使用源自短波单胞菌属菌株的酶基因生产生物化学品的方法以及由此制备的组合物与流程

使用源自短波单胞菌属菌株的酶基因生产生物化学品的方法以及由此制备的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2021年8月5日提交的美国非临时申请17/395,421、2021年3月3日提交的日本专利申请no.2021-033930的权益，且还要求2020年12月24日提交的美国临时申请63/130,569的优先权，三个申请全部通过引用并入本文。
3.关于序列表的声明
4.与本技术相关的序列表以文本而非纸质副本文件格式提供，且通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为5627_st25.txt。文本文件为277.5kb，2021年9月29日创建，并通过efs-web电子提交。


背景技术：

5.本公开总体涉及分子生物学领域，且更具体地，涉及基因工程化微生物的代谢途径以利用各种原料，包括气态原料，用于生物化学品的生物生产。
6.发明简述
7.在某些实施方案中，提供了用于表达类胡萝卜素产物的核酸序列，所述产物包含seq id no:1、5、6、7或8中的任一个或多个。在某些常见的实施方案中，提供了包含seq id no:1的核酸和异源核酸序列的载体。
8.在某些常见的实施方案中，提供了编码酶的核酸序列，所述酶包含与seq id no:2至少96％相同或同源的氨基酸序列，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少97％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少98％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少99％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。
9.在常见的实施方案中，提供了包含一个或多个核酸序列的载体，所述核酸序列编码包含与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列的酶，其中当表达时，所述酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少97％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少98％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少99％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。
10.在常见的实施方案中，提供了合成核酸构建体，其包含启动子、核糖体结合位点和一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码包含与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列的酶，其中当表达时，所述酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少97％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少98％相同或同源，
且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。在某些相关实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:2至少99％相同或同源，且所表达的酶能够将β-胡萝卜素转化为角黄素。合成的核酸构建体通常是包含质粒的载体。
11.在常见的实施方案中，提供了包含上文和本文所述的合成核酸构建体的转化的表达宿主生物体，且所述转化的宿主生物体能够异源表达所述合成核酸构建体。通常，表达宿主生物体是适于以化学自养代谢模式生长的转化细菌。在某些实施方案中，表达宿主生物体是钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)。
12.在某些实施方案中，提供了对应于来自短波单胞菌(brevundimonas)菌株ob307的crtw类胡萝卜素酮酶基因的核酸序列，所述基因编码seq id no:2的氨基酸序列，其中所述核酸序列包含于适于在生物宿主细胞中产生类胡萝卜素的表达构建体中。在某些常见的实施方案中，所述生物宿主细胞能够使用co2和h2来满足作为宿主细胞的至少一部分碳和能量需求。
13.在某些实施方案中，提供了对应于crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶基因融合体的核酸序列，其中所述融合体的crtw部分是来自短波单胞菌属菌株ob307的酮酶基因，其编码氨基酸seq id no:2。
14.在某些实施方案中，提供了编码seq id no:4的crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶融合蛋白的核酸序列，其中(a)所述融合蛋白的crtw部分是来自短波单胞菌属菌株qb307的酮酶基因，其编码seq id no:2的氨基酸序列，以及(b)所述核酸序列是表达构建体的一部分，其中当其功能性整合到生物宿主细胞中时适于产生类胡萝卜素。
15.在某些实施方案中，提供了编码seq id no:4的crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶融合蛋白的核酸序列，其中(a)所述融合蛋白的crtw部分是来自短波单胞菌属菌株qb307的酮酶基因，其编码seq id no:2的氨基酸序列，以及(b)所述核酸序列是表达构建体的一部分，其中当其功能性整合到生物宿主细胞中时适于产生类胡萝卜素，以及(c)所述生物宿主细胞能够使用co2和h2来满足其至少一部分碳和能量需求。
16.在某些实施方案中，提供了适于使用转座子将dna序列插入细菌基因组的自杀载体构建体，所述自杀载体构建体包含(a)dna序列；(b)含有转座子的包含seq id no:9的核酸序列的插入片段两翼dna；以及(c)自杀质粒骨架。在一些实施方案中，所述自杀载体构建体适于使用转座子将dna序列插入细菌的微生物基因组中。所述微生物基因组可包括生物体，诸如古细菌、细菌和酵母。
17.在某些实施方案中，提供经转化的宿主细胞，其包含编码氨基酸seq id no:2的核酸序列，其中所述核酸序列是适于在所述宿主细胞中生产类胡萝卜素的表达构建体的一部分。
18.在某些实施方案中，提供了形成本文预期的转化的宿主细胞的方法，包括使用转座子将表达构建体插入宿主细胞的基因组中。通常这种利用转座子的插入是随机插入。
19.在某些实施方案中，提供对应于来自短波单胞菌属菌株ob307的crtw类胡萝卜素酮酶基因的核酸序列，所述基因编码seq id no:2的氨基酸序列，其中所述核酸序列是适于在无细胞表达体系中生产类胡萝卜素的表达构建体的一部分。
20.在某些实施方案中，提供了通过在宿主细胞中异源表达ob307-crtw而在生物宿主细胞中生产酮基类胡萝卜素的方法。生物宿主细胞通常包含氢氧化细菌。且通常地，氢氧化
细菌包括选自以下的菌株：贪铜菌属(cupriavidus)、红细菌属(rhodobacter)、红球菌属(rhodococcus)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、红螺菌属(rhodospirillum)、副球菌属(paracoccus)或氢噬胞菌属(hydrogenophaga)。在某些实施方案中，氢氧化细菌的菌株是钩虫贪铜菌。在某些通常包括的实施方案中，生物宿主细胞作为不同物种宿主细胞的聚生体的一部分培养。
21.在某些实施方案中，提供了在生物宿主细胞中生产酮基类胡萝卜素的方法，包括用包含crtz-ob307-crtw融合体的载体转化生物宿主细胞，并在生物宿主细胞中异源表达crtz-ob307-crtw融合体以合成酮基类胡萝卜素；或在生物宿主细胞中异源表达crtz-ob307-crtw融合体以合成酮基类胡萝卜素。生物宿主细胞通常包含氢氧化细菌。且通常地，氢氧化细菌包括选自下组的菌株：贪铜菌属(cupriavidus)、红细菌属(rhodobacter)、红球菌属(rhodococcus)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、红螺菌属(rhodospirillum)、副球菌属(paracoccus)或氢噬胞菌属(hydrogenophaga)。在某些实施方案中，氢氧化细菌是钩虫贪铜菌。在某些通常包括的实施方案中，生物宿主细胞作为不同物种宿主细胞的聚生体的一部分培养。
22.在某些实施方案中，提供了在体外从β-胡萝卜素生产角黄素的方法，其包括在包含β-胡萝卜素的溶液中接触核酸序列的蛋白质表达产物，所述核酸序列与seq id nos:1、5、6、7或8的任一个的核酸序列至少96％相同，其中所述蛋白质表达产物催化至少一些β-胡萝卜素转化成角黄素。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少90％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少91％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少92％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少93％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少94％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中的任一个的核酸序列至少95％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中任一个的核酸序列至少97％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中的任一个的核酸序列至少98％相同。通常，所述核酸序列与seq id no:1、5、6、7或8中的任一个的核酸序列至少99％相同。在某些常见实施方案中，所述宿主生物体是天然产生β-胡萝卜素的宿主生物体。
附图说明
23.图1描述了法尼基二磷酸(fpp)至虾青素的生物合成途径中的各个酶和产物的示意图。典型的类胡萝卜素代谢途径包括基因crte、b、i、y、z和w。
24.图2描述了具有crtz和ob-307crtw的体系1虾青素操纵子的组件。
25.图3描述了不具有crtz的体系2角黄素操纵子的组件。
26.图4描述了具有crtzw融合基因的体系3虾青素操纵子的组件。
27.图5描述了用于制备虾青素(含有ob307-crtw基因)的合成类胡萝卜素操纵子的详细图谱，其中将tn5转座酶基因插入自杀载体，其中四环素作为抗生素抗性标记。添加转座子是为将操纵子随机插入宿主细胞的基因组中。
28.图6描述了使用转座子诱变将操纵子转化和染色体插入宿主细胞的过程。此处使用体系1为例。(me＝嵌合体末端(反向重复序列)；pro＝启动子；ori＝复制起点或转移起
点；term＝转录终止子)。
29.图7是显示由钩虫贪铜菌细胞产生的角黄素的hplc色谱图，所述钩虫贪铜菌细胞异源表达角黄素生物合成途径。实线:细胞提取物。虚线:角黄素标准品。
30.图8是图7所示角黄素峰的相应uv-vis光谱。
31.图9是显示来自钩虫贪铜菌细胞的类胡萝卜素产物的hplc色谱图。所述钩虫贪铜菌细胞异源表达虾青素生物合成途径。实线:细胞提取物。虚线:虾青素标准品。
32.图10是图9所示虾青素峰的相应uv-vis光谱。
33.发明详述
34.类胡萝卜素是长链类异戊二烯分子，其在鱼饲料、动物饲料和营养品中作为着色剂和添加剂具有营养优势，因为其提供针对细胞氧化损伤，特别是针对自由基和活性氧物质的保护。类胡萝卜素可在植物、藻类、古细菌、真菌和细菌中表达，无论是天然地还是通过一种或多种编码生物合成酶的类胡萝卜素基因的表达。四十碳(c40)四萜类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)的传统生产涉及从各种微生物或植物中提取天然分子。然而，一些天然存在的虾青素生产者，诸如酵母(xanthophyllomyces)产生的虾青素的对映体价值较低，而且培养高产的天然产生的微藻(例如雨生红球藻(haematococcus pluvialis))的过程困难、耗时，需要大量的资源且昂贵。
35.已通过从石油原料的化学合成实现了分子(诸如虾青素和角黄素)的非生物生产(ernst，2002)。然而，这些后来的方法产生的虾青素对映体的混合物也不太有价值，因为不是有效的自由基淬灭剂和治疗剂，且这些合成产物在eu关于人和动物消耗方面面临重大监管问题。最近，基因工程化生物体已经用于生产高价值的角黄素、虾青素和其他c40类胡萝卜素和叶黄素。图1显示了从法尼基二磷酸(fpp)到虾青素的类胡萝卜素生物合成途径。
36.除虾青素之外，角黄素是有价值的类胡萝卜素产物，其可通过酮酶合成，诸如作用于β-胡萝卜素为其底物的细菌crtw酮酶基因。类胡萝卜素诸如角黄素和虾青素可由酮酶产生，所述酮酶由来自各种短波单胞菌属物种的crtw基因编码，其被认为是最具活性和有效的类胡萝卜素酮酶。
37.还需要一种使用这种crtw酶可以便宜且有效地生产类胡萝卜素的表达系统，因为在天然或基因修饰的生物体中每克干重生物质的类胡萝卜素收率和产率不高。
38.氢氧化细菌是表达类胡萝卜素的有吸引力的宿主，因为一些物种比许多其他细菌天然产生更大量的内膜，且这些膜是积累高亲脂性c40类胡萝卜素所需的。
39.广泛的膜容量也是有利的，因为crtz羟化酶和crtw酮酶可能是含有能够跨越细胞膜的跨膜(tm)螺旋的整合膜蛋白。
40.此外，因为某些氢氧化细菌诸如钩虫贪铜菌不天然产生类胡萝卜素，存在较少的可能有调节干扰(例如反馈抑制)或对产物不期望的酶促修饰(例如囊泡短波单胞菌(brevundimonas vesicularis)菌株dc263中，其天然将虾青素产物羟基化为二羟基-虾青素，因为其含有crtg基因)。
41.如此产生的类胡萝卜素作为细菌生物质的一部分提供或从其提取，以产生基本上纯的类胡萝卜素产物，或通过其他提取方法，诸如超临界co2或基于溶剂的提取，以形成浓缩物。此外，类胡萝卜素诸如角黄素可与其他成分(诸如糖、玉米淀粉、木质素磺酸盐、粘合剂、油或其他成分)混合以生产产品(例如dsm叶蜡石红10％)。
42.细菌crtw酶使用6-8个以下的氨基酸残基以结合催化氧化反应的双铁辅因子：his69、his73、his107、his110、his111、his225、his228和his229，如通过富含his的基序hx(3或4)h、hx(2或3)hh和hx(2或3)hh的存在来确定。基于诱变研究，也可能需要asp118。因此，尽管不希望受任何特定操作理论的束缚，据信这种酶的天然或工程化形式应该或必须包括这些配体以具有催化活性。同样，这样的酶可能需要功能性跨膜序列，因为存在推定的tm螺旋，其似乎组织膜内侧的铁结合位点。
43.此前已经证明，在具有高g+c含量的细菌中表达这种密码子优化的基因途径具有挑战性，例如，因为gc含量使得难以重新合成用于合成生物学的基因和操纵子。
44.本公开描述了新型短波单胞菌属菌株(本文命名为ob307)中的新发现的crtw基因，其编码用于类胡萝卜素合成的新酮酶。从实验室琼脂petri平板上的污染菌落中分离出强烈红色的细菌菌株。在显微镜中，细胞是短棒状，长约0.5μm
×
2.0μm。该非致病性的好氧细菌可以在多种不同的异养培养基中培养，包括luria-bertani肉汤和琼脂培养基以及含有2％(w/v)果糖的mr2基本培养基。合适的生长条件包括在具有bellco帽的玻璃培养烧瓶中以150rpm在30℃振荡。该特异性crtw基因可用于从β-胡萝卜素生产有用和有价值的类胡萝卜素，诸如虾青素和角黄素。
45.本公开还提供了包含其他相关的类胡萝卜素基因序列的示例性合成操纵子，其表达用于产生酮类胡萝卜素。将衍生自这些序列的合适dna表达构建体插入表达宿主中用于表达。所述表达产物是可用于将β-胡萝卜素转化为角黄素和虾青素的酮酶。该合成操纵子的类胡萝卜素产物已在大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)b-14200、芽孢杆菌(bacillus)b-356、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)、球形红细菌(rhodobacter sphaeroides)和钩虫贪铜菌(cuprividus necator)中表达。沼泽红假单胞菌和球形红细菌通常被称为紫色非硫(pns)细菌。荚膜红细菌(rhodobacter capsulatus)是可用作这些dna表达构建体的宿主的另一种pns细菌。
46.如本文公开，通过克隆所公开的dna序列(包括具有本文所述属性的类似序列)，将dna排列成包含核糖体结合位点、启动子和终止子以及其他结构基因元件的构建体，本公开的crtw酮酶通常用于生产酮类胡萝卜素(诸如虾青素和角黄素)。根据本发明实施方案的其他酶基因，诸如crtz、crty、crti、crtb、crte以及其他结构和控制元件也任选地掺入到构建体中以形成用于类胡萝卜素生产的操纵子。然后使用本领域已知的方法，将该构建体引入到宿主生物体诸如宿主细胞中，作为一种或多种小的、环化的dna载体(诸如质粒)，或通过掺入到生物体的基因组中。对于已经产生β-胡萝卜素的生物体，引入编码该单一酶的基因以使得该crtw酮酶的产生和一些β-胡萝卜素转化为角黄素。如果还引入crtz基因，则还可以表达基因产物(即羟化酶)，且其将至少一些角黄素转化为虾青素。
47.例如，所述crtw基因的产物用于无细胞表达体系，其中β-胡萝卜素被酶促转化为角黄素。如果crtz和crtw基因同时或依次组合表达，则至少一部分β-胡萝卜素底物将被转化为角黄素，而一部分通过两种基因的酶产物的作用被转化为虾青素。新的crtw和crtz基因可以在两个不同的dna片段上提供，或作为单个dna片段提供，所述dna包含编码crtw酮酶和crtz羟化酶功能的融合蛋白的基因。
48.许多不同的生物体是这种新crtw基因的潜在异源表达宿主。能够利用h2和co2作为能量和碳源的宿主和不能利用h2和co2作为能量和碳源的宿主被认为是合适的异源表达宿
主。例如，这些包括细菌、植物、藻类、古细菌和真菌。细菌诸如大肠杆菌(escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，真菌诸如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)以及米曲霉菌(aspergillus oryzae)，植物诸如光稃稻(oryza glaberrima)，藻类诸如普通小球藻(chlorella vulgaris)，或古细菌诸如硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)，或其他物种的生物体，可用作该新crtw基因的异源表达宿主，用于产生其编码的酶以及用于通过此酶的作用产生类胡萝卜素产物。
49.本文公开的该酶和合成操纵子的异源表达已最初使用广泛宿主范围的表达质粒，在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌b-14200、芽孢杆菌b-356、沼泽红假单胞菌、球形红细菌和钩虫贪铜菌中显示。在所有情况下，通过转化细菌中产生角黄素(相对于野生型生物体中不产生角黄素)观察到新ob307-crtw基因的异源表达。使用与钩虫贪铜菌中所用相同的质粒实现该转化。本文公开的启动子在所有这些菌株中有活性。如上所述，使用质粒的电穿孔转化大肠杆菌细胞。根据标准方法使用大肠杆菌菌株s17-1接合来转化其他菌株(参见例如，phornphisutthimas等，2007；gruber等，2015)。首先将接合的细胞铺板在lb琼脂上，然后以系列稀释液重悬于无菌液体培养基中，并铺板在以下琼脂平板上:(1)对于大肠杆菌，lb+50μg/ml卡那霉素或10μg/ml四环素；(2)对于芽孢杆菌，mr2培养基+2％果糖和50pg/ml卡那霉素；和(3)对于钩虫贪铜菌和pns细菌，mr2培养基+2％果糖和500μg/ml卡那霉素。然后挑选存活的转接合子菌落并在新鲜平板上再划线直到获得纯的单个菌落。通过将给定变体的细胞接种到lb+抗生素(对于所有菌株)或mr2+抗生素(对于h
2-氧化pns细菌和钩虫贪铜菌)中来进行液体培养物中的生长。
50.由crtz和crtw组成的融合基因通过构建一段合成dna来产生，其中crtz和crtw通过接头序列连接，并将该融合序列掺入到合成操纵子中以替代表达质粒中的原始crtw基因。然后将该异源表达载体转化到大肠杆菌和钩虫贪铜菌中。在两种情况下都观察到虾青素和角黄素的产生。等位基因交换系统(使用具有6％蔗糖(w/v)的无nacl琼脂培养基用于sacb果聚糖蔗糖酶反选择)和自杀载体也用于将该合成操纵子插入钩虫贪铜菌基因组，并且再次观察到了类胡萝卜素的产生。
51.与其他钩虫贪铜菌菌株以及其他氢氧化细菌菌株一样，钩虫贪铜菌菌株h16已被用作表达宿主。因此，类胡萝卜素产物可通过使用廉价原料(例如，废co2、h2、o2和矿物盐)对转化的细菌进行气体发酵来产生，以提高该方法的经济效率。
52.可用本文所述载体和dna构建体转化，在类胡萝卜素途径中异源表达并生长于h
2-co
2-o2的其他氢氧化细菌属种包括，例如，荚膜红细菌(rhodobacter capsulatus)和其他红细菌种、副球菌(paracoccus)、红球菌(rhodococcus)、嗜氢菌(hydrogenophaga)、红螺菌(rhodospirillum)、假单胞菌(rhodopseudomonas)等。
53.短波单胞菌ob307的新菌株作为红橙色污染物菌落从实验室的琼脂平板分离。对其16s rrna基因进行测序(正向和反向)，并使用clustal w与其他短波单胞菌种的16s序列进行比较。该分析表明ob307与来自纳斯达短波单胞菌(b.nasdae)和囊泡短波单胞菌(b.vesicularis)的16s序列具有99.7-99.8％的同一性。从大约100mg湿细胞沉淀中提取基因组dna，使用60
×
illumina配对末端测序(150个碱基对读数)对整个基因组测序，并由snpsaurus,inc(eugene,or)组装和注释序列重叠群。从该序列中，blast检索鉴定了与其他公开的类胡萝卜素生物合成基因具有高度相似性的多个基因。
54.完整的可读框序列之一最初由注释软件鉴定为“脂肪酸去饱和酶”。已知脂肪酸去饱和酶具有与类胡萝卜素酮酶类似的结构，且进一步的分析表明该序列与crtw型类胡萝卜素酮酶具有高度相似性，且我们随后的表达克隆证实了其活性。因此，该基因序列在本文中称为qb307-crtw(seq id no:1)。从ob307-crtw的翻译的氨基酸序列可以看出，其含有8-组氨酸基序(以黄色高亮显示)和asp-118(以蓝色高亮显示)，它们定义了这种类型的酮酶(seq id no:2)的二铁结合位点。seq id no:3显示了ob307-crtw和来自短波单胞菌属菌株dc263的crtw(genbank登录号abc50116.1)之间的clustal w2.1氨基酸序列比对。两种蛋白质都含有241个氨基酸，且它们之间有11个氨基酸差异(约95.5％同一性)。最近，来自短波单胞菌属菌株sgair0440的推定的crtw基因作为空气污染细菌的基因组序列的一部分公开(genbank登录号qcr00114)。该基因与ob307-crtw的氨基酸序列具有99.6％的相似性，然而，没有报道其已被克隆和表达，也没有分析该酶的功能以证实其确实为β-胡萝卜素酮酶。
55.将天然qb307-crtw序列转化为密码子优化的新序列，用于在钩虫贪铜菌中表达。包括该新序列作为包含制备角黄素的crte、crty、crti、crtb和crtw的密码子优化的合成操纵子的一部分(图3)。设计用于制备虾青素的构建体也包括完整的crtz序列(图2)。该途径中的其他基因序列来源于各种其他细菌，其中genbank登录号如下:基因crte、crty、crti和crtb由成团泛菌(pantoea agglomerans)/草生欧文氏菌(erwinia herbicola)pac-beta质粒m8720/m99707的序列合成；crtz由菠萝泛菌(pantoea ananatis)菌株aj13355，nc_017533的序列合成；以及crtw由本文所述的qb307-crtw的序列合成。
56.由于非常高的g+c含量(ca.61％-70％)，操纵子的合成得益于专用的程序(例如，可获自aster bioscience,inc.；livermore,ca)。将一种在钩虫贪铜菌中具有高活性的组成型启动子置于类胡萝卜素基因的上游以引导细胞中的mrna合成。其他合适的启动子是本领域熟知的并在本文中预期。如果与宿主的代谢和转运系统相容，则还可以使用诱导型启动子，其可用于通过应用外部诱导物分子(例如，用于lac或tac启动子的iptg)或环境刺激(例如，用于phac1启动子的氮剥夺)来控制基因转录开始的时间。将针对钩虫贪铜菌优化的核糖体结合位点(rbs)置于每个基因序列的上游。为优化总体表达，在crte基因的启动子和rbs之间，以及在rbs和每个单独基因的起始密码子之间添加间隔子序列。将终止序列(大肠杆菌rrnb)置于操纵子的末端以防止任何下游元件的不期望的翻译。
57.首先通过使用ndei和asei作为两翼限制位点，将合成操纵子(seq id no:6、7和8)克隆到广泛宿主范围质粒pbbr1mcs-2(例如，卡那霉素为选择)中来测试其活性。通过使用带有capacitance extender plus pulse controller ii单元(bio-rad inc.,hercules,ca)的bio-radgene pulserii进行电穿孔，将连接的dna产物转化入大肠杆菌。根据belcher和knight在线手册(https://openwetware.org/wiki/belcher/knight:_electrocompetent_cells)中所述的方法，使用10％冷甘油洗涤三次，将大肠杆菌细胞制成电感受态。将50μl电感受态细胞添加到冷却的1mm间隙无菌比色杯中，并与1μl dna(约1-50ng)混合。电穿孔仪设置如下:1.2kv，25pf，200ω。时间常数通常为3-5ms。脉冲后，然后将细胞转移到小的无菌管中的预热的sob培养基中，并在37℃下振荡恢复1小时。然后将等分试样铺板在含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂上用于抗生素选择。在30℃下孵育后，挑取菌落并在lb肉汤中单独生长。通过标准方法从各种克隆中分离质粒dna。用合适的限制酶切割dna，并通过琼脂糖凝胶电泳分析以鉴定阳性克隆。将来自一个正确克隆的质粒dna转化入
大肠杆菌接合菌株s17-1。然后重复上述过程以找到正确的s17-1克隆。然后将质粒pbbr1 mcs-2中含有合成角黄素或虾青素操纵子的s17-1克隆接合到钩虫贪铜菌宿主菌株中或如上所述的标准方法获得的其他宿主菌株。在含有500μg/ml卡那霉素的固体mr2-果糖培养基(表1)上铺板后，出现了钩虫贪铜菌菌落。挑选显示深橙色或红色的菌落并在卡那霉素平板上再划线以确认其着色表型和抗生素抗性。挑选选择的克隆并在含有抗生素的液体培养基中培养。
58.表1.mr2培养基的组成
[0059][0060]
如上所述，通过基因融合crtz和crtw的基因以编码嵌合蛋白，可以提高虾青素生产途径末端的酶的加工性能。通过将短接头肽(编码氨基酸序列ggggsggpgs)的dna序列插入到菠萝泛菌(pantoea ananatis)的完整crtz基因的3’端和qb307-crtw基因的5’端(无n-端甲硫氨酸)之间来产生融合蛋白序列，如图4的图谱以及seq id no:4，seq id no:5和seq id no:8所示。对crtz-crtw融合序列进行密码子优化、合成，并用于取代原始操纵子构建体中的crtw基因以产生称为体系3(seq id no:8)的插入物。当如上所述将编码该序列的表达质粒转化到合适的宿主中时，细胞表达虾青素(图9和图10)。
[0061]
在某些实施方案中，通过基因修饰，特别是通过定向进化的方法来改进本文预期的途径，例如通过随机诱变和文库筛选以鉴定改进的变体。宿主基因组的菌株工程化也可用于提高重组途径基因的表达。
[0062]
在某些实施方案中，将操纵子半随机插入基因组，然后筛选生产水平。在类胡萝卜素生产的情况下，可以通过在来自转化体的平板文库的菌落中寻找强烈的颜色产生来进行该筛选。因此，构建定制的自杀载体(基于hmelo等(2015)的非复制性等位基因交换质粒)以便通过用ndei和nsii限制性克隆将操纵子插入噬菌体tn5转座子的嵌合末端(内部和外部
末端序列反向的19bp)之间。还将tn5转座酶序列与四环素抗性盒一起插入质粒中(使用gateway克隆)充当抗生素标记(参见例如图5、图6和seq id no:9)。将转座子自杀载体组装，转化入大肠杆菌菌株s17-1，然后接合至如上所述的钩虫贪铜菌菌株h16中。如上所述将转接合子铺板于mr2琼脂+2％果糖和10μg/ml四环素中，随后第二次铺板于lb琼脂+50μg/ml卡那霉素或mr2琼脂+2％果糖和50μg/ml卡那霉素中以除去大肠杆菌供体。如上所述挑选橙色和红色菌落以进一步表征其类胡萝卜素。观察到各种浅色和强烈着色的菌落，表明操纵子已经插入到表达类胡萝卜素的每个克隆中的不同基因组位置。
[0063]
为快速证实该途径的初始表达和类胡萝卜素产物的产生，在30℃下，将具有pbbrmcs-2表达质粒的钩虫贪铜菌克隆接种到摇瓶中的50ml无菌液体基本培养基(mr2,ph6.8)中，其中添加20g/l果糖作为碳源。生长约48小时后，培养物达到约1.4的a620(在620nm下测量的光密度)，且由于类胡萝卜素的产生，其呈现深橙色或红色。用表达质粒转化的其他表达宿主，诸如枯草芽孢杆菌菌株nrrl b-14200、枯草芽孢杆菌菌株nrrl b-354、沼泽红假单胞菌菌株nrrl b4276和球形红细菌菌株nrrl b1727，也以这种方式培养。nrrl菌株获自usda-ars培养物保藏中心(peoria,il)。
[0064]
为评价类胡萝卜素在气体上的产生，将含有基因组整合操纵子的细胞接种到装有浸没气体入口和出口的带盖搅拌烧瓶(磁力搅拌棒)中的200-500ml灭菌的ph 6.8的mr2基本培养基(无碳源)中。将灭菌的外部气体入口、出口和橡胶管盖有无菌盘式过滤器(0.2μm孔径；醋酸纤维素注射器过滤器，vwr)以防止来自外部大气的污染。h2:co2:o2的混合物以大约80:10:10的比例由商业气瓶(praxair,inc.)或通过发电机(dominick hunter model 40h；charlotte,nc)电解氢气提供。在一些实施方案中，co2作为废co2(通常含有其他气体，例如h2、co、so
x
、no
x
)从水泥制造、化石燃料燃烧、石化加氢裂化操作等收集，并在加压钢瓶中供应。气体混合和气体流速由气体流量计和质量流量控制器(alicatscientific,inc.,tucson,az)的小网络控制。将搅拌板和烧瓶置于培养箱中保持在30℃。收集排出气体并排放到外部空气中。培养物生长72小时，直到细胞达到约0.4的a620，并明显变成红色或橙色。在商业规模上，这种类型的培养是在专门为完全依靠气体进行大容量培养而设计的循环生物反应器中进行的。petersen等(2017)中提供了用于甲烷营养生物(使用甲烷和氧气作为原料)的气体发酵的循环生物反应器的实例。在另一个实施方案中，表达类胡萝卜素基因的宿主细胞的发酵和培养使用聚生体(即，不同物种的混合物)以提高含类胡萝卜素的生物质的生长速率或提高生物质的整体特性。
[0065]
采用无细胞体系的生产。预期本公开中提供的酶和构建体用于使用无细胞表达体系来表达途径酶并产生类胡萝卜素产物(schneider等，2010；gregorio等，2019；khambati等，2019)。此类的体系可以，例如进料有类胡萝卜素途径的简单前体，诸如ipp和dmap和fpp，并将这些化合物转化成更有价值的酮类胡萝卜素产物。无细胞表达是指，当与多核苷酸组合时允许由多核苷酸编码的多肽或蛋白质的体外翻译的试剂。这些体系是本领域已知的，并且存在于真核和原核应用中。可与本公开结合使用的示例性无细胞表达体系包括，例如，用于各种物种的商业试剂盒，诸如可得自invitrogenambion，qiagen和roche molecular diagnostics的提取物，由氢氧化细菌制备的细胞提取物，包括选自以下的菌株：贪铜菌、红细菌、红球菌、红假单胞菌、红螺菌、副球菌或氢噬胞菌，以及大肠杆菌和其他菌株。
[0066]
通过以6,000x g离心10分钟收获细胞。在磷酸盐缓冲盐水中再悬浮后，再次离心细胞。在1.5ml微量离心管中用正己烷/甲醇(1:1v/v)提取洗涤的细胞沉淀的等分试样。通过以14,000x g离心5分钟将溶剂提取物与细胞碎片分离。类胡萝卜素还可使用超临界co2萃取从生物质中有效地分离和纯化(valderrama等，2003；disanzo等，2018)。
[0067]
类胡萝卜素分析。为鉴定和分析类胡萝卜素的生产，通过注射器将50μl溶剂萃取的样品上样到symmetry c18 5μm(4.6
×
250mm)hplc(高效液相色谱)柱上，该柱用含甲醇/水90:10(v/v)的溶液预平衡。运行溶液由水、乙酸乙酯和水的梯度组成。hplc仪器是装备有168nm二极管阵列检测器的beckman system gold。运行条件如下:流速:1ml/min；温度:30℃。通过将其保留时间与溶于正己烷的已知类胡萝卜素标准溶液进行比较来鉴定峰。角黄素标准品获自honeywell research,inc.；虾青素来自abeam(cambridge,ma)。在可能的情况下，还可通过洗脱组分的特征吸收光谱来鉴定洗脱组分。显示了使用本公开的表达系统产生的角黄素(图7)和虾青素(图9)的样品色谱图，及其相应的uv-vis吸收光谱(图8和10)。这些实验证实ob307-crtw基因确实编码β-胡萝卜素酮酶，且表达新的ob307-crtw基因的构建体确实产生角黄素和虾青素。
[0068]
当基因在各种表达宿主中异源表达时，该crtw序列有时需要密码子优化，以产生足够量的活性酶来催化β-胡萝卜素转化为角黄素。对于合成操纵子和其中基因序列被排列以产生融合蛋白(诸如crtz-crtw融合蛋白)的构建体也是如此。在本公开的一些实施方案中，表达宿主是植物。在一些实施方案中，表达宿主是真菌，诸如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，表达宿主是藻类，诸如普通小球藻(chlorella vulgaris)。在一些实施方案中，表达宿主是细菌，诸如甲基营养菌(例如，methylococcus extorguens)、甲烷氧化菌(例如，荚膜甲基球菌(methylococcus capsulatus))、产乙酸菌(例如，clostridium autoethanogenum)、氢氧化细菌(例如，钩虫贪铜菌)或紫色非硫细菌，诸如深红红螺菌(rhodospirillum rubrum)、类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(rhodobacter capsulatus)或沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)。其他可能合适的细菌宿主包括浑浊红球菌(rhodococcus opacus)、副球菌属，诸如玉米黄副球菌(paracoccus zeaxanthinifaciens)或大肠杆菌。
[0069]
前述说明书中，参考本发明的特定实施例描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到本发明并不限于此。上述发明的各种特征和方面可以单独或联合使用。此外，在不脱离本说明书的更宽的精神和范围的情况下，本发明可用于本文所述外的任何数量的环境和应用中。因此，说明书和附图认为是说明性的而非限制性的。应认识到，如本文所用的术语“包含”、“包括”和“具有”，具体地旨在解读为本领域的开放式术语。
[0070]
参考文献
[0071]
di sanzo,g et al.(2018)supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin,lutein,and fatty acids from haematococcus pluvialis microalgae.mar drugs 16:334.
[0072]
ernst,h(2002)recent advances in industrial carotenoid synthesis.cheminform 74:2213-2226.
[0073]
gregorio,ne et al.(2019)a user's guide to cell-free protein synthesis.methods protoc.2:24.
[0074]
gruber,s et al.(2015)versatile plasmid-based expression systems for gram-negative bacteria
‑‑
general essentials exemplified with the bacterium ralstonia eutropha h16.new biotechnol 32:552-8.
[0075]
hmelo,lr,borlee,br,almblad,h,et al.(2015)precision-engineering the pseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange.nat protoc 10:1820-1841.
[0076]
khambhati,k et al.(2019)exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.front bioen biotechnol 7:248.
[0077]
petersen,lah et al.(2017)mixing and mass transfer in a pilot scale u-loop bioreactor.biotechnol bioeng.114:344-354.
[0078]
petersen,lah et al.(2020)modeling and system identification of an unconventional bioreactor used for single cell protein production.chem eng j 390:124438.
[0079]
phornphisutthimas,s et al.(2007)conjugation in escherichia coli—a laboratory exercise.biochem mol biol educ 35:440-5.
[0080]
schneider,b et al.(2010)membrane protein expression in cell-free systems.in:heterologous expression of membrane proteins,methods in molecular biology,vol.601(i.mus-veteau,ed.),humana press,springer nature,switzerland.
[0081]
valderrama,j o et al.(2003)extraction of astaxantine and phycocyanine from microalgae with supercritical carbon dioxide j chem eng data 48:827-830.
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]

技术特征：
1.表达构建体，其包含:来自短波单胞菌属菌株ob307的crtw类胡萝卜素酮酶基因的核酸序列，其编码seq id no:2的氨基酸序列，所述表达构建体适于在生物宿主细胞中产生类胡萝卜素。2.权利要求1所述的表达构建体，其中所述表达构建体是质粒。3.权利要求1或2所述的表达构建体，其中所述表达构建体被整合到所述生物宿主细胞的基因组中。4.表达seq id no:2的crtw类胡萝卜素酮酶蛋白的方法，所述方法包括：从短波单胞菌属中获得crtw基因，通过将启动子序列可操作地连接至crtw基因来产生表达构建体，使用复制质粒或通过基因组整合将表达构建体引入生物宿主细胞，并在导致crtw类胡萝卜素酮酶蛋白表达的条件下传代细胞。5.权利要求4所述的方法，其中当功能性整合至所述生物宿主细胞中时，所述表达构建体适于产生类胡萝卜素。6.权利要求4或5所述的方法，其中所述蛋白质在生物宿主细胞中进一步表达，所述宿主细胞能够利用co2和h2满足其至少部分碳和能量需求。7.权利要求4、5或6所述的方法，其中所述crtw基因是来自短波单胞菌属菌株ob307的酮酶基因。8.产生编码seq id no:4的crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶融合蛋白的核酸序列的方法，所述方法包括:从短波单胞菌属中获得crtw基因，将编码seq id no:5的10个氨基酸的接头肽的序列添加至crtw基因的3
’‑
端；将编码crtz基因的序列添加至接头肽的3
’‑
端以产生dna构建体，所述crtz基因缺少n-端甲硫氨酸密码子且含有3’终止密码子；以及将所述dna构建体插入表达载体。9.权利要求8所述的方法，其中所述核酸序列是当被功能性引入生物宿主细胞中时适于产生类胡萝卜素的表达构建体的一部分。10.权利要求8或9所述的方法，其中所述crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶融合蛋白进一步在生物宿主细胞中表达，所述生物宿主细胞能够利用co2和h2满足其至少部分碳和能量需求。11.权利要求8、9或10所述的方法，其中所述crtw序列是短波单胞菌属菌株ob307的酮酶基因，其编码seq id no:2的氨基酸序列。12.自杀载体构建体，其适于使用转座子将dna序列插入细菌的微生物基因组中，所述自杀载体构建体包含:(a)dna序列；(b)含有seq id no:9的核酸序列的两翼插入片段dna，所述核酸序列含有转座子；以及(c)自杀质粒骨架。13.权利要求12所述的自杀载体构建体，其中所述dna序列编码用于产生类胡萝卜素的基因。14.表达构建体，其编码seq id no:4的crtz-crtw类胡萝卜素羟化酶-酮酶融合蛋白，
其中(a)所述融合体的crtw部分是来自短波单胞菌属菌株qb307的酮酶基因，其编码seq id no:2的氨基酸序列，且(b)当功能性整合至生物宿主细胞中时，所述核酸序列适于产生类胡萝卜素。15.源自生物细胞的食物或饲料添加剂产品，所述生物细胞含有权利要求1-14中所述的表达构建体、表达载体，或使用所述方法获得。

技术总结
公开了来自短波单胞菌属菌株的crtW基因，其编码用于类胡萝卜素合成的新型酮酶。还提供了含有额外的相关类胡萝卜素基因序列的示例性合成操纵子，其中合成操纵子的表达用于产生酮基类胡萝卜素。将源自这些序列的合适DNA表达构建体插入表达宿主中用于表达。所述表达产物是可用于将β-胡萝卜素转化为角黄素和虾青素的酮酶。素的酮酶。素的酮酶。


技术研发人员：宋佳翰 W
受保护的技术使用者：橡树生物公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2023/10/8