜技术。更详细地，在焦平面距皮质表面25-35微米的深度选择微米尺寸目的区域(roi)并且将激光强度施加至该聚焦区域以提供局限化、不同的受损脑组织区域。这种不同的脑组织损伤区域仿效可能归因于脑缺氧(例如中风后)、归因于正在生长的脑肿瘤和/或归因于感染后肿胀(例如脑炎)而出现的区域，同时还允许研究不同的、空间受控的诱导型组织损伤区域周围的小胶质细胞。
[0055]
如实施例部分中所展示，小胶质细胞通过移行至特定损伤部位并且采取与吞噬活性相符的表型，响应于这种损伤。然而，惊讶地，这类活性在梭菌神经毒素(例如bont/a)向
其施用的小鼠中显著增加，显示梭菌神经毒素促进患者对脑损伤做出神经免疫应答的预料不到的技术效果。
[0056]
因此，梭菌神经毒素实用于增强从脑(例如神经组织)损伤中恢复，并且因此可以用来治疗需要修复脑损伤的不同患者临床亚群。有利地，这类修复由患者自身的神经免疫应答策划，在施用梭菌神经毒素后增强/促进所述应答。提供这种效果的步骤即通过诸如皮质内注射等途径施用梭菌神经毒素(相对于脑手术)类似地可实现且为非侵入性技术。因此，可以削减对复杂手术干预(脑手术)的需求。
[0057]
自注意到遭遇脑损伤的患者特别适用于用本发明治疗之后续，这类患者的另外又一个临床亚群(或次亚群)可以由那些神经免疫应答活性的
‘
内源水平’不足以处理组织损伤的患者代表。也就是说，目前展示的由施用梭菌神经毒素提供的技术效果为这样的患者提供特定临床用途，所述患者将会从(针对损伤)
‘
强化’其神经免疫应答以相对于依赖患者的内源水平神经免疫应答时将随之而来的预后，改善所述患者预后中获益。
[0058]
使用此类神经毒素治疗脑病的这种实用性与现有方法中声称的梭菌神经毒素功能形成反差。由于梭菌神经毒素起到切割snare蛋白并且抑制神经递质分泌(如本文其他处详细解释)的作用，现有方法寻求通过施用梭菌神经毒素抑制脑中神经元活性，旨在实现神经毒素介导的阻止神经递质释放。例如，已经提出将神经毒素靶向至癫痫中显示
‘
异常’活动的脑区域，旨在抑制这类可能另行与癫痫发作相关的异常活动。其他现有技术提出另行靶向(并抑制)过度活跃的抑制性胆碱能神经元(例如存在于脑纹状体中)以抑制与运动障碍相关的神经活动。
[0059]
但是，这类现有方法不包括修复组织损伤，更不用说借助梭菌神经毒素诱导的神经免疫细胞活性的促进。不同于抑制神经元活性，本发明涉及移除/修复受损神经元。因此，本发明涉及通过治疗脑组织损伤来治疗脑病；更具体地，治疗这类损伤时通过促进神经免疫细胞活性来治疗脑病。
[0060]
因此，本发明人不仅已确定一个应用梭菌神经毒素的新技术领域(即与脑组织损伤相关的脑病)，还确定了所述领域中出乎意料的技术效果(即促进神经免疫应答)。在一个相关方面，提供一种通过促进(例如脑中)小胶质细胞活性而治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素。也就是说，一个方面提供一种用于促进(例如脑中)小胶质细胞活性来治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者施用梭菌神经毒素。
[0061]
在又一个方面，提供梭菌神经毒素在制造药物以通过促进(例如脑中)小胶质细胞活性治疗患者脑病中的用途。也就是说，一个方面提供梭菌神经毒素在制造用于促进(例如脑中)小胶质细胞活性来治疗患者脑病的药物中的用途。
[0062]
因此，本文所述的梭菌神经毒素促进神经免疫应答。从而，梭菌神经毒素实用于治疗脑病。如本文所用的术语“脑病”(可以本文中与术语“脑损伤”同义使用)是可以通过促进患者中的神经免疫应答加以治疗的病症。
[0063]
术语“神经免疫应答”是指患者的神经免疫系统对脑病的应答。例如，如本文所用的术语“神经免疫应答”可以指神经免疫系统对脑中脑组织损伤(例如神经组织损伤)、脑中感染和/或脑肿瘤(所述神经损伤可以由脑中感染和/或脑肿瘤引起)的应答。神经免疫应答可能阻止脑组织损伤(例如神经组织损伤)。额外地或备选地，神经免疫应答可能修复脑组织损伤(例如神经组织损伤)。术语“神经免疫应答”不意在限于对感染的应答，并且额外地
包括神经免疫系统对备选性病症(例如中风)所致脑组织损伤(例如神经组织损伤)的应答。实际上，物理损伤和坏死也可以造成神经免疫应答。在其中脑病是传染性疾病(或由其造成)的实施方案中，神经免疫应答可以是对感染的应答。
[0064]
神经免疫系统主要由胶质细胞组成，胶质细胞包括星形细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，其中小胶质细胞(例如巨噬细胞)尤其代表脑中这个系统的关键性免疫细胞。如上文所述，如本文提到的神经免疫应答可以定义为小胶质细胞应答。
[0065]
术语“促进神经免疫应答”可以意指本发明的梭菌神经毒素(或其片段)在患有脑病的患者中启动神经免疫应答，例如在所述患者中神经免疫应答未出现或其中
‘
内源’神经免疫应答未足够强大到克服该脑病(例如神经组织损伤)。因此，尽管本发明基于以本文所述的方法施用梭菌神经毒素，但可以更精确地说，“神经免疫应答”(优选地小胶质细胞)实现治疗例如脑组织损伤；在这种情况下，梭菌神经毒素促进神经免疫应答(例如小胶质细胞)在治疗脑组织损伤中的作用。
[0066]
术语“促进神经免疫应答”可以意指本发明的梭菌神经毒素在患有脑病的患者中加速神经免疫应答的启动，例如当在所述患者中神经免疫应答未出现时。在优选的实施方案中，术语“促进神经免疫应答”可以意指梭菌神经毒素升高神经免疫应答水平。所述升高可以是与不存在本发明梭菌神经毒素情况下神经免疫应答的水平相比时升高。在一个实施方案中，神经免疫应答可以移除受损脑组织(例如受损神经组织或神经)，从而允许受损神经元回路重建，因而在神经元网络或群体中恢复活动和/或神经元通讯。
[0067]
在一个实施方案中，神经免疫应答包含活化小胶质细胞(例如巨噬细胞)，如依据以下所测量：1)脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处小胶质细胞密度的变化，2)小胶质细胞移行(例如小胶质细胞球度(sphericity)的变化)至脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)水平的变化，3)小胶质细胞突起向脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)延伸水平的变化，和/或4)与本发明梭菌神经毒素不存在下小胶质细胞活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处小胶质细胞吞噬活性(例如清除细胞碎片)水平的变化。
[0068]
应当指出，预期神经免疫细胞(尤其小胶质细胞)活性响应于神经组织损伤也在
‘
未治疗的’(例如未用药剂如梭菌神经毒素治疗的)脑中增加，与这类细胞在损伤后的中枢神经系统修复中的作用相符。尽管如此，本技术提供的
‘
对照’实验(例如仅溶媒对照)显示，施用梭菌神经毒素提供了超越受试者内源水平的损伤所致神经免疫细胞活性激活水平(甚至精确存在下相同类型损伤的情况下)。因此，在促进神经免疫细胞活性(响应于损伤)中，本发明可以用来
‘
强化’这类细胞对付/修复脑病所致损伤的努力，从而进一步增强患者痊愈并且缓解因存在受损组织(例如坏死性物质)所致的进一步损伤。例如，本发明的方法可以使用治疗这类患者，他们的(响应于损伤的)
‘
正常’(或
‘
内源’)神经免疫细胞活性水平不足以对付/修复奠定脑病(或由其造成)的神经组织损伤。
[0069]
对于
‘
促进’神经免疫应答以升高其活性达某水平，
‘
损伤修复’水平可能同期升高。作为积极结果，患者的康复(或存活)预后随即(例如相关)增长可以随之而来。例如，对于
‘
促进’神经免疫应答以升高其活性达5％，
‘
损伤修复’水平可能同期升高5％，并且患者的康复(或存活)预后随即增长5％可以随之而来。
[0070]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的神经免疫应答相
比时，在本发明梭菌神经毒素存在下神经免疫应答可以升高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(优选地至少5％)或更多。
[0071]
与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的神经免疫应答相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下神经免疫应答可以升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少30％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的神经免疫应答相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下神经免疫应答可以升高至少100％、150％或200％。
[0072]
神经免疫应答可以指小胶质细胞活性。例如，本文提及的神经免疫应答可以优选地包含小胶质细胞活性或由其组成。在一个实施方案中，梭菌神经毒素促进脑中的小胶质细胞活性。例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞活性可以升高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(优选地至少5％)或更多。
[0073]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞活性可以升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少30％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞活性可以升高至少100％、150％或200％。
[0074]
如所用的术语“小胶质细胞活性(microglia activity)”(又称作“小胶质细胞的细胞活性(microglia cell activity)”或“小胶质细胞的活性(microglial activity)”)指小胶质细胞对抗损伤(如脑组织损伤、感染和/或肿瘤)存在所承担的功能。小胶质细胞对神经组织损伤敏感，并且这种由损害/感染/神经毒等所致的损伤刺激小胶质细胞(例如变得活化)，小胶质细胞移行至损伤部位。更强的小胶质细胞应答一般与更多数目的小胶质细胞移行至损害(损伤部位)相关，从而损伤部位处小胶质细胞的密度可以与应答率/应答水平一致地增加。
[0075]
在一个实施方案中，可以基于脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处小胶质细胞的密度测量小胶质细胞活性。梭菌神经毒素可以促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的、例如本文所述脑病造成的脑组织损伤处的“小胶质细胞密度水平”。
[0076]
术语“小胶质细胞密度水平”指给定部位处/给定区域内小胶质细胞的数目，其中增加的密度与增加的细胞数目相关。
[0077]
梭菌神经毒素可以促进感染部位(例如感染所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞密度水平。梭菌神经毒素可以促进脑肿瘤部位(或脑肿瘤所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞密度。梭菌神经毒素可以促进中风部位(或中风所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞密度。例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞密度水平相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞密度水平可以升高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(优选地至少5％)或更多。
[0078]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞密度水平相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞密度水平(在本文所述的任何实施方案中)可以升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少30％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶
质细胞密度水平相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞密度水平可以升高至少100％、150％或200％。
[0079]
像这样通过升高损伤(神经损伤)部位处的小胶质细胞密度水平，故
‘
可用于’对付/修复损伤的小胶质细胞的数目增加。例如，归因于损伤/损害部位处小胶质细胞的数目增加，受损组织(和/或病原体)的小胶质细胞吞噬量可以随之而来。修复(损伤)水平同期升高因此可以随之而来，在此之后提供治疗脑病。
[0080]
在一个实施方案中，可以基于“小胶质细胞移行”至脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)的水平测量小胶质细胞活性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素促进小胶质细胞移行至脑组织损伤(例如神经组织损伤)部位。梭菌神经毒素可以促进小胶质细胞移行至感染部位(或感染所致脑组织损伤的部位)。梭菌神经毒素可以促进小胶质细胞移行至脑肿瘤部位(或脑肿瘤所致脑组织损伤的部位)。梭菌神经毒素可以促进中风部位(或中风所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞密度。
[0081]
术语“小胶质细胞移行”指小胶质细胞移向、例如响应于释放自濒死细胞的刺激物移向本文所述部位(例如脑组织损伤部位、感染、肿瘤)的主动(定向)移动。术语“小胶质细胞移行(microglia cell migration)”可以在本文中与术语“小胶质细胞移行(microglial migration)”同义使用。
[0082]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞移行相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞移行可以增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(优选地至少5％)。例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞移行相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞移行(在本文所述的任何实施方案中)可以增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少30％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞移行相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞移行可以增加至少80％、90％或100％。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞移行相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞移行可以增加至少110％、125％或150％。
[0083]
通过增加小胶质细胞移行至本文所述部位(例如脑组织损伤、感染、肿瘤的部位)，
‘
可用于’对付/修复损伤(或感染)的小胶质细胞的数目增加。例如，归因于损伤/损害部位处小胶质细胞的数目增加，受损组织(和/或病原体)的小胶质细胞吞噬量可以随之而来。(损伤的)修复水平同期升高因此可以随之而来，在此之后提供脑病治疗。
[0084]
细胞移行的合适读出是小胶质细胞的球度。因此，可以检测小胶质细胞的球度(sphericity)指数(更一般地，小胶质细胞的平均球度指数)，其中球度指数下降与小胶质细胞增加的拉长(细长形状)相关，例如原因是它们已经变得能移动并且朝脑损伤部位的方向移行。可以定义球度指数为小胶质细胞体积(v)的平方对小胶质细胞覆盖的表面积(s)的三次方的比率：
[0085][0086]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)小胶质细胞的球度相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞的球度可以降低至少1％、2％、5％、
10％、15％、20％、25％或30％(优选地至少10％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)小胶质细胞的球度相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下小胶质细胞的球度可以降低至少35％、40％或50％。
[0087]
小胶质细胞是与神经元细胞和非神经元细胞相互作用的高动态性细胞。小胶质细胞借助连续的突起延伸和缩回巡视脑实质。例如，小胶质细胞可以向受损区域延伸其突起，例如响应于代谢型(metabotropic)atp受体p2y(12)被从受损组织释放的atp刺激而延伸其突起。
[0088]
在一个实施方案中，可以基于小胶质细胞突起向脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)延伸的水平测量小胶质细胞活性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素促进小胶质细胞向脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)延伸突起。梭菌神经毒素可以促进小胶质细胞向感染部位(或由于感染引起的脑组织损伤的部位)延伸突起。梭菌神经毒素可以促进小胶质细胞向脑肿瘤部位(或脑肿瘤所致脑组织损伤的部位)延伸突起。梭菌神经毒素可以促进小胶质细胞向中风部位(或中风所致脑组织损伤的部位)延伸突起。
[0089]
术语“小胶质细胞突起延伸(microglia process extension)”涉及小胶质细胞细长突起的长度延伸，所述突起使得细胞如借助趋化过程移行(连同其他功能)成为可能。例如，本发明的方法中小胶质细胞突起的数目和/或长度可以增加。
[0090]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞突起延伸相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞突起延伸可以增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(优选地至少5％)。例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞突起延伸相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞突起延伸(在本文所述的任何实施方案中)可以增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少60％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞突起延伸相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞突起延伸可以增加至少80％、90％或100％。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞突起延伸相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞突起延伸可以增加至少125％、150％或200％。
[0091]
在一个实施方案中，可以基于脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性水平测量小胶质细胞活性。梭菌神经毒素可以促进脑组织损伤部位(例如神经组织损伤)处的小胶质细胞吞噬活性。梭菌神经毒素可以促进感染部位(或感染所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞吞噬活性。梭菌神经毒素可以促进脑肿瘤部位(或脑肿瘤所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞吞噬活性。梭菌神经毒素可以促进中风部位(或中风所致脑组织损伤的部位)处的小胶质细胞吞噬活性。
[0092]
术语“小胶质细胞吞噬活性”(又称作“小胶质细胞的吞噬活性”)指小胶质细胞吞没细胞物质(包括在脑组织损伤后吞没细胞碎片，以及异物如微生物)。当吞没细胞碎片时，术语“小胶质细胞吞噬活性”可以在本文中与术语“小胶质细胞清除细胞碎片”同义使用。可以通过检测脑组织损伤部位处细胞碎片清除情况来测量吞噬活性。
[0093]
术语“细胞碎片(cell debris)”优选地指从死神经元释放的细胞组分。
[0094]
例如，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞吞噬
活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞吞噬活性(在本文所述的任何实施方案中)可以升高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选地至少30％)。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞吞噬活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞吞噬活性可以升高至少80％、90％或100％。在一些实施方案中，与本发明梭菌神经毒素不存在下(或备选性多肽存在下)的小胶质细胞吞噬活性相比时，在本发明梭菌神经毒素存在下所述小胶质细胞吞噬活性可以升高至少125％、150％或200％。
[0095]
发明人已经惊讶地展示，梭菌神经毒素介导的神经免疫应答促进可以快速发生，即可以促进损伤应答早期启动。另外，受促进的应答可以为急性的，例如一旦组织损伤/侵入性损伤已经清除就减弱，从而缓解长期
‘
过度活跃性’应答的任何不利作用。
[0096]
在一个实施方案中，脑组织损伤(例如神经元组织损伤)出现后≤2分钟、≤4分钟、≤6分钟、≤8分钟、≤10分钟、≤12分钟、≤14分钟、≤16分钟、≤18分钟或≤20分钟促进神经免疫应答。在一个优选的实施方案中，脑组织损伤出现后≤10分钟促进神经免疫应答。
[0097]
术语“脑组织损伤”(例如神经元组织损伤)可以是由本文所述脑病造成的损伤。例如，在脑病为感染情况下，脑组织损伤可以由微生物感染造成。
[0098]
在一个实施方案中，施用梭菌神经毒素后≤2分钟、≤4分钟、≤6分钟、≤8分钟、≤10分钟、≤12分钟、≤14分钟、≤16分钟、≤18分钟或≤20分钟促进神经免疫应答。在优选的实施方案中，施用梭菌神经毒素后≤10分钟促进神经免疫应答。
[0099]
可以在脑组织损伤出现后促进神经免疫应答持续≤48小时、≤36小时、≤24小时或≤12小时(优选地≤24小时)。例如，所述时间段后可能不存在梭菌神经毒素介导的神经免疫促进；换言之，脑组织损伤出现后48小时，36小时，24小时，或48小时(优选地24小时)之后，可能不存在梭菌神经毒素介导的神经免疫应答促进。在这类实施方案中，可以称梭菌神经毒素促进急性神经免疫应答。术语“无梭菌神经毒素介导的促进”意指神经免疫应答基本上不增加，例如“基本上不增加”适当地意指神经免疫应答增加可以是小于5％、3％或1％(优选地0％，此时神经免疫应答完全不增加)。
[0100]
如上文所述，本文的脑病/脑损伤是可以通过促进患者中的神经免疫应答加以治疗的疾病。
[0101]
这类疾病可以源自脑内部或外部，并且包括与造成脑组织损伤的身体损伤相关的疾病。以举例方式，在中风时，堵塞血管可以阻断或减少向脑供应血液，导致脑中氧耗尽并且因此导致神经细胞死亡。因此造成的神经损伤可以奠定患有所述脑病的患者所遭受症状的基础。
[0102]
因此，本发明的梭菌神经毒素可以用于治疗造成脑组织损伤(例如神经组织损伤)的脑病，例如通过促进神经免疫应答来治疗。
[0103]
本发明涵盖的脑病实例包括以下任一者(或多者)：创伤性脑损伤、癌症(例如脑肿瘤)、传染性疾病、中风、神经变性病、脑动脉瘤、多发性硬化、缺氧性损伤、中毒性损伤和代谢性损伤。
[0104]“脑病”可以更具体地指脑组织损伤(例如神经组织损伤)。在这种情况下，可以称脑病由以下任一者(或多者)引起：创伤性脑损伤、癌症(例如脑肿瘤)、传染性疾病、中风、神经变性病、脑动脉瘤、多发性硬化、缺氧性损伤、中毒性损伤和代谢性损伤。
[0105]
在优选的实施方案中，脑病由无创脑损伤造成。无创脑损伤可以是疾病、氧剥夺、代谢疾病、动脉瘤和/或心脏停搏的结果。无创脑损伤可以区别于“创伤性脑损伤(traumatic brain injury)”(tbi)，后者一般由破坏脑功能的头部物理打击或震动或贯通性头部损伤造成。
[0106]
在一个实施方案中，脑病不由“创伤性脑损伤”(tbi)造成。
[0107]
无创脑损伤可以由选自以下的一者或多者定义：癌症(例如脑肿瘤)、传染性疾病、中风、神经变性病、脑动脉瘤、多发性硬化症、缺氧性损伤、中毒性损伤和代谢损伤(优选地癌症、传染性疾病和中风；更优选地传染性疾病)。
[0108]
本发明脑病的优选实例可以选自由癌症、传染性疾病和中风所致的脑病。也就是说，脑病可以由癌症、传染性疾病和/或中风造成。
[0109]
一种特别合适的脑病是传染性疾病。也就是说，脑病可以由传染性疾病造成。
[0110]
感染可以造成脑发炎(脑炎)。病毒是最常见的脑炎病因。感染还可以造成覆盖脑的组织层(脑膜)发炎，所得疾病称作脑膜炎(meningitis)。经常地，细菌性脑膜炎扩散至脑本身，造成脑炎(encephalitis)。类似地，造成脑炎的病毒性感染也经常造成脑膜炎。当脑和脑膜均感染时，该疾病称作脑膜脑炎(meningoencephalitis)。然而，主要侵袭脑膜的感染通常称作脑膜炎，并且主要侵袭脑的感染通常称作脑炎。
[0111]
传染性疾病可以指微生物感染，例如微生物选自细菌、病毒、真菌、寄生体和原生生物(更优选地选自细菌和真菌)。因此，传染性疾病可以由含有核酸(dna、rna或二者)的传染物造成，这可能与朊蛋白感染物形成反差。传染性疾病可以因此区别于朊蛋白病。
[0112]
在一个实施方案中，传染性疾病选自脑炎、脑膜炎和脑脓肿(优选地脑炎和脑膜炎)。因此，在一个实施方案中，脑病可以是脑炎。在一个实施方案中，脑病可以是脑膜炎。
[0113]
在一个实施方案中，脑病由神经变性病造成。所述神经变性病可以选自：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森病相关疾病、运动神经元病(例如肌萎缩性侧索硬化症)、朊病毒病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)、共济失调、hallervorden-spatz病和额颞叶变性。
[0114]
在一个实施方案中，脑病由中风引起。所述中风可以是缺血性中风(例如缺少到达脑的血流)或出血性中风(例如脑内出血)。
[0115]
如本文所用的“患者”(其可以与术语“受试者”同义使用)可以是哺乳动物，如人或其他哺乳动物。优选地，“患者”是指人类受试者。
[0116]
患者可以是具有低于平均(基础水平)神经免疫应答的患者，例如接受可能抑制免疫系统的替代治疗(如化疗)的患者。例如，患者可以为免疫受损。患者可以因任何基础性疾病或因年老状态(例如患者＞60岁或70岁)而免疫受损。额外地或备选地，患者可以因施用替代疗法(例如，如上文提到，化疗)而免疫受损。后者代表其中免疫受损状态受
‘
诱导’的不同患者亚群，并且这类患者尤其可以得益于本文所述的治疗。
[0117]
如本文所用的术语“病症”还涵盖“疾病”。在一个实施方案中，病症是疾病。
[0118]
如本文所用的术语“治疗”或“治疗着”涵盖预防性治疗(例如预防疾病发作)以及矫正性治疗(治疗已经患病的受试者)。优选地，如本文所用的“治疗”或“治疗着”意指矫正性治疗。
[0119]
如本文所用的术语“治疗”或“治疗着”指治疗疾病和/或其症状。
[0120]
因此，本发明的梭菌神经毒素可以以治疗有效量或预防有效量施用至患者。优选地，本发明的梭菌神经毒素按治疗有效量施用至患者。
[0121]“治疗有效量”是梭菌神经毒素的任何量，所述量单独施用或另一种药剂联合施用至患者用于治疗所述疾病(或其症状)时足以实现治疗疾病或其症状。
[0122]“预防有效量”是梭菌神经毒素的任何量，所述量单独施用或另一种药剂联合施用至患者抑制或推迟疾病(或其症状)发作或复发。在一些实施方案中，预防有效量完全防止疾病发作或复发。“抑制”发作意指削减疾病(或其症状)发作的可能性或完全防止发作。
[0123]
本发明的梭菌神经毒素可以以施用受试者的任何适合方式配制，例如作为药物组合物的部分配制。因此，在一个方面，本发明提供用于本文所述任何治疗方法的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的梭菌神经毒素和可药用载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。
[0124]
在一些实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以处于单链形式，而在其他实施方案中，梭菌神经毒素可以处于双链形式，例如其中两条链由二硫桥连接。优选地，梭菌神经毒素处于双链形式。
[0125]
可以配制本发明的梭菌神经毒素用于经口、肠胃外、连续输注、吸入或局部施用。适于注射的组合物可以处于溶液剂、混悬剂或乳剂或使用前溶解或悬浮于合适溶媒中的干粉剂形式。
[0126]
在梭菌神经毒素待局部递送的情况下，可以将梭菌神经毒素配制为乳膏剂(例如，用于局部施用)或皮下注射剂。
[0127]
局部递送手段可以包括气溶胶剂或其他喷雾剂(例如雾化剂)。在这个方面，梭菌神经毒素气溶胶制剂能够实现递送至肺部和/或其他鼻通道和/或支气管通道或气道。
[0128]
本发明的梭菌神经毒素可以通过脊柱中涉及神经支配受累器官的脊柱区段层面进行鞘内或硬膜外注射向受试者施用。
[0129]
施用途径可以借助注射或局限化注射。在一个实施方案中，将本发明的梭菌神经毒素在损伤部位或其附近、优选地在损伤部位施用。在一个实施方案中，本发明梭菌神经毒素的施用途径可以是神经周、神经内、椎管内和/或鞘内。
[0130]
梭菌神经毒素可以皮下和/或颅内施用。例如，梭菌神经毒素可以颅内施用(例如向存在神经损伤的任何适宜的脑区域)。例如，可以通过皮质内施用(例如皮质内注射)施用梭菌神经毒素。可以将梭菌神经毒素施用至躯体感觉皮质。可以将梭菌神经毒素施用至额叶皮层中。
[0131]
可以使用颅内施用(如颅内注射)允许直接施用至脑。
[0132]
施用本发明梭菌神经毒素的剂量范围是旨在产生预期治疗作用和/或预防作用的那些剂量范围。可以理解，所需的剂量范围取决于梭菌神经毒素或组合物的精确性质、施用途径、制剂的性质、受试者年龄、受试者病状的性质、范围或严重程度、禁忌症(若有的话)和主治医生的判断。可以使用标准经验例行程序调节这些剂量水平的变动来优化。
[0133]
在一个实施方案中，梭菌神经毒素的剂量是平剂量(flat dose)。平剂量可以为50pg至250μg，优选地100pg至100μg。在一个实施方案中，平剂量可以是至少50pg、100pg、500pg、1ng、50ng、100ng、500ng、1μg或50μg。所述剂量可以是单个平剂量。
[0134]
流体剂型一般使用梭菌神经毒素和无热原无菌溶媒制备。取决于所用的溶媒和浓
度，梭菌神经毒素可以溶解或悬浮于溶媒中。在制备溶液剂时，梭菌神经毒素可以溶解于溶媒中，如果需要，通过添加氯化钠，使该溶液剂等渗，并且使用无菌技术用无菌滤器过滤进行除菌，之后灌装到合适的无菌小瓶或安瓿中并密封。备选地，如果溶液剂足够稳定，通过高压灭菌在溶液剂的密封容器中对溶液剂灭菌。有利地可以将添加剂如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂溶解于溶媒中。
[0135]
可以通过使用无菌技术在无菌区域，将预灭菌的成分灌装入无菌容器中，制备使用前溶解或悬浮于合适溶媒中的干粉剂。备选地，可以使用无菌技术在无菌区域，在合适的容器中溶解诸成分随后将产品冷冻干燥并且无菌密封容器。
[0136]
适于本文所述施用途径的肠胃外混悬剂按基本上相同的方式制备，例外是无菌组分悬浮于、而非溶解于无菌溶媒中，且不能通过过滤实现灭菌。组分可以以无菌状态分离或备选地，它可以在分离后灭菌，例如通过γ照射灭菌。
[0137]
有利地，组合物中包含助悬剂例如聚乙烯吡咯烷酮以促进组分均匀分布。
[0138]
根据本发明的施用可以利用多种递送技术，包含微粒子囊化法或高压气溶胶碰撞法(high-pressure aerosol impingement)。
[0139]
梭菌神经毒素可以在本文所述脑病造成的脑组织损伤(例如神经组织损伤)发作之前、与之同时或继其之后施用。例如，在脑病由感染造成时，梭菌神经毒素可以继检出感染之后施用，以促进神经免疫应答介导的感染清除。
[0140]
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)之前施用。也就是说，梭菌神经毒素可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现之前施用。
[0141]
谈及“脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现之前施用梭菌神经毒素”，其包括之前已出现脑组织损伤的情形。例如，可以施用梭菌神经毒素以促进神经免疫应答来治疗或预防进一步的脑组织损伤。这在本文所述可以预计(进一步的)组织损伤的脑病背景下有利。
[0142]
在一个实施方案中，梭菌神经毒素在脑组织损伤(例如神经组织损伤)之前多达4天施用。梭菌神经毒素可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现前1-3天之间施用。梭菌神经毒素可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)前3天施用。在优选的实施方案中，梭菌神经毒素可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)前≤24小时施用。
[0143]
发明人已经展示，施用梭菌神经毒素可以导致快速促进神经免疫应答。因此，梭菌神经毒素可以在脑组织损伤已经出现和/或将要出现(或疑似已经出现和/或正在出现)之时施用，以促进神经免疫应答响应于损伤。
[0144]
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可在脑组织(例如神经组织)损伤后48小时以内(例如在小于或等于4小时内)施用。例如，可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现后≤10分钟、≤30分钟、≤1小时、≤2小时、≤5小时、≤12小时、≤34小时、≤3小时或≤48小时施用梭菌神经毒素。优选地，可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现后≤2小时施用梭菌神经毒素。更优选地，可以在脑组织损伤(例如神经组织损伤)出现后1-10分钟以内施用梭菌神经毒素。
[0145]
如本公开中他处更详细解释，术语“梭菌神经毒素”包括其梭菌神经毒素片段。
[0146]
现在下文提供关于梭菌神经毒素和合适用于本发明中的神经毒素的其他信息。
[0147]
在一个实施方案中，本发明涵盖包含梭菌神经毒素l链和梭菌神经毒素h链的全长梭菌神经毒素的用途，任选地条件是所述梭菌神经毒素l链无催化活性。
[0148]
术语“梭菌神经毒素”包含由肉毒梭菌(肉毒神经毒素血清型a、b、c1、d、e、f、g和x)、破伤风梭菌(c.tetani)(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(c.butyricum)(肉毒神经毒素血清型e)和巴拉迪梭菌(c.baratii)(肉毒神经毒素血清型f)产生的毒素以及从前述任一者衍生的修饰的梭菌神经毒素或衍生物。
[0149]
肉毒神经毒素(bont)由肉毒梭菌以大蛋白质复合体形式产生，所述的大蛋白质复合体由本身与众多辅助蛋白复合的bont组成。目前存在八个不同类别的肉毒神经毒素，即：肉毒神经毒素血清型a、b、c1、d、e、f、g和x，这些血清型均共有相似的结构和作用模式。不同的bont血清型可以基于被特定的中和性抗血清失活而区分，而借助血清型的这种分类与氨基酸层面的序列同一性百分数相关。基于氨基酸序列同一性百分数，将给定血清型的bont蛋白进一步划分成不同亚型。
[0150]
bont在胃肠道中吸收，并且在进入体循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合并阻止其释放神经递质乙酰胆碱。bont/b、bont/d、bont/f和bont/g切割小突触小泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(vamp)；bont/cl、bont/a和bont/e切割25kda突触小体相关蛋白(snap-25)；并且bont/c1切割突触融合蛋白。已经发现bont/x切割snap-25、vamp1、vamp2、vamp3、vamp4、vamp5、ykt6和突触融合蛋白1。
[0151]
破伤风毒素以单一血清型由破伤风梭菌产生。丁酸梭菌产生bont/e，而巴拉迪梭菌产生bont/f。
[0152]
术语“梭菌神经毒素”意在涵盖全长神经毒素(包含梭菌神经毒素l链和梭菌神经毒素h链)以及其片段。例如，“梭菌神经毒素”可以指包含梭菌神经毒素l链、梭菌神经毒素转运结构域(hn)和/或梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)结构域或由其组成的多肽。“梭菌神经毒素”可以指包含梭菌神经毒素l链、梭菌神经毒素转运结构域(hn)和/或梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)结构域或由其组成的多肽，其中当多肽包含梭菌神经毒素l链时，l链无催化活性。
[0153]
有利地，梭菌神经毒素片段的使用允许使用无毒(或基本上无毒)的梭菌神经毒素片段，其中鉴于(与全长h链或全长梭菌神经毒素相比)尺寸较小，所述片段不太可能在施用所述片段的受试者中激发(针对所述片段的)不良免疫应答。另外，无毒(或基本上无毒)的片段不太昂贵和/或制造上相比全长梭菌神经毒素不太复杂。另外，无毒(或基本上无毒)的片段构成比全长梭菌的毒素更充分确定的治疗药，并且鉴于多肽长度较短，例如结构域之间的半胱氨酸改组的概率降低。
[0154]
在涉及梭菌神经毒素特定结构域的实施方案中，该分子可以便利地称作“多肽”。即，术语“梭菌神经毒素”可以用术语“多肽”替代。
[0155]
因此，本文提及的梭菌神经毒素可以是包含梭菌神经毒素轻链(l链)、梭菌神经毒素转运结构域(hn结构域)和/或梭菌神经毒素受体结合结构域(hc结构域)或由其组成的多肽。本文提及的梭菌神经毒素可以是包含梭菌神经毒素轻链(l链)、梭菌神经毒素转运结构域(hn结构域)和/或梭菌神经毒素受体结合结构域(hc结构域)或由其组成的多肽，其中当多肽包含梭菌神经毒素l链时，l链无催化活性。
[0156]
因此随之而来的是，本发明的诸方面提供以下任一者：
[0157]-一种用于(例如通过促进神经免疫应答)治疗脑病的方法中的多肽。
[0158]-一种(例如通过促进神经免疫应答)治疗患者脑病的方法，所述方法包括向患者
施用多肽；
[0159]-多肽在制造药物以(例如通过促进神经免疫应答)治疗患者脑病的用途。
[0160]
其中所述肽包含梭菌神经毒素轻链(l链)、梭菌神经毒素转运结构域(hn结构域)和/或梭菌神经毒素受体结合结构域(hc结构域)或由其组成的多肽，任选地其中多肽包含梭菌神经毒素l链时，l链无催化活性。
[0161]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中任一者具有至少70％序列同一性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以由包含seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中任一者的核苷酸序列编码。
[0162]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者具有至少70％序列同一性的梭菌神经毒素序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的梭菌神经毒素序列。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者的梭菌神经毒素序列。
[0163]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51、52、53、54、55、56、57、58或59(优选地seq id no：51、52、53、54、55、56、57或59)中任一者具有至少70％序列同一性的梭菌神经毒素序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51、52、53、54、55、56、57、58或59(优选地seq id no：51、52、53、54、55、56、57或59)中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的梭菌神经毒素序列。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含seq id no：51、52、53、54、55、56、57、58或59(优选地seq id no：51、52、53、54、55、56、57或59)中任一者的梭菌神经毒素序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51具有至少70％序列同一性的梭菌神经毒素序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51具有至少800％、900％、95％或98％序列同一性的梭菌神经毒素序列。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含seq id no：51的梭菌神经毒素序列。
[0164]
术语“梭菌神经毒素”还意在包括修饰的梭菌神经毒素及其衍生物，包括但不限于下文描述的那些。修饰的梭菌神经毒素或衍生物可以含有如相比天然(未修饰)形式的梭菌神经毒素已经过修饰的一个或多个氨基酸，或可以含有在天然(未修饰)形式的梭菌神经毒素中不存在的一个或多个插入的氨基酸。以举例方式，修饰的梭菌神经毒素可以在一个或多个结构域中相对于天然(未修饰)的梭菌神经毒素序列具有修饰的氨基酸序列。这类修饰可以调节该毒素的功能方面，例如生物学活性或持久性。因此，在一个实施方案中，本发明
的梭菌神经毒素是修饰的梭菌神经毒素，或修饰的梭菌神经毒素衍生物，或梭菌神经毒素衍生物。
[0165]
修饰的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(如修饰的hc结构域)，其中所述修饰的重链以高于或低于天然(未修饰)梭菌神经毒素的亲和力与靶神经细胞结合。这类在hc结构域中的修饰可以包括修饰在hc结构域的神经节苷脂结合位点中或蛋白质(sv2或突触结合蛋白(synaptotagmin))结合位点中的残基，所述修饰改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体的结合。wo 2006/027207和wo 2006/114308中描述了这类修饰的梭菌神经毒素的实例，所述文献因而通过引用的方式完整并入本文作为参考。
[0166]
修饰的梭菌神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如在底物结合或催化结构域中的修饰，所述修饰可以改变或调节已修饰l链的snare蛋白特异性。wo 2010/120766和us 2011/0318385中描述了这类修饰的梭菌神经毒素的实例，所述文献因而通过引用的方式完整并入本文作为参考。
[0167]
修饰的梭菌神经毒素可以包含一个或多个增加或减少已修饰梭菌神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性的修饰。例如，修饰的梭菌神经毒素可以包含基于亮氨酸或基于酪氨酸的基序，其中所述基序增加或减少修饰的梭菌神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xdxxxll、xexxxll、xexxxil和xexxxlm(其中x是任何氨基酸)。合适的基于亮氨酸的基序包含y-x-x-hy(其中hy是疏水性氨基酸)。wo 2002/08268中描述了包含基于亮氨酸的基序或基于酪氨酸的基序的修饰梭菌神经毒素的实例，所述文献因而通过引用方式完整地并入本文作为参考。
[0168]
如上文所述，修饰的梭菌神经毒素(或梭菌神经毒素片段)可以是一种梭菌神经毒素，其包含与缺少所述一个或多个修饰的等同未修饰梭菌神经毒素相比时增加梭菌神经毒素等电点的一个或多个修饰。上文及wo 2015/004461 a1和wo 2016/110662 a1中描述了合适的修饰梭菌神经毒素，所述文献通过引用的方式并入本文作为参考。示例性序列包括本文所述的seq id no：61和42。
[0169]
修饰的梭菌神经毒素可以优选地包含seq id no：61的序列或由其组成。
[0170]
术语“梭菌神经毒素”意在包含杂合和嵌合梭菌神经毒素。杂合梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分和来自另一梭菌神经毒素或梭菌神经毒素亚型的重链的至少一部分。在一个实施方案中，杂合梭菌神经毒素可以含有来自一个梭菌神经毒素亚型的轻链的完整轻链和来自另一个梭菌神经毒素亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合梭菌神经毒素可以含有一个梭菌神经毒素亚型重链的部分(例如结合结构域)，以及来自另一个梭菌神经毒素亚型的重链的另一个部分。类似地或备选地，治疗性元件可以包含来自不同梭菌神经毒素的轻链部分。这类杂合或嵌合梭菌神经毒素例如可用作向以下受试者输送这类梭菌神经毒素的治疗益处的手段：对给定梭菌神经毒素亚型免疫抵抗的受试者、可能对给定的梭菌神经毒素重链结合结构域具有较低平均浓度受体的受试者或可能具有膜底物或小泡毒素底物(例如，snap-25、vamp和突触融合蛋白)的抗蛋白酶变体的受试者。us 8,071,110中描述了杂合和嵌合梭菌神经毒素，所述公开因而通过引用方式完整地并入本文作为参考。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(或其片段)是杂合梭菌神经毒素或嵌合梭菌神经毒素。
[0171]
在一个特别优选的实施方案中，本发明的多肽可以是包含bont/a轻链与转运结构域和bont/b受体结合结构域(hc结构域)或其部分(优选地由其组成)的嵌合梭菌神经毒素(例如bont/a lh
n-bont/b hc)。合适的嵌合和/或杂合梭菌神经毒素可以在wo2017/191315a1中教授的一种梭菌神经毒素，所述文献通过引用方式并入本文作为参考。这类优选的序列包括seq id no：44、63和64。
[0172]
例如，嵌合梭菌神经毒素可以包含seq id no：64的序列(其可以称为包含无催化活性l链)(优选地由其组成)。
[0173]
在优选的实施方案中，嵌合梭菌神经毒素可以包含seq id no：63的序列(优选地由其组成)。
[0174]
bont/a lhn结构域可以与bont/b hc结构域共价连接。所述嵌合bont/a在本文中也称作“bont/ab”或“bont/ab嵌合体”。
[0175]
lhn结构域c端氨基酸残基可以对应于分隔bont/a的lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的第一氨基酸残基，并且hc结构域的n端氨基酸残基可以对应于分隔bont/b的lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的第二氨基酸残基。
[0176]
本文中谈及的“分隔bont/a的lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的第一氨基酸残基”意指分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的n端残基。
[0177]
本文中谈及的“分隔bont/b的lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的第二氨基酸残基”意指在分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的n端残基之后的氨基酸残基。
[0178]“3
10
螺旋”是在蛋白质和多肽中存在的一种二级结构类型，蛋白质和多肽中存在的二级结构类型还有α-螺旋、β-折叠和反向转角(reverse tums)。3
10
螺旋中的氨基酸按右手螺旋结构排列，其中每个完整转角由三个残基和分隔这些残基之间分子内氢键的十个原子完成。每个氨基酸对应于螺旋中的120
°
转角(即，该螺旋具有每个转角三个残基)和沿螺旋轴平移并且在产生氢键所形成的环中具有10个原子。最重要的，氨基酸的n-h基团与更靠前三个残基的氨基酸的c＝o基团形成氢键；这种重复的i+3
→
i氢键合界定了3
10
螺旋。3
10
螺旋是结构生物学中本领域普通技术人员熟悉的标准概念。
[0179]
这种3
10
螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和二个帽(或过渡)残基，在这四个残基的每个末端处有一个。如本文所用的术语“分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋”由这6个残基组成。
[0180]
通过实施结构分析和序列比对，鉴定到一个分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋。这个3
10
螺旋在其n末端(即在lhn结构域的c端部分)被α-螺旋包围并且在其c末端(即在hc结构域的n端部分)被β链包围。这个3
10
螺旋的第一(n末端)残基(帽或过渡残基)还对应于这种α-螺旋的c末端残基。
[0181]
分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋可以例如从可公开获得的肉毒神经毒素晶体结构确定，例如分别地从肉毒神经毒素a1和b1的3bta(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝3bta)和1epw(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝1epw)确定。
[0182]
可公开获得的计算机建模工具和比对工具也可以用来确定其他神经毒素中分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的位置，例如同源性建模服务器loopp(learning，observing and outputting protein patterns(学习、观察和输出蛋白质模式)，http：//
loopp.org)、phyre(protein homology/analogy recognition engine(蛋白质同源性/类比y识别引擎)，http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和rosetta(https：//www.rosettacommons.org/)、蛋白质叠加服务器superpose(http：//wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比对程序clustal omega(http：//www.clustal.org/omega/)和在internet resources for molecular and cell biologists(分子生物学家和细胞生物学家互联网资源)(http：//molbiol-tools.ca/)列示的众多其他工具/服务。特别地，“hn/h
cn”交接处周围的区域在结构上高度保守，这使得其成为叠加不同血清型的理想区域。
[0183]
例如，以下方法体系可以用来确定其他神经毒素中这种3
10
螺旋的序列：
[0184]
1.使用结构同源性建模工具loop(http：//loopp.org)用来基于bont/a1晶体结构(3bta.pdb)获得其他bont血清型的预测结构；
[0185]
2.编辑如此获得的结构(pdb)文件以仅包含h
cn
结构域的n末端及其之前的约80个残基(它们是hn结构域的部分)，因而保留结构上高度保守的“hn/h
cn”区；
[0186]
3.使用蛋白质叠加服务器superpose(http：//wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)用来将每种血清型叠加到3bta.pdb结构上；
[0187]
4.视捡叠加的pdb文件以定位bont/a1的hc结构域起始处的3
10
螺旋，并且随后鉴定其他血清型中的相应残基；
[0188]
5.将其他bont血清型序列用clustal omega比对旨在核实相应残基是正确的。
[0189]
下文呈献通过这种方法确定的lhn结构域、hc结构域和3
10
螺旋结构域的实例：
[0190]
[0191][0192]
使用结构的分析和序列比对，发现在分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋后的β链是全部肉毒神经毒素和破伤风神经毒素中的保守结构并且当自分隔lhn结构域和hc结构域的3
10
螺旋的第一残基起始时，3
10
螺旋后的β链始于第8个残基(例如，在bont/a1的残基879处)。
[0193]
bont/ab嵌合体可以包含来自bont/a的lhn结构域，后者与来自bont/b的hc结构域
共价连接，
[0194]
·
其中lhn结构域的c端氨基酸残基对应于β链n末端的位于bont/a hc结构域起点(n端)处的第八个氨基酸残基，并且
[0195]
·
其中hc结构域的n端氨基酸残基对应于β链n末端的位于bont/b hc结构域起点(n端)处的第七个氨基酸残基。
[0196]
bont/ab嵌合体可以包含来自bont/a的lhn结构域，后者与来自bont/b的hc结构域共价连接，
[0197]
·
其中lhn结构域的c端氨基酸残基对应于位于bont/a的lhn结构域的末端(c末端)处α-螺旋的c端氨基酸残基，并且
[0198]
·
其中hc结构域的n端氨基酸残基对应于位于bont/b的lhn结构域的末端(c末端)处α-螺旋c端氨基酸残基的c端紧邻的氨基酸残基。
[0199]
bont/ab嵌合体设计流程的原理是尽量确保二级结构不受损伤并且因而最大限度对三级结构及对每个结构域的功能最小化任何更改。不希望受理论约束，假设通过不破坏bont/ab嵌合体中3
10
螺旋的四个中央氨基酸残基，确保嵌合神经毒素的构象最佳，因而允许嵌合神经毒素尽最大能力发挥其功能。
[0200]
来自bont/a的lhn结构域可以对应于seq id no：62的氨基酸残基1至872或与之具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自bont/a的lhn结构域可以对应于seqq id no：62的氨基酸残基1至872或与之具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自bont/a的lhn结构域对应于seq id no：62的氨基酸残基1至872。
[0201]
来自bont/b的hc结构域可以对应于seq id no：52的氨基酸残基860至1291或与之具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自bont/b的hc结构域可以对应于seq id no：52的氨基酸残基860至1291或与之具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自bont/b的hc结构域对应于seq id no：52的氨基酸残基860至1291。
[0202]
优选地，bont/ab嵌合体包含bont/a lhn结构域和bont/b hc结构域。更优选地，lhn结构域对应于bont/a(seq id no：62)的氨基酸残基1至872并且hc结构域对应于bont/b(seq id no：52)的氨基酸残基860至1291。
[0203]
优选地，bont/b hc结构域还包含h
cc
亚结构域中的至少一个氨基酸残基置换、添加或删除，如与天然bont/b序列相比，所述置换、添加或删除具有增加bont/b神经毒素对人syt ii的结合亲和力的作用。bont/b h
cc
亚结构域中的合适氨基酸残基置换、添加或删除已经在wo 2013/180799中和wo 2016/154534中公开(二者均通过引用方式并入本文作为参考)。
[0204]
bont/b h
cc
亚结构域中的合适氨基酸残基置换、添加或删除包括选自v1118m；y1183m；e1191m；e1191i；e1191q；e1191t；s1199y；s1199f；s1199l；s1201v；e1191c、e1191v、e1191l、e1191y、s1199w、s1199e、s1199h、w1178y、w1178q、w1178a、w1178s、y1183c、y1183p的置换突变及其组合。
[0205]
bont/b h
cc
亚结构域中的合适氨基酸残基置换、添加或删除还包括选自以下的二种置换突变的组合：e1191m和s1199l、e1191m和s1199y、e1191m和s1199f、e1191q和s1199l、e1191q和s1199y、e1191q和s1199f、e1191m和s1199w、e1191m和w1178q、e1191c和s1199w、e1191c和s1199y、e1191c和w1178q、e1191q和s1199w、e1191v和s1199w、e1191v和s1199y或
e1191v和w1178q。
[0206]
bont/b h
cc
亚结构域中的合适氨基酸残基置换、添加或删除还包括三个置换突变e1191m、s1199w和w1178q的组合。
[0207]
优选地，bont/b h
cc
亚结构域中的合适氨基酸残基置换、添加或删除包括二个置换突变e1191m和s1199y的组合。
[0208]
修饰可以是与seq id no：52所示的未修饰的bont/b相比时的修饰，其中通过与seq id no：52比对确定氨基酸残基编号。由于seq id no：52的位置1处甲硫氨酸残基的存在为任选，故在确定氨基酸残基编号时，本领域普通技术人员将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在seq id no：52包括甲硫氨酸情况下，位置编号将如上文所述(例如e1191将是seq id no：52的e1191)。备选地，在甲硫氨酸从seq id no：52中缺少情况下，氨基酸残基编号应当按-1修改(例如e1191将是seq id no：52的e1190)。当本文所述其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，相似的注意事项适用，并且本领域普通技术人员将使用本领域常规的技术轻易地确定正确的氨基酸残基编号。
[0209]
因此，在一个方面，本发明提供用于通过促进神经免疫应答治疗受试者脑病的梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0210]
在一个相关方面，提供一种通过促进神经免疫活性治疗受试者脑病的方法，所述方法包括向受试者施用梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0211]
在又一个相关方面，提供梭菌神经毒素在制造通过促进神经免疫应答治疗受试者脑病的药物中的用途，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的梭菌神经毒素序列(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0212]
在一个方面，本发明提供用于在受试者中治疗脑病的梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0213]
在一个相关方面，提供一种在受试者中治疗脑病的方法，所述方法包括向受试者施用梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0214]
在又一个相关方面，提供梭菌神经毒素在制造治疗受试者脑病的药物中的用途，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少70％序列同一性的多肽(优选地，其中梭菌神经毒素包含与seq id no：63具有至少70％序列同一性的多肽序列)。
[0215]
在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含与seq id no：63或64具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含seq id no：63或64所示的多肽序列(更优选地由其组成)。
[0216]
例如，根据本发明使用的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：64具有至少80％、
id no：52显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/c。参考bont/c序列作为seq id no：53显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/d。参考bont/d序列作为seq id no：54显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/e。参考bont/e序列作为seq id no：55显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/f。参考bont/f序列作为seq id no：56显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/g。参考bont/g序列作为seq id no：57显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是tent。参考tent序列作为seq id no：58显示。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是bont/x。参考bont/x序列作为seq id no：59显示。
[0227]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含bont/a的片段或bont/f的片段。在另一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含bont/a或bont/f的无催化活性l链。例如，本发明的梭菌神经毒素可以包含bont/a的无催化活性l链。
[0228]
在本文所述梭菌神经毒素具有纯化用标签(例如his标签)和/或接头的实施方案中，所述标签和/或接头是任选的。
[0229]
本文中描述了合适的全长梭菌神经毒素。
[0230]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64嵌65中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含含有seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者的多肽序列，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。
[0231]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以是与seq id no：1、9、11、13、15、17、25、33或60中任一者具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素是与seq id no：1、9、11、13、15、17、25、33或60中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。优选地，本发明的梭菌神经毒素是包含seq id no：1、9、11、13、15、17、25、33或60中任一者的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。
[0232]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。优选地，本发明的梭菌神经毒素包含seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中任一者，优选地条件是所述梭菌神经毒素的梭菌神经毒素l链无催化活性。
[0233]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素是选自bont/a、bont/b、bont/c、bont/
d、bont/e、bont/f、bont/g、bont/x和tent的全长梭菌神经毒素。
[0234]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素是选自bont/b、bont/c、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g、bont/x和tent的全长梭菌神经毒素。
[0235]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51-59、61或63中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：51-59、61或63中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：5l-59、61或63中任一者具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：51-59、61或63中任一者。
[0236]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：52-59、61或63中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：52-59、61或63中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：52-59、61或63中任一者具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：52-59、61或63中任一者。
[0237]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素不是全长有催化活性的梭菌神经毒素，例如不是全长有催化活性的bont/a。
[0238]
本发明的梭菌神经毒素可以包含梭菌神经毒素的片段(或由其组成)，例如本文所述的任何全长梭菌神经毒素的片段。
[0239]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列的片段。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列的片段。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以包含多肽序列的片段，所述多肽序列包含seq id no：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一者。
[0240]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素l链或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素l链的片段可以具有梭菌神经毒素l链的≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素l链的片段具有梭菌神经毒素l链的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素l链的片段可以具有梭菌神经毒素l链的20-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
[0241]
l链参考序列的实例包括：
[0242]
肉毒a型神经毒素：氨基酸残基1-448
[0243]
肉毒b型神经毒素：氨基酸残基1-440
[0244]
肉毒c1型神经毒素：氨基酸残基1-441
[0245]
肉毒d型神经毒素：氨基酸残基1-445
[0246]
肉毒e型神经毒素：氨基酸残基1-422
[0247]
肉毒f型神经毒素：氨基酸残基1-439
[0248]
肉毒g型神经毒素：氨基酸残基1-441
[0249]
破伤风神经毒素：氨基酸残基1-457
[0250]
对于最近鉴定的bont/x，已经将l链报道为对应于其氨基酸1-439，其中l链边界可能变动达大约25个氨基酸(例如1-414或1-464)。
[0251]
以上鉴定的参考序列应当视为向导，因为轻微变型可以根据亚血清型发生。以举例方式，us 2007/0166332(因而通过引用方式完整并入本文)援引略微不同的梭菌序列：
[0252]
肉毒a型神经毒素：氨基酸残基m1-k448
[0253]
肉毒b型神经毒素：氨基酸残基m1-k441
[0254]
肉毒c1型神经毒素：氨基酸残基m1-k449
[0255]
肉毒d型神经毒素：氨基酸残基m1-r445
[0256]
肉毒e型神经毒素：氨基酸残基m1-r422
[0257]
肉毒f型神经毒素：氨基酸残基m1-k439
[0258]
肉毒g型神经毒素：氨基酸残基m1-k446
[0259]
破伤风神经毒素：氨基酸残基m1-a457
[0260]
本文中描述了合适的梭菌神经毒素l链。
[0261]
梭菌神经毒素l链可以包含与seq id no：6、24、32或40中任一者具有至少70％序列同一性的多肽序列或其片段。在一个实施方案中，梭菌神经毒素l链包含与seq id no：6、24、32或40中任一者具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列或其片段。优选地，梭菌神经毒素l链包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：6、24、32或40中任一者或其片段。
[0262]
梭菌神经毒素l链可以是与seq id no：5、23、31或39中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素l链。在一个实施方案中，梭菌神经毒素l链是与seq id no：5、23、31或39中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素l链。优选地，梭菌神经毒素l链是包含seq id no：5、23、31或39中任一者或其片段的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素l链。
[0263]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素h链的片段(或由其组成)。梭菌神经毒素h链的片段可以具有梭菌神经毒素h链的≤800、≤700、≤600、≤500、≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素h链的片段具有梭菌神经毒素h链的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素h链的片段可以具有梭菌神经毒素h链的20-800、30-600、40-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
[0264]
梭菌神经毒素h链包含两个结构/功能结构域：转运结构域(hn)和受体结合结构域(hc)。
[0265]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素转运结构域或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素转运结构域的片段可以具有梭菌神经毒素转运结构域的≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素转运结构域的片段具有梭菌神经毒素转运结构域的至少20、30、40、50、60、70、
80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素转运结构域的片段可以具有梭菌神经毒素转运结构域的20-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
[0266]
转运结构域是梭菌神经毒素h链的片段，其大致等同于h链的氨基端半侧，或与完好h链中该片段对应的结构域。在一个实施方案中，可以通过删除hc氨基酸序列(在dna合成层面或在柱合成层面通过核酸酶或蛋白酶处理删除)消除h链的hc功能。备选地，hc功能可以通过化学处理或生物处理失活。因此，在一些实施方案中，h链可以不能与靶细胞上结合于天然梭菌神经毒素(即完整毒素)的结合位点结合。
[0267]
合适的(参考)转运结构域的实例包括：
[0268]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
[0269]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
[0270]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
[0271]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
[0272]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
[0273]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
[0274]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
[0275]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
[0276]
以上鉴定的参考序列应当视为向导，因为轻微变型可以根据亚血清型发生。以举例方式，us 2007/0166332(因而通过引用方式并入)援引略微不同的梭菌序列：
[0277]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(a449-k871)
[0278]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(a442-s858)
[0279]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(t450-n866)
[0280]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(d446-n862)
[0281]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(k423-k845)
[0282]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(a440-k864)
[0283]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(s447-s863)
[0284]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(s458-v879)
[0285]
在本发明的上下文中，多种包含转运结构域的梭菌神经毒素hn区可以用于本发明的多个方面。在一个实施方案中，这些活性片段可以促进非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌的l链)从胞内小泡释放进入靶细胞的细胞质并且因此参与执行梭菌神经毒素蛋白酶解切割底物的总体细胞机制。来自梭菌神经毒素重链的hn区为大约410-430个氨基酸长度并且包含转运结构域。研究已经显示，来自梭菌神经毒素重链的hn区的整个长度不是转运结构域的转运活性必需的。因此，这个实施方案的诸方面可以包括这些梭菌神经毒素hn区，它们包含具有例如，至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸长度的转运结构域。这个实施方案的其他方面可以包括这些梭菌神经毒素hn区，它们包含具有例如，至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸长度的转运结构域。
[0286]
关于肉毒梭菌(clostridium botulinum)和破伤风梭菌中产生毒素的更多遗传基础细节，参见henderson等人(1997)clostridia： molecular biology and pathogenesis(梭菌纲：分子生物学和发病机制)，academic press。
[0287]
术语hn包含天然存在的神经毒素hn部分和具有自然界中不存在和/或合成性氨基酸残基的氨基酸序列的修饰的hn部分。在一个实施方案中，所述修饰的hn部分仍然展示出上文提到的转运功能。
[0288]
在一个优选的实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的片段可以具有梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的片段具有梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的片段可以具有梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)的20-350、50-300或100-200个氨基酸残基。
[0289]
梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)参考序列的实例包括：
[0290]
bont/a-n872-l1296
[0291]
bont/b-e859-e1291
[0292]
bont/c1-n867-e1291
[0293]
bont/d-s863-e1276
[0294]
bont/e-r846-k1252
[0295]
bont/f-k865-e1274
[0296]
bont/g-n864-e 1297
[0297]
tent-i880-d1315
[0298]
对于最近鉴定的bont/x，已经将hc结构域报道为对应于其氨基酸893-1306，其中结构域边界可能变动大约25个氨基酸(例如868-1306或918-1306)。
[0299]
梭菌神经毒素h链可以进一步包含转运促进结构域。所述结构域促进l链递送入靶细胞的细胞溶胶并且例如在wo 08/008803和wo 08/008805中描述，所述文献的每篇通过引用方式并入本文作为参考。
[0300]
例如，转运促进结构域可以包含梭菌神经毒素h
cn
结构域或其片段或变体。更详细地，梭菌神经毒素h
cn
转运促进结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这个方面，梭菌神经毒素h
cn
转运促进结构域优选地具有最多200个氨基酸、最多225个氨基酸、最多250个氨基酸或最多275氨基酸的长度。具体(参考)实例包括：
[0301]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
[0302]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
[0303]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
[0304]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
[0305]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
[0306]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
[0307]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
[0308]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1 127)
[0309]
以上的序列位置可以根据血清型/亚型略微变动，并且合适的(参考)梭菌神经毒素h
cn
结构域的其他实例包括：
[0310]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
[0311]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
[0312]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
[0313]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
[0314]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
[0315]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
[0316]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
[0317]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1 127)
[0318]
本文中描述了合适的梭菌神经毒素hc结构域。
[0319]
梭菌神经毒素hc结构域可以包含与seq id no：8、22、30、38、42、44、46、48或50中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，梭菌神经毒素hc结构域包含与seq id no：8、22、30、38、42、44、46、48或50中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，梭菌神经毒素hc结构域包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：8、22、30、38、42、44、46、48或50中任一者或其片段。
[0320]
梭菌神经毒素hc结构域可以是与seq id no：7、21、29、37、41、43、45、47或49中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素hc结构域。在一个实施方案中，梭菌神经毒素hc结构域是与seq id no：7、21、29、37、41、43、45、47或49中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素hc结构域。优选地，梭菌神经毒素hc结构域是包含seq id no：7、21、29、37、41、43、45、47或49中任一者或其片段的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素hc结构域。
[0321]
在一个实施方案中，用于本发明中的梭菌神经毒素hc结构域是变异bont/a hc结构域。所述变异bont/a hc结构域可以包含对选自以下的一个或多个氨基酸残基的修饰：y1117、f1252、h1253和l1278。例如，变异bont/a hc结构域可以包含以下一个或多个(优选地两个或更多个)修饰：y1117v、f1252y、h1253k和l1278f或l1278h。
[0322]
在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域包含以下修饰：y1117v和h1253k；或y1117v、f1252y、h1253k和l1278f；或y1117v、f1252y、h1253k和l1278h。
[0323]
优选地，变异bont/a hc结构域包含以下修饰：y1117v和h1253k；或y1117v、f1252y、h1253k和l1278h。
[0324]
修饰可以是与seq id no：62所示的未修饰的bont/a相比时的修饰，其中通过与seq id no：62比对确定氨基酸残基编号。由于seq id no：62的位置1处甲硫氨酸残基的存在为任选，故在确定氨基酸残基编号时，本领域普通技术人员将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在seq id no：62包括甲硫氨酸情况下，位置编号将如上文定义(例如y1117将对齐seq id no：62的y1117)。在甲硫氨酸从seq id no：62中缺少情况下，氨基酸残基编号应当按-1修改(例如y1117将对齐seq id no：52的y1116)。当本文所述其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，相似的注意事项适用，并且本领域普通技术人员将使用本领域常规的技术轻易地确定正确的氨基酸残基编号。
[0325]
变异bont/a hc结构域可以包含与seq id no：46、48或50中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。在
一个实施方案中，变异bont/a hc结构域包含与seq id no：46、48或50中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域包含与seq id no：46、48或50中任一者或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。优选地，变异bont/a hc结构域包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq idno：46、48或50中任一者或其片段。
[0326]
变异bont/a hc结构域可以包含与seq id no：46或50中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域包含与seq id no：46或50中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/ahc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域包含与seq id no：46或50中任一者或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。优选地，变异bont/a hc结构域包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：46或50中任一者或其片段。
[0327]
变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45、47或49中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45、47或49中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/ahc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45、47或49中任一者或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。优选地，变异bont/a hc结构域是由seq id no：45、47或49中任一者或其片段所编码的变异bont/a hc结构域。
[0328]
变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45或49中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/ahc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45或49中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。在一个实施方案中，变异bont/a hc结构域可以是与seq id no：45或49中任一者或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的核苷酸序列所编码的变异bont/a hc结构域，条件是变异bont/a hc结构域包含如上文所述的修饰。优选地，变异bont/a hc结构域是由seq id no：45或49中任一者或其片段所编码的变异bont/a hc结构域。
[0329]
前述促进结构域的任一者可以与适用于本发明中的前述转运结构域肽的任一者组合。因此，以举例方式，非梭菌促进结构域可以与非梭菌转运结构域肽或与梭菌转运结构域肽组合。备选地，梭菌神经毒素h
cn
转运促进结构域可以与非梭菌转运结构域肽组合。备选地，梭菌神经毒素h
cn
促进结构域可以与梭菌转运结构域肽组合，其实例包括：
[0330]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
[0331]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
[0332]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
[0333]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
[0334]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
[0335]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
[0336]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
[0337]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
[0338]
在一些实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以缺少梭菌神经毒素有功能的hc结构域。在一个实施方案中，梭菌神经毒素优选地缺少梭菌神经毒素完整毒素的最后50个c端氨基酸。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素优选地缺少梭菌神经毒素完整毒素的最后100个、优选地最后150个、更优选地最后200个、特别优选地最后250个并且最优选地最后300个c端氨基酸残基。备选地，可以通过诱变取消/降低hc结合活性-以举例方式，出于方便提到bont/a，修饰神经节苷脂结合袋中的一个或两个氨基酸残基突变(w1266突变为l和y1267突变为f)造成hc区域丧失其受体结合功能。可以对非血清型a梭菌肽组分进行类似突变，例如基于携突变(w1262突变为l和y1263突变为f)的肉毒b或肉毒e(w1224突变为l和y1225突变为f)的构建体。其他对活性部位的突变实现相同的hc受体结合活性消除，例如肉毒a型毒素中y1267s和其他梭菌神经毒素中相应的高度保守残基。rummel等人(2004)中(molecularmicrobiol.51：631-634)描述了这种突变和其他突变的详情，所述文献因而通过引用方式并入本文作为参考。
[0339]
天然梭菌神经毒素的hc肽包含大约400-440个氨基酸残基，并且由功能上不同的、各自大约25kda的两个结构域组成，即n端区(常称作h
cn
肽或结构域)和c端区(常称作h
cc
肽或结构域)。这个事实由以下出版物确认，所述每份出版物在本文中通过引用方式完整并入本文作为参考：umland tc(1997)nat.struct.biol.4：788-792；herreros j(2000)biochem.j.347：199-204；halpern j(1993)j.biol.chem.268：15，第11188-11192页；rummel a(2007)pnas 104：359-364；lacey db(1998)nat.struct.biol.5：898-902；knapp(1998)am.cryst.assoc.abstract papers 25：90；swaminathan与eswaramoorthy(2000)nat.struct.biol.7：1751-1759；和rummel a(2004)mol.microbiol.51(3)，631-643。另外，已经充分记录，构成c端160-200个氨基酸残基的c端区(h
cc
)负责梭菌神经毒素结合于其天然细胞受体，即神经肌肉接头处的神经末梢——这个事实也由以上出版物确认。因此，遍及本说明书提及了一种梭菌重链，其缺少有功能的重链hc肽(或结构域)，从而该重链不能够与天然梭菌神经毒素结合的细胞表面受体发生结合，这意指梭菌重链仅缺少有功能的h
cc
肽。也就是说，可以部分或完全缺失或另行修饰(例如通过常规的化学处理或蛋白酶解处理)h
cc
肽区，以减少其对神经肌肉接头处神经末梢的天然结合能力。
[0340]
因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素hn肽缺少梭菌神经毒素的c端肽部分(h
cc
)的一部分；并且因此缺少天然梭菌神经毒素的hc结合功能。以举例方式，在一个实施方案中，c端延长的梭菌hn肽缺少梭菌神经毒素重链的c端40个氨基酸残基、或c端60个氨基酸残基、或c端80个氨基酸残基、或c端100个氨基酸残基、或c端120个氨基酸残基、或c端140个氨基酸残基、或c端150个氨基酸残基、或c端160个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭菌hn肽缺少梭菌神经毒素的整个c端肽部分(h
cc
)；并且因此缺少天然梭菌神经毒素的hc结合功能。以举例方式，在一个实施方案中，梭菌hn肽缺少梭菌神经毒素重链的c端165个氨基酸残基、或c端170个氨基酸残基、或c端175个氨基酸残基、或c端180个氨基酸残
基、或c端185个氨基酸残基、或c端190个氨基酸残基、或c端195个氨基酸残基。以进一步举例的方式，本发明的梭菌hn肽缺少选自以下的梭菌h
cc
参考序列：
[0341]
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(y1111-l1296)
[0342]
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(y1098-e1291)
[0343]
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(y1l 12-e1291)
[0344]
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(y1099-e1276)
[0345]
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(y1086-k1252)
[0346]
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(y1106-e1274)
[0347]
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(y1106-e1297)
[0348]
破伤风神经毒素-氨基酸残基(y1128-d1315)。
[0349]
以上鉴定的参考序列应当视为向导，因为轻微变型可以根据亚血清型发生。
[0350]
在一个优选的实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素l链或其片段和梭菌神经毒素h链的片段(或由其组成)。例如，梭菌神经毒素可以包含梭菌神经毒素l链或其片段和梭菌神经毒素转运结构域(hn)(或由其组成)。优选地，梭菌神经毒素进一步不包含梭菌神经毒素受体结合结构域(hc)或不包含至少梭菌神经毒素受体结合结构域的c端部分(h
cc
)。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素缺少梭菌神经毒素受体结合结构域的c端部分(h
cc
)。有利地，这类梭菌神经毒素缺少内源梭菌神经毒素受体结合能力并且因此在施用所述梭菌神经毒素的受试者中显示较少的脱靶效应。
[0351]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素基本上由梭菌神经毒素l链或其片段和/或梭菌神经毒素h链的片段组成。如本上下文中所用的术语“基本上由
……
组成”意指例如施用至受试者时，梭菌神经毒素不进一步包含赋予梭菌神经毒素额外功能的一个或多个氨基酸残基。也就是说，“基本上由梭菌神经毒素l链或其片段和/或梭菌神经毒素h链的片段组成”的梭菌神经毒素可以(对那些梭菌神经毒素l链或其片段和/或梭菌神经毒素h链的片段)进一步包含一个或多个氨基酸残基，但是例如当施用至受试者时，所述一个或多个进一步的氨基酸残基不赋予梭菌神经毒素额外的功能。额外的功能可以包括酶活性、结合活性和/或任何生理活性，无论其是什么。
[0352]
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以除了包含任何梭菌神经毒素序列之外，还包含非梭菌神经毒素序列。非梭菌神经毒素序列优选地不破坏本发明梭菌神经毒素促进神经免疫应答的能力。优选地，非梭菌神经毒素序列不是具有催化活性(例如酶活性)的一个序列。优选地，非梭菌序列不是一个与细胞受体结合的序列。换言之，非梭菌序列最优选不是细胞受体的配体。细胞受体可以是蛋白质性细胞受体，如整合型膜蛋白。细胞受体的实例可见于https：//www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports可获得的2019.4版iuphar药理学数据库指南。非梭菌神经毒素序列可以包括辅助纯化的标签，如his标签。优选包含于所述梭菌神经毒素中的任何梭菌神经毒素序列由梭菌神经毒素l链或其片段和/或梭菌神经毒素h链的片段组成。在一个实施方案中，包含于所述梭菌神经毒素中的梭菌神经毒素序列可以由梭菌神经毒素l链组成。在一个实施方案中，包含于所述梭菌神经毒素中的梭菌神经毒素序列可以由梭菌神经毒素转运结构域组成。在一个实施方案中，包含于所述梭菌神经毒素中的梭菌神经毒素序列可以由梭菌神经毒素受体结合结构域组成。在一个实施方案中，包含于所述梭菌神经毒素中的梭菌神经毒素序列可以由梭菌神经
毒素l链和梭菌神经毒素转运结构域组成。
[0353]
本文中描述了包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的合适梭菌神经毒素。
[0354]
包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：4、20、28或36中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素包含与seq id no：4、20、28或36中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素包含多肽序列(更优选地由其组成)，所述多肽序列包含seq id no：4、20、28或36中任一者或其片段。
[0355]
包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素可以是与seq id no：3、19、27或35中任一者或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素。在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素是与seq id no：3、19、27或35中任一者或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列所编码的梭菌神经毒素。优选地，包含梭菌神经毒素l链和转运结构域(或由梭菌神经毒素l链和转运结构域组成)的梭菌神经毒素是由包含seq idno：3、19、27或35中任一者或其片段的核苷酸序列编码的梭菌神经毒素。
[0356]
本发明的梭菌神经毒素可以不含天然存在的梭菌神经毒素复合体中存在的复合性蛋白质。
[0357]
可以使用重组核酸技术产生本发明的梭菌神经毒素。因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素(如上文所述)是重组梭菌神经毒素。
[0358]
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素l链。优选l链无催化活性。
[0359]
活性梭菌神经毒素l链具有非细胞毒性蛋白酶活性。具体而言，活性梭菌神经毒素l链具有内肽酶活性并且能够切割靶细胞中的胞外融合器(exocytic fusion apparatus)蛋白。胞外融合器蛋白优选地是snare蛋白，如snap-25、小突触小泡蛋白/vamp或突触融合蛋白。
[0360]
如本文关于梭菌神经毒素l链而言所用的术语“无催化活性”意指所述l链基本上显示出没有非细胞毒性蛋白酶活性，优选地，如本文就梭菌神经毒素l链而言所用的术语“无催化活性”意指所述l链显示没有非细胞毒性蛋白酶活性。在一个实施方案中，无催化活性的梭菌神经毒素l链是不切割靶细胞中胞外融合器蛋白质的梭菌神经毒素l链。术语“基本上没有非细胞毒性蛋白酶活性”意指梭菌神经毒素l链具备有催化活性梭菌神经毒素l链的小于5％的非细胞毒性蛋白酶活性，例如有催化活性梭菌神经毒素l链的小于2％、1％或优选地小于0.1％的非细胞毒性蛋白酶活性。可以在体外测定非细胞毒性蛋白酶活性，其通过温育供试梭菌神经毒素l链与snare蛋白并且在相同条件下，与由有催化活性梭菌神经毒素l链切割的snare蛋白的量相比时，比较由供试梭菌神经毒素l链切割的snare蛋白的量。常规技术如sds-page和蛋白质印迹法可以用来定量已切割的snare蛋白的量。wo 2019/145577a1中描述了合适的体外测定法，所述文献通过引用方式并入本文作为参考。
[0361]
基于细胞的测定法及体内测定法也可以用来确定包含l链和有功能的细胞结合与转运结构域的梭菌神经毒素是否具有非细胞毒性蛋白酶活性。测定法如肢体外展评分(digit abduction score，das)、背根神经节(drg)测定法、脊髓神经元(scn)测定法和小鼠膈神经偏侧膈(phrenic nerve hemidiaphragm，pnhd)测定法在本领域是常规的。测定非细胞毒性蛋白酶活性的适合测定法可以是donald等人(2018)，pharmacol res perspect，e00446，1-14中所述的测定法，所述文献通过引用方式并入本文作为参考。
[0362]
无催化活性的l链可以具有使所述催化活性失活的一个或多个突变。例如，无催化活性的bont/a l链可以包含活性部位残基的突变，所述活性部位残基如his223、glu224、his227、glu262和/或tyr366。位置编号对应于seq id no：62的氨基酸位置；并且可以通过将多肽与seq id no：62比对来确定。由于seq id no：62的位置1处甲硫氨酸残基的存在为任选的，故在确定氨基酸残基编号时，本领域普通技术人员将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在seq id no：62包括甲硫氨酸情况下，位置编号将如上文定义(例如his223将是seq id no：62的his223)。备选地，在甲硫氨酸从seq id no：62中缺少情况下，氨基酸残基编号应当按-1修改(例如his223将是seq id no：62的his222)。当本文所述其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，相似的注意事项适用，并且本领域普通技术人员将使用本领域常规的技术轻易地确定正确的氨基酸残基编号。
[0363]
在一个特别优选的实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以包含修饰的bont/a或其片段(优选地bont/a hc结构域或其片段)。修饰的bont/a或其片段可以是在一个或多个选自以下的氨基酸残基处包含修饰的bont/a或其片段：asn 886、asn 905、gln 915、asn 918、glu 920、asn 930、asn 954、ser 955、gln 991、glu 992、gln 995、asn 1006、asn 1025、asn 1026、asn 1032、asn 1043、asn 1046、asn 1052、asp 1058、his 1064、asn 1080、glu 1081、glu 1083、asp 1086、asn 1188、asp 1213、gly 1215、asn 1216、gln 1229、asn 1242、asn 1243、ser 1274和thr 1277。这种修饰的bont/a或其片段可以表现出与已知bont/a的用途相比，副作用减少或不存在。本发明的修饰的bont/a的组织滞留的增加特性还可以提供增加的功效和/或作用持续时间并且与已知的梭菌毒素治疗药相比，可以允许待用的剂量降低(或无任何额外不良作用下的剂量增加)，因此提供了进一步的优点。
[0364]
修饰可以是与seq id no：62所示的未修饰的bont/a相比时的修饰，其中通过与seq id no：62比对确定氨基酸残基编号。由于seq id no：62(以及与本文所述的修饰的bont/a多肽或其片段对应的seq id no)的位置1处甲硫氨酸残基的存在为任选的，故在确定氨基酸残基编号时，本领域普通技术人员将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在seq id no：62包括甲硫氨酸情况下，位置编号将如上文定义(例如asn 886将是seq id no：62的asn 886)。备选地，在甲硫氨酸从seq id no：62中缺少情况下，氨基酸残基编号应当按-1修改(例如asn 886将是seq id no：62的asn885)。当本文所述其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，相似的注意事项适用，并且本领域普通技术人员将使用本领域常规的技术轻易地确定正确的氨基酸残基编号。
[0365]
对上述修饰指示的氨基酸残基为表面暴露的氨基酸残基。
[0366]
修饰的bont/a或其片段可以在一个或多个选自以下的氨基酸残基处包含修饰：asn 886、asn 930、asn 954、ser 955、gln 991、asn 1025、asn 1026、asn1052、asn 1 188、asp 1213、gly 1215、asn 1216、gln 1229、asn 1242、asn1243、ser 1274和thr 1277。
[0367]
在修饰的bont/a或其片段的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”优选地意指至少2、3、4、5、6或7个所示的氨基酸残基。因此，修饰的bont/a可以在指示的氨基酸残基处包含至少2、3、4、5、6或7个(优选地7个)修饰。修饰的bont/a或其片段可以包含1-30、3-20、或5-10个氨基酸修饰。更优选地，在修饰的bont/a或其片段的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”意指全部所示的氨基酸残基。
[0368]
优选地，与seq id no：62相比时，除了指示的氨基酸残基处一个或多个氨基酸修饰之外，修饰的bont/a或其片段不含有任何其他氨基酸修饰。
[0369]
该修饰可以选自：
[0370]
i.用碱性氨基酸残基置换表面暴露的酸性氨基酸残基；
[0371]
ii.用不带电荷的氨基酸残基置换表面暴露的酸性氨基酸残基；
[0372]
iii.用碱性氨基酸残基置换表面暴露的不带电荷氨基酸残基；
[0373]
iv.插入碱性氨基酸残基；和
[0374]
v.缺失表面暴露的酸性氨基酸残基。
[0375]
如上文所示的修饰产生与相应未修饰的bont/a或其片段相比时具有增加的表面正电荷和升高的等电点的修饰的bont/a或其片段。
[0376]
等电点(pi)是给定蛋白质的特定属性。如本领域熟知，蛋白质由特定序列的氨基酸(在蛋白质中时也称作氨基酸残基)组成。二十种氨基酸的标准集合的每种氨基酸具有不同的侧链(或r基团)，这意指蛋白质中的每个氨基酸残基展示不同的化学属性如电荷和疏水性。这些属性可能受周围化学环境如温度和ph影响。蛋白质的总体化学特征将取决于这多个因素的总和。
[0377]
某些氨基酸残基(下文详细描述)拥有可电离侧链，所述侧链可以展示取决于周围ph的电荷。在给定ph时这种侧链是否带电荷取决于相关可电离部分的pka，其中pka是来自共轭碱的指定质子的酸解离常数(ka)的负对数。
[0378]
例如，酸性残基如天冬氨酸和谷氨酸具有侧链羧酸基，pka值大约4.1(精确pka值可以取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在ph 7.4(经常称作“生理ph”)展示负电荷。在低ph值，这些侧链将质子化并丢失其电荷。
[0379]
反过来，碱性残基如赖氨酸和精氨酸具有含氮侧链基团，pka值大约10-12。这些侧链因此在ph 7.4展示正电荷。这些侧链将在高ph值去质子化并丢失其电荷。
[0380]
蛋白质分子的总(净)电荷因此取决于蛋白质中存在的酸性残基和碱性残基的数目(及它们的表面暴露程度)及周围ph。改变周围ph改变蛋白质上的总体电荷。因此，对于每种蛋白质，存在一个给定ph，在所述给定ph，正电荷数目和负电荷数目相等且蛋白质展示无总体净电荷。这个点称作等电点(pi)。等电点是蛋白质生物化学中本领域普通技术人员熟悉的标准概念。
[0381]
等电点(pi)是因此定义为蛋白质展示零净电荷的ph值。pi升高意味着蛋白质展示零净电荷要求更高的ph值。因此，pi升高代表蛋白质的净正电荷在给定的ph增加。反过来，pi降低意味着蛋白质展示零净电荷要求更低的ph值。因此，pi降低代表蛋白质的净正电荷在给定的ph处减少。
[0382]
测定蛋白质的pi的方法为本领域已知且是技术人员熟悉的。以举例方式，可以从存在于蛋白质中的每种氨基酸的平均pka值算出蛋白质的pi(“计算的pi”)。这种计算可以
使用本领域已知的计算机程序进行，如来自expasy的compute pi/mw工具(https：//web.expasy.org/compute_pi/)，其是用于计算本发明pi的优选方法。应当使用相同计算技术/程序进行不同分子之间pi值的比较。
[0383]
根据需要，可以使用等电聚焦技术实验地确认计算的蛋白质pi(“观测的pi”)。这项技术使用电泳来根据蛋白质的p1分离蛋白质。等电聚焦一般是使用具有固定ph梯度的凝胶进行。当施加电场时，蛋白质穿过ph梯度迁移直至蛋白质达到它具有零净电荷的ph，这个点是该蛋白质的pi。等电聚焦提供的结果一般在性质上为分辨率相对低，并且因此本发明人认为由计算的pi提供的结果(如上文所述)更适合使用。
[0384]
除非另外规定，否则遍及说明书，“pi”意指“计算的pi”。
[0385]
可以通过改变蛋白质的表面展示的碱性基团和/或酸性基团的数目升高或降低蛋白质的pi。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸实现。例如，可以通过减少酸性残基数目或通过增加碱性残基数目引起pi升高。
[0386]
本发明的修饰的bont/a或其片段可以具有高于未修饰的bont/a(例如seq id no：62)或其片段至少0.2、0.4、0.5或1个pi单位的pi值。优选地，修饰的bont/a或其片段可以具有至少6.6、例如至少6.8的pi。
[0387]
下表中示出20种标准氨基酸的特性：
[0388]
氨基酸
ꢀꢀ
侧链天冬氨酸aspd带电荷(酸性)谷氨酸glue带电荷(酸性)精氨酸argr带电荷(碱性)赖氨酸lysk带电荷(碱性)组氨酸hish不带电荷(极性)天冬酰胺asnn不带电荷(极性)谷氨酰胺glnq不带电荷(极性)丝氨酸sers不带电荷(极性)苏氨酸thrt不带电荷(极性)酪氨酸tyry不带电荷(极性)甲硫氨酸metm不带电荷(极性)色氨酸trpw不带电荷(极性)半胱氨酸cysc不带电荷(极性)丙氨酸alaa不带电荷(疏水性)甘氨酸glyg不带电荷(疏水性)缬氨酸valv不带电荷(疏水性)亮氨酸leul不带电荷(疏水性)异亮氨酸ilei不带电荷(疏水性)脯氨酸prop不带电荷(疏水性)苯丙氨酸phef不带电荷(疏水性)
[0389]
以下氨基酸视为带电荷氨基酸：天冬氨酸(负)、谷氨酸(负)、精氨酸(正)和赖氨酸(正)。
[0390]
在ph 7.4，天冬氨酸(pka 3.1)和谷氨酸(pka 4.1)的侧链具有负电荷，而精氨酸(pka12.5)和赖氨酸(pka 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸称作酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸称作碱性氨基酸残基。
[0391]
以下氨基酸视为不带电荷极性(意味着它们可能参与氢键形成)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
[0392]
以下氨基酸视为不带电荷、疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
[0393]
在氨基酸插入情况下，将额外的氨基酸残基(正常情况下不存在的氨基酸残基)并入bont/a多肽序列或其片段中，因此增加所述序列中的氨基酸残基总数。在氨基酸缺失的情况下，将氨基酸残基从梭菌毒素氨基酸序列移除，因此减少所述序列中的氨基酸残基总数。
[0394]
优选地，修饰是在修饰的bont/a或其片段中有利地维持相同氨基酸残基数目的置换。在氨基酸置换的情况下，将一个形成bont/a多肽序列或其片段的部分的氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基。替换性氨基酸残基可以是如上文所述的20种标准氨基酸之一。备选地，氨基酸置换中的替换性氨基酸可以是非标准氨基酸(不是上述标准20种氨基酸集合之部分的氨基酸)。以举例方式，替换性氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如l-鸟氨酸、l-2-氨基-3-胍基丙酸、或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的d-异构体)。用于向蛋白质引入非标准氨基酸的方法为本领域已知并且包括使用大肠杆菌(e.coli)营养缺陷型表达宿主的重组蛋白合成。
[0395]
在一个实施方案中，置换选自用碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基、用不带电荷氨基酸残基置换酸性氨基酸残基和用碱性氨基酸残基置换不带电荷氨基酸残基。在一个实施方案中，在置换是用不带电荷氨基酸残基置换酸性氨基酸残基的情况下，酸性氨基酸残基由其相应的不带电荷酰胺氨基酸残基替换(即天冬氨酸由天冬酰胺替换，并且谷氨酸由谷氨酰胺替换)。
[0396]
优选地，碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。也就是说，置换是用赖氨酸或精氨酸置换。最优选地，修饰是用赖氨酸置换。
[0397]
优选地，用于本发明中的修饰的bont/a或其片段包含位于梭菌毒素h
cn
结构域介于4与40个之间的氨基酸修饰。所述修饰的bont/a或其片段优选地还具有至少6.6的pi。所述修饰的bont/a优选地包含至少4个氨基酸的修饰，所述氨基酸选自：asn 886、asn 930、asn 954、ser 955、gln 991、asn 1025、asn 1026和asn1052，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基置换氨基酸。例如，所述修饰的bont/a或其片段可以包含至少5个氨基酸的修饰，所述氨基酸选自：asn 886、asn930、asn 954、ser 955、gln 991、asn 1025、asn 1026、asn 1052和gln 1229，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基置换氨基酸。
[0398]
通过置换、插入或缺失氨基酸残基修饰蛋白质的方法为本领域已知。以举例方式，可以通过修饰编码多肽(例如编码未修饰的bont/a或其片段)的dna序列引入氨基酸修饰。这可以使用标准分子克隆技术实现，例如通过使用聚合酶进行其中使用编码目的氨基酸的短链dna(寡核苷酸)替换原始编码序列的定点诱变，通过用各种酶(例如，连接酶和限制性核酸内切酶)插入/缺失基因诸部分。备选地，可以化学合成修饰的基因序列。
[0399]
在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含与seq id no：42具有至
少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含seq id no：42所示的多肽序列。
[0400]
在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列由与seq id no：41具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码。优选地，根据本发明使用的梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列由seq id no：41所示的核苷酸序列编码。
[0401]
在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素(例如包含seq id no：42或由seq id no：41编码)可以是与seq id no：61或65具有至少70％序列同一性的多肽的一部分。因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素可以包含与seq id no：61或65具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，根据本发明使用的梭菌神经毒素可以包含seq id no：61或65(更优选地由其组成)。在一个实施方案中，梭菌神经毒素包含(例如根据seq id no：65的)无催化活性的l链。
[0402]
在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素(例如包含seq id no：42或由seq id no：41编码)可以由与seq id no：60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的梭菌神经毒素可以由与seq id no：60具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码。优选地，根据本发明使用的梭菌神经毒素可以由包含seq id no：60(更优选地由其组成)的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，梭菌神经毒素包含无催化活性的l链。
[0403]
seq id no：42是修饰的bont/a片段的实例并且seq id no：61和65分别是有催化活性和无催化活性的修饰的bont/a多肽的实例。这类修饰的bont/a多肽和片段特别地优选用于本发明中。与野生型bont/a相比时，seq id no：42、61和62所示的多肽具有众多增加多肽等电点的氨基酸修饰(例如置换)。不希望受理论约束，认为升高的净正电荷促进多肽与阴离子性胞外组分之间的静电相互作用，因而促进多肽与细胞表面之间的结合，因此增加在施用部位处的滞留和/或作用持续时间。因此，构思了与缺少所述修饰的等同多肽相比，seq id no：42、61和65的神经免疫应答促进特性将改进。
[0404]
对于上述有催化活性的修饰的bont/a多肽(例如seq id no：61)，其中可以定义这些有利特性(其代表治疗指数升高)的一个方式可以是就修饰的bont/a的安全比率(safety ratio)而言。在这个方面，可以在相关动物模型中通过测量体重丢失百分数实验地评估梭菌神经毒素的不利影响(由毒素弥漫离开施用部位造成)(例如小鼠，其中在施用七天以内检测体重丢失)。反过来，可以依据肢体外展评分(das)测定法(肌肉麻痹测量)实验地评估梭菌神经毒素的目的中靶效应。可以通过以下方式进行das测定法：将20μl配制在明胶磷酸盐缓冲液中的梭菌神经毒素注射入小鼠腓肠肌/比目鱼肌肌群中，随后使用aoki法评定肢体外展评分(aoki kr，toxicon 39：1815-1820；2001)。在das测定法中，通过尾部使小鼠短暂悬空，以激发其中小鼠伸展开其后肢并且外展其后脚趾的特征性惊跳反应。在注射梭菌神经毒素后，按五分量表(0＝肢端外展和腿伸展正常至4＝肢端外展和腿伸展最大减少)评定不同程度的肢端外展。
[0405]
梭菌神经毒素的安全比率随后可以表述为体重降低10％(小鼠中施用后的头七天以内峰效应时测量)所需的毒素量与das评分为2所需的毒素量之间的比率。高度安全比率评分因此为希望的，并且指示能够在少许不利脱靶效应下有效麻痹靶肌肉的毒素。本发明
有催化活性的修饰的bont/a可以具有比等同的未修饰(天然)的肉毒毒素(例如seq id no：62)的安全比率更高的安全比率。
[0406]
因此，在一个实施方案中，本发明的有催化活性的修饰的bont/a具有至少8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比率，其中安全比率计算为：体重变化-10％所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以das ed
50
(pg/小鼠)[ed
50
＝产生das评分2所需的剂量]。
[0407]
在一个实施方案中，本发明有催化活性的修饰的bont/a具有至少10的安全比率。在一个实施方案中，本发明的修饰的bont/a或其片段具有至少15的安全比率。
[0408]
wo 2015/004461 a1中描述了包含与seq id no：61至少70％序列同一性的梭菌神经毒素，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。
[0409]
在一个实施方案中，包含与seq id no：42、61或65具有至少70％序列同一性和/或包含由与seq id no：41或60具有70％序列同一性的核苷酸序列所编码的多肽序列的梭菌神经毒素在以下一个或多个(优选地两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个或更多个，更优选地在全部)位置处包含置换：930、955、991、1026、1052、1229和886。位置编号对应于seq id no：62的位置；并且可以通过将多肽序列与seq id no：62(未修饰的/野生型bont/a)比对来确定。由于seq id no：62的位置1处甲硫氨酸残基的存在为任选的，故在确定氨基酸残基编号时，本领域普通技术人员将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在seq id no：62包括甲硫氨酸情况下，位置编号将如上文定义(例如位置886将是seq id no：62的asn 886)。备选地，在甲硫氨酸在seq id no：62中不存在的情况下，氨基酸残基编号应当按-1修改(例如位置886将是seq id no：62的asn 885)。当本文所述其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，相似的注意事项适用，并且本领域普通技术人员将使用本领域常规的技术轻易地确定正确的氨基酸残基编号。
[0410]
优选地，包含与seq id no：42、61或65具有至少70％序列同一性和/或包含由与seq id no：41或60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列所编码的多肽序列的梭菌神经毒素在以下一个或多个位置处包含赖氨酸或精氨酸(更优选地赖氨酸)：930、955、991、1026、1052、1229和886。在一个实施方案中，梭菌神经毒素在以下至少两个、三个、四个、五个、六个或全部位置处包含赖氨酸或精氨酸(更优选地赖氨酸)：930、955、991、1026、1052、1229和886。最优选地，梭菌神经毒素在以下全部位置处包含赖氨酸或精氨酸(更优选地赖氨酸)：930、955、991、1026、1052、1229和886。
[0411]
与本发明各种治疗性用途有关的实施方案意在同等适用于本发明的治疗方法、多肽，并且反之亦然。
[0412]
序列同源性
[0413]
多种序列比对方法的任一种方法可以用来确定同一性百分数，包括而不限于全局法、局部法和杂交法，如，例如区段逼近法。确定同一性百分数的方案是本领域技术人员范围内的常规方法。全局法从分子的开端至结尾对齐序列并且通过加总独立残基对的评分并且通过赋予空位罚分确定最佳比对。非限制性方法例如包括clustal w，参见例如julie d.thompson等人，clustal w：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice(clustal w：通过序列权重、位置专用空位罚分和权重矩阵选
择改进递进多重序列比对的灵敏度)，22(22)nucleic acids research 4673-4680(1994)；和迭代细化法，参见例如osamu gotoh，significant improvement in accuracy of multiple protein.sequence alignments by iterative refinement as assessed by reference too structural alignments(通过如依据参考结构比对所评估的迭代细化显著改进多个蛋白质序列比对的准确度)，264(4)j.moi.biol.823-838(1996)。局部法通过鉴定全部输入序列共有的一个或多个保守基序对齐序列。非限制方法例如包括匹配盒法，参见例如ericc depiereux和ernest feytmans，match-box：a fundamentally new algorithm for thee simultaneous alignment of several protein sequences(匹配盒法：同时比对几个蛋白质序列的全新算法)，8(5)cabios 501-509(1992)；gibbs采样法，参见例如c.e.lawrence等人，detecting subtle sequence signals：a gibbs sampling strategyfor multiple alignment(检测微弱序列信号：多重比对的gibbs采样策略)，262(5131)science 208-214(1993)；align-m法，参见例如ivo van waiie等人，a new algorithmfor multiple alignment of highly divergent sequences(align-m法-多重比对高度趋异序列的新算法)，20(9)bioinformatics：1428-1435(2004)。
[0414]
因此，通过常规方法确定序列同一性百分数。参见例如altschul等人，bull.math.bio.48：603-16，1986以及henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa 89：10915-19，1992。简而言之，对齐两个氨基酸序列以使用如下文显示的henikoff和henikoff(出处同上)的空位开口罚分10、空位延伸罚分1和“blosum 62”评分矩阵(由标准单字母代码指示氨基酸)，优化比对评分。
[0415]
两个或更多个核酸序列或氨基酸序列之间的“序列同一性百分数”随序列共有的相同位置的数目变化而变化。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。计算序列同一性％还可以考虑空位数和需要引入以优化两个或更多个序列比对的每个空位的长度。可以使用技术人员将熟悉的专用数学算法如blast，实施序列比较和确定两个或更多个序列之间的同一性百分数。
[0416]
用于确定序列同一性的比对评分
[0417][0418]
同一性百分数随后计算为：
[0419][0420]
基本上同源的多肽表征作为具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些变化优选地为细微性质，即，保守性氨基酸置换(参见下文)和未显著影响多肽折叠或活性的其他置换；小缺失(一般一个至约30个氨基酸)；和氨基端或羧基端的小延长，如氨基端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
[0421]
保守性氨基酸置换
[0422]
碱性：精氨酸、赖氨酸、组氨酸
[0423]
酸性：谷氨酸、天冬氨酸
[0424]
极性：谷氨酰胺、天冬酰胺
[0425]
疏水性：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸
[0426]
芳族：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸
[0427]
小体积：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸
[0428]
除20个标准氨基酸之外，可以用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-n-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)置换本发明多肽的氨基酸残基。有限数目的非保守氨基酸、遗传密码不编码的氨基酸和非天然氨基酸可以置换多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
[0429]
非天然存在的氨基酸包括但不限于反-3-甲基脯氨酸、2.4-亚甲基-脯氨酸、顺-4-羟脯氨酸、反-4-羟脯氨酸、n-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟-乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种向蛋白质并入非天然存在氨基酸残基的方法。例如，可以使用其中用化学氨酰化的阻抑trna抑制无义突变的体外系统。本领域已知合成氨基酸和使trna氨酰化的方法。在包含大肠杆菌s30提取物和市售酶及其他试剂的无细胞体系中转录并翻译含有无义突变的质粒。通过色谱法纯化蛋白质。参见例如robertson等人，j.am.chem.soc.113：2722，1991；ellman等人，methods enzymol.202：301，1991；chung等人，science259：806-9，1993；和chung等人，proc.natl.acad.sci.usa 90：10145-9，1993)。在第二方法中，通过在非洲爪蟾卵母细胞中微量注射突变的mrna和化学氨酰化的阻抑trna实施翻译(turcatti等人，j.biol.chem.271：19991-8，1996)。在第三方法范围内，在待置换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在下和在所需非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入多肽中替代其天然副本。参见，koide等人，biochem.33：7470-6，1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化成非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合，以进一步拓展置换范围(wynn和richards，protein sci.2：395-403，1993)。
[0430]
有限数目的非保守氨基酸、遗传密码不编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以置换本发明多肽的氨基酸残基。
[0431]
可以根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells，science 244：1081-5，1989)，鉴定本发明多肽中的必需氨基酸。也可以通过结构的物理分析确定生物学相互作用部位，如通过这类技术如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记法，结合对推定性接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de vos等人，science 255：306-12，1992；smith等人，j.mol.biol.224：899-904，1992；wlodaver等人，febs lett.309：59-64，1992。也可以从分析与本发明多肽的相关组分的同一性推断出必需氨基酸的身份(例如转运组分或蛋白酶组分)。
[0432]
可以使用已知的诱变和筛选方法，如reidhaar-olson与sauer(science 241：53-7，1988)或bowie与sauer(proc.natl.acad.sci.usa 86：2152-6，1989)公开的那些方法，制备并测试多个氨基酸置换。简而言之，这些作者公开了以下方法：使多肽中的两个或更多个位置同时随机化，选择有功能的多肽并且随后对诱变的多肽测序以确定每个位置处容许性置换的光谱。可以使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，lowman等人，biochem.30：10832-7，1991；ladner等人，美国专利号5,223,409；huse，wipo公开wo 92/06204)和区域定向诱变法(derbyshire等人，gene 46：145，1986；ner等人，dna 7：127，1988)。
[0433]
可以使用已知的诱变和筛选方法，如reidhaar-olson与sauer(science 241：53-7，1988)或bowie与sauer(proc.natl.acad.sci.usa 86：2152-6，1989)公开的那些方法，制
备并测试多个氨基酸置换。简而言之，这些作者公开了以下方法：使多肽中的两个或更多个位置同时随机化，选择有功能的多肽并且随后对诱变的多肽测序以确定每个位置处容许性置换的光谱。可以使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，lowman等人，biochem.30：10832-7，1991；ladner等人，美国专利号5,223,409；huse，wipo公开wo92/06204)和区域定向诱变法(derbyshire等人，gene 46：145，1986；ner等人，dna 7：127，1988)。
[0434]
除非另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology(微生物学和分子生物学字典)，第20版，john wiley and sons，new york(1994)和hale与marham，the harper collins dictionary of biology(哈珀柯林斯生物学词典)，harper perennial，ny(1991)为普通技术人员提供本公开中所用诸多术语的通用词典。
[0435]
本公开不受本文公开的实例性方法和材料限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可以用于实施或检验本公开的实施方案。数值范围包括定义该范围的数值。除非另外说明，否则任何核酸序列从左至右以5
′
至3
′
方向书写；氨基酸序列从左至右由以氨基至羧基方向书写。
[0436]
本公开中提供的标题不限制所公开的多个方面或实施方案。
[0437]
本文使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写提及氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”同义于术语“多肽”和/或术语“蛋白质”。在一些情况下，术语“氨基酸序列”同义于术语“肽”。在一些情况下，术语“氨基酸序列”同义于术语“酶”。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。氨基酸的3字母代码如遵循iupaciub生物化学命名联合委员会(jcbn)那样定义。也可以理解多肽可以由多于一个核苷酸序列编码，原因在于遗传密码子的简并性。
[0438]
其他术语定义可以在本说明书通篇范围内显而易见。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解本公开不限于所述的具体实施方案，因为这类实施方案当然可以变动。还应当理解，本文所用的术语的目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附的权利要求书限定。
[0439]
在提供一个值范围的情况下，应当理解除非上下文明确说明，否则还具体地披露了这个范围的上限与下限之间的每个中间值至该下限的十分之一单位。本公开范围内涵盖在所述范围内任一所述值或居间值与这个所述范围内任一其他所述值或居间值之间的每个较小范围。这些更小范围的上限和下限可以独立地纳入该范围内或排除在外，并且在两个界限之任一者、二者均不纳入或二者均纳入这些更小范围内时，每个范围也纳入本公开范围内，受所述范围中的任何具体排除的界限约束。在所述的范围包含所述限值中一者或两者情况下，排除这些已纳入限值中任一者或两者的范围也纳入公开。
[0440]
必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括复数称谓。因此，例如，对“一种梭菌神经毒素”的提及包括多种此类物质，并且对“该梭菌神经毒素”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种梭菌神经毒素及其等同物的提及等。
[0441]
本文讨论的出版物仅因其披露先于本技术的提交日而提供。本文中这些出版物均
不得解释为承认这类出版物相对于所附权利要求构成现有技术。
[0442]
附图简述
[0443]
现在将参考以下附图与实施例，仅以举例方式描述本发明的实施方案。
[0444]
图1.本研究中成像区域的位置示意图。
[0445]
图2.显示区域1中激光损伤诱导的小胶质细胞密度变化的图。在dysport处理的小鼠中，更多小胶质细胞向损伤部位移行(小胶质细胞密度升高)。
[0446]
图3.显示区域1中激光诱导的活性变化的图，用小胶质细胞平均球度指数表示。活化的小胶质细胞具有较低球度指数(细胞胞体形状更细长)。
[0447]
图4.显示在激光诱导的小胶质细胞突起延伸后的荧光变化(移除离群值；区域1中疤痕形成)的图：在dysport处理的小鼠中42分钟处的小胶质细胞应答显著更强。
[0448]
序列表
[0449]
在以下任一seq id no中指示初始met氨基酸残基或相应的起始密码子，所述残基/密码子为任选的。
[0450]
seq id no：1-重组无催化活性bont/a的核苷酸序列(rbont/a(0))
[0451]
seq id no：2-rbont/a(0)的多肽序列
[0452]
seq id no：3-rlhn/a的核苷酸序列(仅轻链加转运结构域)。
[0453]
seq id no：4-rlhn/a的多肽序列
[0454]
seq id no：5-rl/a的核苷酸序列(仅轻链)
[0455]
seq id no：6-rl/a的多肽序列
[0456]
seq id no：7-rhc/a的核苷酸序列
[0457]
seq id no：8-rhc/a的多肽序列
[0458]
seq id no：9-rbont/b(0)的核苷酸序列
[0459]
seq id no：10-rbont/b(0)的多肽序列
[0460]
seq id no：11-rbont/c(0)的核苷酸序列
[0461]
seq id no：12-rbont/c(0)的多肽序列
[0462]
seq id no：13-rbont/e(0)的核苷酸序列
[0463]
seq id no：14-rbont/e(0)的多肽序列
[0464]
seq id no：15-rbont/f(0)的核苷酸序列
[0465]
seq id no：16-rbont/f(0)的多肽序列
[0466]
seq id no：17-rbont/a(0)(his标记)的核苷酸序列
[0467]
seq id no：18-rbont/a(0)(his标记)的多肽序列
[0468]
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[0469]
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[0470]
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[0471]
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[0472]
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[0473]
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[0474]
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[0475]
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[0476]
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[0477]
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[0478]
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[0479]
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[0480]
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[0481]
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[0485]
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[0489]
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[0491]
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[0492]
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[0493]
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[0494]
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[0495]
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[0496]
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[0497]
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[0498]
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[0499]
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[0500]
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[0501]
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[0509]
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[0510]
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[0511]
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[0512]
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[0513]
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[0514]
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[0515]
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[0516]
[0517]
[0518][0519]
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[0520][0521]
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[0522]
[0523][0524]
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[0527]
[0528][0529]
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[0530][0531]
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[0532][0533]
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[0536]
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[0539][0540][0541]
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[0542]
[0543][0544]
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[0545][0546]
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[0547]
[0548][0549]
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[0550]
[0551][0552]
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[0553]
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[0561]
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[0572][0573]
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[0576][0577]
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[0578]
[0579]
[0580][0581]
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[0584]
[0585][0586]
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[0593]
[0594][0595]
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[0596][0597]
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[0598]
[0599][0600]
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[0601]
[0602][0603]
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[0604]
[0605][0606]
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[0607][0608]
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[0609][0610][0611]
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[0612][0613]
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[0614][0615]
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[0616][0617]
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[0618]
[0619][0620]
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[0621]
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[0622][0623]
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[0624][0625]
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[0626][0627]
seq id no：46-rhc/a变体y1117v h1253k(his标记)的多肽序列
[0628][0629]
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[0630]
[0631][0632]
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[0633][0634]
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[0635]
[0636][0637]
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[0638][0639]
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[0640][0641]
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[0642]
[0643][0644]
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[0645][0646]
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[0647][0648]
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[0649][0650]
seq id no：56-bont/f的多肽序列-uniprot a7gbg3
[0651][0652]
seq id no：57-bont/g的多肽序列-uniprot q60393
[0653]
[0654][0655]
seq id no：58-tent的多肽序列-uniprot p04958
[0656][0657]
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[0658]
[0659][0660]
seq id no：60-mrbont/a的核苷酸序列
[0661]
[0662][0663]
seq id no：61-mrbont/a的多肽序列
[0664][0665]
seq id no：62-未修饰的bont/a1的多肽序列
[0666]
[0667][0668]
seq id no：63-mrbont/ab的多肽序列
[0669][0670]
seq id no：64-mrbont/ab(0)的多肽序列
[0671]
[0672][0673]
seq id no：65-mrbont/a(0)的多肽序列
[0674]
实施例
[0675]
材料和方法
[0676]
动物
[0677]
六只野生型(wt)小鼠用于前导性研究；24只cx3cr1-gfp小鼠(购自美国jax实验室
的繁育对)用于主研究；12只小鼠用于成像研究。小鼠在开始成像时为3-5月龄。对于成像实验，给小鼠装上颅窗，所述颅窗带有允许成像和注射神经毒素的接入口(access port)(下文见更多详情)。
[0678]
其他处描述了cx3cr1-gfp小鼠，参见nimmerjjahn等人(science.2005年5月27日；308(5726)：1314-8)，所述文献通过引用方式并入本文作为参考。
[0679]
肉毒神经毒素(bont)和对照注射
[0680]
使用溶解于2μl盐水中的bont/a，即dysport(阿波肉毒毒素a(abobont-a))。在对照实验中，仅使用溶媒(2μl盐水)溶液。
[0681]
皮质内施用的dysport耐受良好：3只wt小鼠(前导性研究)施以0.5u/动物dysport(溶解于2μl盐水中)和3只wt小鼠施以溶媒溶液并且观察其临床体征及测量其体重2天。无临床体征或行为变化与神经毒性效应相关，并且处理组之间体重无显著差异，因此批准0.5u/动物的剂量用于主研究。
[0682]
对于主研究，将0.5u dysport(溶解于2μl盐水中)或溶媒(2μl盐水)溶液通过(颅窗的)硅氧烷接入口(在第一成像环节期间)注入小鼠的躯体感觉皮质。溶液按速率2nl/秒注射。
[0683]
实验设置
[0684]
在注射dysport前三十天(第-30天)，小鼠装上带接入口的颅窗(进一步实验之前允许三十天流逝，以提供时间供脑/神经免疫应答活性和行为在安装颅窗后正常化)。在研究期间，动物在几个时间点成像。在第0天(皮质注射dysport或溶媒的天)紧邻激光损伤前及在损伤后6、18、30和42分钟进行成像。另外，在第1天(注射后24小时/激光损伤后23.5小时)和在第2天(注射后48小时/激光损伤后47.5小时)进行成像。在注射日(第0天)，紧邻注射前实施基线成像(成像环节#1)。注射后一天(第1天)实施成像环节#2。注射后两天(第2天)实施成像环节#3。
[0685]
开颅手术和安装玻璃板
[0686]
为了植入带接入口的颅窗(替换一片颅骨以允许成像和通向脑的植入)，将小鼠用氯胺酮/赛拉嗪麻醉。将颅窗按以下坐标插在躯体感觉皮质上方：从冠矢点起ap-1.8，ml-2.0。使用牙科钻(hp4-917，foredom)取出一小片圆形(d＝4mm)颅骨，并且骨中的该孔以一片圆形盖玻片(d＝5mm；#72296-05，electron microscopy sciences)覆盖。在植入盖玻片之前，在该玻璃中钻出一个偏心定位的小孔并用硅氧烷(sylgard 184)填充，旨在于长期颅窗中产生皮质内注射用接入口。将头板置于盖玻片上并用混以氰基丙烯酸酯胶(loctite 401；henkel)的牙科粘固剂(rapid repair；dentsply)固定至颅骨表面。
[0687]
图像获取设置
[0688]
照明：900nm，飞秒激光mai-tai broad band deepsee。
[0689]
发射滤波器：用于增强型绿色荧光蛋白(egfp)荧光的信道2-带通468-552nm。
[0690]
在至少两个成像区域按竖直进阶2μm(栈的总成像深度：120μm)采集60幅图像的栈(stacks)。每个成像区域按xy坐标覆盖500
×
500μm2空间。
[0691]
为了在区域1(参见图1成像区域的位置示意图)诱导激光损伤，在焦平面距皮质表面25-35微米的深度选择微米尺寸目的区域(region of interest，roi)并且将红外激光按100％强度在皮质内注射后第一小时期间施加5秒。为了将光(激光)强度瞄准脑特定区域以
提供不同焦点的激光所诱导损伤，使用双光子显微镜技术。在第一成像环节期间激光损伤诱导不成功的罕见情况下，24小时后重复进行损伤诱导。
[0692]
成像环节(imaging sessions)
[0693]
在研究期间，动物在几个时间点成像。在第0天(皮质注射dysport或溶媒日)紧邻激光损伤前及在损伤后6、18、30和42分钟进行成像。另外，在第1天(注射后24小时/激光损伤后23.5小时)和在第2天(注射后48小时/激光损伤后47.5小时)进行成像。
[0694]
数据处理和分析
[0695]
在获取图像后，将图像栈在fiji/imagej软件中对齐。使用fiji软件中的插件补偿组织在x、y和z方向的移位。使用下文描述的成套插件，将对齐的图像栈用于分析小胶质细胞的密度、形态和激光所诱导突起延伸。
[0696]
为了分析小胶质细胞密度变化和形态变化，使用“morpholibj”：一组创建于inra-ijpb建模和数字成像实验室的imagej用数学形态学方法和插件。厚度40微米的图像栈纳入区域1(从带有激光损伤位置的切片起
±
20微米)内和区域2(最浅表的40微米)内的数据分析中。
[0697]
在morpholibj插件中实施以下顺序的步骤：
[0698]
1)使用greyscale和3d形态过滤程序过滤对齐的图像栈，以增强细胞和周围组织之间的反差；
[0699]
2)自动otsu阈值法(otsu thresholding)应用于全部图像以产生细胞的二元掩模(最小尺寸阈值为20个像素，无最大阈值)；
[0700]
3)“颗粒分析3d”和“强度量值3d”插件应用于图像栈以取得数值结果。
[0701]
计算对象数目(以计算细胞密度)、细胞总体积和平均体积、细胞球度指数和细胞平均荧光强度。对于这项研究所用的3d分析，球度指数可以定义为细胞体积(v)的平方对表面积(s)的三次方的比率：
[0702][0703]
为测量小胶质细胞向激光损伤的突起延伸，损伤部位的中心外画出直径25微米(小圆环＝s.c.)和50微米(大圆环＝b.c.)的两个圆环并且测量从大圆环进入较小圆环的荧光再分布。使用以下等式计算小胶质细胞突起延伸：
[0704][0705]
其中tx＝时间点x，并且t0＝时间点0(基线)
[0706]
数值数据随后转移至microsoft excel、microcal origin和graphpad prism软件供统计分析和绘制图表。为了在处理组之间进行统计比较，使用student t检验(在数据正态分布情况下)或mann-whitney非参数检验(在数据非正态分布情况下)。为了对比基线进行统计比较，使用配对student t检验(在数据正态分布情况下)或wilcoxon符号秩检验(在数据非正态分布情况下)。为了检验分布的正态性，使用shapiro-wilcoxon正态性检验。
[0707]
实施例1-梭菌神经毒素诱导小胶质细胞密度明显增加、胞体球度下降及突起延伸增强
[0708]
发明人建立了一个稳健、设对照的实验系统来研究梭菌神经毒素施用对随神经组
织损伤而来的神经免疫应答活性的影响。该系统允许在脑中诱导精确的神经损伤，这类神经损伤代表由本文所述脑病造成的神经损伤(例如，如由脑肿瘤存在或感染造成的神经组织损伤、或归因于死亡后氧耗尽的神经死亡)。
[0709]
该系统利用转基因小鼠，在这些小鼠中神经免疫应答的关键免疫细胞(小胶质细胞)特异性表达gfp，允许如此对所述免疫细胞经时成像，从而可以在施用或不施用梭菌神经毒素情况下追踪并分析它们响应于神经损伤的活性。该系统的又一个优点(使用高级光学显微镜检查)是它可以与激光偶联以诱导精确的神经元损伤区域。(上文)材料和方法部分中提供该系统的完整细节。
[0710]
在全部动物对两个成像区域成像(参见图1图解)：更靠近注射部位的区域1(从该区域边缘到注射部位的距离范围为600-1000微米)、区域2(距离至少1000微米)。
[0711]
在全部分析的小鼠中，观察到与小胶质细胞形态一致的gfp清晰表达模式。在区域1中在第0天皮质内注射dysport后一小时以内诱导激光损伤(参见图1和图2)。确认带接入口的长期窗作为cx3cr1-gfp小鼠品系中重复注射后成像的可靠模型。为了最佳成像，将浅皮质层用激光损伤并成像。全部12只小鼠中均成功诱导激光损伤。
[0712]
分析了区域1中激光损伤诱导的小胶质细胞密度和形态的变化(分析结果参见图2和图3)。首先，在dysport处理的小鼠中观察到焦点激光损伤后小胶质细胞密度统计显著地增加，而在溶媒处理的小鼠中未观察到(图2；dysport组中始自18分钟，全部时间点的p＜0.05vs基线；溶媒组中全部时间点的p＞0.05vs基线)。在损伤后第一小时期间，各组之间损伤区域内小胶质细胞密度的差异达到统计显著水平(在18分钟和42分钟时处理组之间p＜0.05)。这些观察结果提示损伤后第一小时期间dysport处理的小鼠中小胶质细胞向损伤区域的移行增加。
[0713]
接下来，分析含损伤的区域1内小胶质细胞形态的变化以找到小神经胶质活化迹象。为此，分析三个参数：平均体积、平均表面积和平均球度指数(图3)。对于前两个参数，小胶质细胞转换成活化状态与这些值升高相关(小胶质细胞胞体膨胀并且变得扩大)，而对于球度指数，活化伴随该值降低(更细长形状)。
[0714]
发现对于平均体积和平均表面积二者，均存在激光损伤后值逐步升高——更多活化性小胶质细胞形状的特征。有趣地，观察到处理组之间细胞平均球度的差异(参见图3)。总之，这些数据表明dysport影响损伤后的小胶质细胞密度变化和球度变化，但不影响体积变化和细胞表面积变化。换句话说，dysport可以大大增强小胶质细胞向损伤部位移行，但不增强活化相关的形态变化。
[0715]
接下来，研究了dysport注射对激光所诱导小胶质细胞突起延伸和疤痕形成的影响(参见图4)。在这项分析中，分析紧密邻近(50μm)损伤点。观察到疤痕荧光快速亮化，其在激光损伤诱导后约40分钟达到顶峰(图4)。单轮grubb离群值检验用来移除任何离群值。在诱导损伤后42分钟时观察到统计显著差异(dysport处理vs仅溶媒的对照)(图7，mann-whitney检验时p-值为0.0303)。在这个时间点，在dysport处理的小鼠中疤痕荧光更强，这与dysport增强小胶质细胞突起向损伤部位延伸的概念一致。
[0716]
最后，分析其中未诱导激光损伤的区域2内小胶质细胞的密度和形态(例如区域2提供对照区域)。简而言之，就密度而言未观察到处理组之间的统计显著差异。在这个区域2，成像在4个时间点进行：在第0天皮质内注射之前和之后、在第1天(24小时)和在第2天(48
小时)。区域2内观察到球度指数降低，提示小胶质细胞活化并移行离开例如朝向区域1处的损伤。
[0717]
总之，未观察到dysport注射显著影响就激光损伤而言保持完好的区域2中的小胶质细胞。这表明dysport的影响响应于损伤部位出现。
[0718]
结果汇总
[0719]
小胶质细胞是调节神经保护及神经元细胞死亡的主要参与者。这里，发明人研究了梭菌神经毒素施用对损伤诱导的小胶质细胞活化的影响。
[0720]
将成年雌性cx3cr1-gfp杂合c57bl/6jcrl小鼠(n＝24)麻醉，之后用适于重复体内双光子成像的长期颅玻璃窗(配备注射接入口)植入。在7天后，麻醉15只经选择供成像研究的动物，之后在躯体感觉皮质中注射abobont-a (0.5u溶解于2μl中)或其溶媒(盐水)，然后约1小时内在毗邻区域接受μm尺度红外激光照射损伤以诱导小胶质细胞活化。成像环节在基线时、abobont-a注射后(在照射之前)和激光损伤后按10分钟间隔在损伤后头40分钟期间进行并且在损伤后24小时及48小时期间再次进行。
[0721]
小鼠中皮质内注射abobont-a 0.5u是安全的并且不影响行为或体重增长，同时在激光损伤之前对小胶质细胞基本上无可观测影响。在激光损伤后，与溶媒注射组相比，abobont-a诱导小胶质细胞密度在损伤后10-40分钟增加15％与50％之间(p＜0.05)、胞体球度下降和突起延伸增强。发明人未观察到溶媒组与abobont-a组之间相同脑中保持完好即未受激光损伤影响的
‘
对照’区(躯体感觉皮质)内小胶质细胞密度的显著差异。
[0722]
总之，尽管在激光损伤不存在下，abobont-a未可观察地改变小胶质细胞形态和密度，但abobont-a显著增强(促进)激光损伤诱导的小胶质细胞移行和突起延伸。因此，abobont-a可以用来介导小神经胶质活化的上调。
[0723]
以上说明书中提到的全部出版物均在本文中通过引用的方式并入。本发明的所述方法和系统的多种修改和变型将对本领域技术人员显而易见，而不脱离本发明的范围和精神。虽然已经联系具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解如要求专利的本发明不应不当地受限于此类具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的多种修改，其对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见，意在属于以下权利要求的范围内。

技术特征：
1.梭菌神经毒素，用于通过促进神经免疫应答来治疗患者脑病的方法中。2.梭菌神经毒素，用于通过促进神经免疫应答来治疗患者脑组织损伤的方法中。3.根据权利要求1或权利要求2所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素促进脑中的小胶质细胞活性。4.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素促进小胶质细胞移行到脑组织损伤部位。5.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤部位促进小胶质细胞吞噬活性。6.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素促进小胶质细胞移行到感染部位。7.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在感染部位促进小胶质细胞吞噬活性。8.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中在施用梭菌神经毒素后，于≤60分钟后促进神经免疫应答。9.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中在施用梭菌神经毒素后，于≤10分钟后促进神经免疫应答。10.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中在脑组织损伤出现后，促进神经免疫应答≤48小时。11.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中在脑组织损伤出现后，促进神经免疫应答≤24小时。12.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素通过局部施用至患者头部来施用。13.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素通过皮下或颅内注射而局部施用至患者头部来施用。14.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素通过颅内注射来施用。15.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现之前施用。16.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现前≤4天施用。17.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现前1-3天之间施用。18.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现后≤24小时施用。19.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现后≤2小时施用。20.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素在脑组织损伤出现后≤10分钟施用。21.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由创伤性脑
损伤、癌症、传染性疾病、中风、神经变性病、脑动脉瘤、多发性硬化、缺氧性损伤、中毒性损伤和/或代谢性损伤引起。22.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由无创脑损伤引起。23.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由癌症、传染性疾病和/或中风引起。24.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由传染性疾病引起。25.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由选自脑炎、脑膜炎和脑脓肿的传染性疾病引起。26.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由选自脑炎和脑膜炎的传染性疾病引起。27.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由中风引起。28.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述脑病由选自以下的神经变性病引起：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森病相关疾病、运动神经元病(例如肌萎缩性侧索硬化症)、朊病毒病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、共济失调、hallervorden-spatz病和额颞叶变性。29.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中皮下、颅内、鞘内或鼻内施用所述梭菌神经毒素。30.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素是肉毒神经毒素(bont)。31.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素是肉毒神经毒素血清型a (bont/a)。32.根据前述权利要求中任一项所述用途的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素是嵌合神经毒素。

技术总结
本发明提供了用于通过促进神经免疫应答来治疗患者脑病的方法中的梭菌神经毒素。来治疗患者脑病的方法中的梭菌神经毒素。来治疗患者脑病的方法中的梭菌神经毒素。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：益普生生物制药有限公司
技术研发日：2022.01.14
技术公布日：2023/10/7