一株鞘氨醇单胞菌和一种修复菌剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及一株鞘氨醇单胞菌和一种修复菌剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域。


背景技术：

2.随着石油开采量的不断增加和石油污染的日益严重，石油污染土壤的修复成为目前研究的热点。目前修复石油污染的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。物理修复方法和化学修复方法成本高，对土壤环境扰动大，易破坏土壤生态；生物修复方法具有成本低，无二次污染等优点，因而受到人们的重视。微生物-植物联合修复技术是利用土壤-微生物-植物组成的复合体系来共同降解污染物，清除环境污染物的一种环境污染治理技术，环境中植物对微生物生长的促进作用，显著提高微生物对石油污染物的降解率。重金属污染在石油污染土壤中普遍存在，重金属对微生物的毒害作用会影响微生物-植物在土壤中的生物修复作用。因此，微生物-植物联合作用于石油-重金属复合污染土壤修复的研究具有重要意义。
3.爱尔兰专利文献ies20140311a2（申请号ies20140311）公开了一种修复有害有机物和/或重金属污染基质的方法，用以修复有机污染和/或重金属污染的土壤、沉积物和/或污泥。该方法包含了生物刺激、生物添加、根际修复、植物修复和原始生态堆等过程。该方法的步骤为：a.设计包含污染物降解菌、植物促生菌和/或生物表面活性剂产生菌的微生物菌剂；b.基质预处理；c.生态堆的建设；d.在生态堆顶部播种修复植物。上述专利通过多种微生物配合共同实现促进植物生长和修复有机污染和重金属污染的作用。但由于其采用多株微生物共同作用，导致协调多株微生物生长特性的条件复杂，对搭配的微生物种类及数量的技术要求很高。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一株鞘氨醇单胞菌和一种修复菌剂及其制备方法与应用，该修复菌剂既有良好的降解石油烃、多环芳烃等污染物的作用，又可以活化土壤中的重金属，促进植物对重金属的吸收提取，降低土壤中有机污染物及重金属的浓度，从而实现对污染土壤快速修复的目的。
5.术语说明：室温：具有本领域常规含义，一般是指25
±
5℃。
6.本发明的技术方案如下：一株伯克霍尔德氏菌(burkholderia sp.) am20，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27032。
7.一株鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.) am22，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国
科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27034。
8.一种修复菌剂，包括伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22。
9.根据本发明优选的，所述修复菌剂还包括草炭土。
10.根据本发明优选的，所述修复菌剂中伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22的活菌数之比为1:（1.1~3.8），总活菌数为（2.5~3.5）
×
109cfu/g。
11.本发明一种优选的技术方案，上述修复菌剂的制备方法，包括如下步骤：（1）分别将伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22在lb固体培养基上进行活化培养，制得活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌am22；（2）将步骤（1）制得的活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌am22分别接种于种子培养基中进行种子培养，制得伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌am22种子液；（3）将步骤（2）制得的伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌am22种子液分别接种于发酵培养基中进行发酵培养，制得伯克霍尔德氏菌am20菌液和鞘氨醇单胞菌am22菌液；（4）将步骤（3）制得的伯克霍尔德氏菌am20菌液和鞘氨醇单胞菌am22菌液混合，并加入草炭土，混合搅拌均匀，调节含水率至25~30%，室温放置后，得修复菌剂。
12.根据本发明优选的，步骤（1）中所述活化培养的条件为：35℃活化培养2天；所述lb固体培养基的组份如下：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 l，ph 7.0。
13.根据本发明优选的，步骤（2）中所述种子培养的条件为：35℃、150转/分钟摇床培养24h；所述种子培养基的组分如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0。
14.根据本发明优选的，步骤（3）中所述发酵培养的接种量为发酵培养基体积的5%。
15.根据本发明优选的，步骤（3）中所述发酵培养的条件为：35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养32h；所述发酵培养基的组分如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0。
16.上述修复菌剂在修复重金属和/或石油污染土壤中的应用。
17.根据本发明优选的，所述重金属为镉。
18.有益效果：1、本发明从自然界筛选出的伯克霍尔德氏菌am20能够活化土壤中的重金属，促进植物对土壤中重金属的吸收。
19.2、本发明从自然界筛选的鞘氨醇单胞菌am22，能够高效降解石油烃，修复石油烃污染土壤。
20.3、本发明的重金属及石油复合污染修复菌剂中，伯克霍尔德氏菌am20与鞘氨醇单胞菌am22协同作用，共同促进植物吸收土壤重金属的同时快速修复石油烃污染，在重金属及石油复合污染的修复中有广阔的应用前景。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅
限于此。实施例中涉及的原料及试剂均为普通市售产品。
22.实施例中涉及的微生物：一株伯克霍尔德氏菌(burkholderia sp.) am20，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27032。
23.一株鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.) am22，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27034。
24.实施例1一种重金属及石油复合污染修复菌剂的制备方法，步骤如下：（1）分别将伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22在lb固体培养基中于35℃条件下活化培养2天，制得活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌am22；其中，lb固体培养基的组分如下：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；121℃灭菌20min；（2）将步骤（1）制得的活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌am22分别接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌am22种子液；其中，种子培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（3）将步骤（2）制得的伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌am22种子液分别按发酵培养基5%的体积百分比接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养32h，制得菌体浓度为5.5
×
109cfu
·
ml-1
的伯克霍尔德氏菌am20菌液和菌体浓度为8.0
×
109cfu
·
ml-1
的鞘氨醇单胞菌am22菌液；其中，发酵培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（4）按质量比例取步骤（3）制得的伯克霍尔德氏菌am20菌液1份、鞘氨醇单胞菌am22菌液1份充分混匀后，与草炭土按1:10的质量比例混合搅拌，调节含水率至25~30%，室温下放置至伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22的总活菌数为2.5
×
109cfu/g，得重金属及石油复合污染修复菌剂；修复菌剂中，伯克霍尔德氏菌am20与鞘氨醇单胞菌am22的活菌数之比为1:1.1。
25.实施例2如实施例1所述的制备方法，不同之处在于，步骤（4）中按质量比例取伯克霍尔德氏菌am20菌液1份、鞘氨醇单胞菌am22菌液3份。
26.伯克霍尔德氏菌am20的活化及培养方法同实施例1。
27.鞘氨醇单胞菌am22的活化及培养方法同实施例1。
28.如实施例1，取伯克霍尔德氏菌am20菌液1份、鞘氨醇单胞菌am22菌液3份，充分混匀后，与草炭土按1:20的质量比例混合搅拌，调节水分至25~30%，室温下放置至伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22的总活菌数为3.5
×
109cfu/g，即得重金属及石油复合污染
修复菌剂；修复菌剂中，伯克霍尔德氏菌am20与鞘氨醇单胞菌am22的活菌数之比为1:3.8。
29.对比例1如实施例1所述的重金属及石油复合污染修复菌剂，不同之处在于，伯克霍尔德氏菌am20替换为洋葱伯克霍尔德氏菌（burkholderia cepacia）9659，保藏编号为cgmcc 1.3082。
30.鞘氨醇单胞菌am22的活化及培养方法同实施例1。
31.洋葱伯克霍尔德氏菌9659的活化及培养方法同实施例1中伯克霍尔德氏菌am20的一致。
32.本对比例中将制得的洋葱伯克霍尔德氏菌9659菌液与鞘氨醇单胞菌am22菌液进行配比，两者的质量比例为1:1，充分混匀后，与草炭土按1:10的质量比例混合搅拌，调节含水率至25~30%，室温下放置至洋葱伯克霍尔德氏菌9659与鞘氨醇单胞菌am22的总活菌数为3.1
×
109cfu/g，即得修复菌剂；修复菌剂中，洋葱伯克霍尔德氏菌9659与鞘氨醇单胞菌am22的活菌数之比为1:1.1。
33.对比例2如实施例1所述的重金属及石油复合污染修复菌剂，不同之处在于，鞘氨醇单胞菌am22替换为多食鞘氨醇杆菌（sphingobacterium multivorum），保藏编号为cgmcc no.1951，其中，多食鞘氨醇杆菌cgmcc no.1951为本实验室早期筛选到的菌株，最早公开于专利cn101050435a（申请号200710013906.7）中。
34.多食鞘氨醇杆菌cgmcc no.1951的活化及培养方法同实施例1中鞘氨醇单胞菌am22的一致。
35.伯克霍尔德氏菌am20的活化及培养方法同实施例1一致。
36.本对比例中将制得的伯克霍尔德氏菌am20菌液与多食鞘氨醇杆菌cgmcc no.1951菌液进行配比，两者的质量比例为1:1，充分混匀后，与草炭土按1:10的质量比例混合搅拌，调节含水率至25~30%，室温下放置至伯克霍尔德氏菌am20与多食鞘氨醇杆菌cgmcc no.1951的总活菌数为3.0
×
109cfu/g，即得修复菌剂；修复菌剂中，伯克霍尔德氏菌am20与多食鞘氨醇杆菌cgmcc no.1951的活菌数之比为1:1.1。
37.对比例3如实施例1所述的重金属及石油复合污染修复菌剂，不同之处在于，修复菌剂中只含有伯克霍尔德氏菌am20，不含有鞘氨醇单胞菌am22，制备步骤如下：（1）将伯克霍尔德氏菌am20在lb固体培养基中于35℃条件下活化培养2天，制得活化伯克霍尔德氏菌am20；其中，lb固体培养基的组分如下：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；121℃灭菌20min；（2）将步骤（1）制得的活化伯克霍尔德氏菌am20接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得伯克霍尔德氏菌am20种子液；其中，种子培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（3）将步骤（2）制得的伯克霍尔德氏菌am20种子液按发酵培养基5%的体积百分比
接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养36h，制得菌体浓度为8.5
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109cfu
·
ml-1
的伯克霍尔德氏菌am20菌液；其中，发酵培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（4）取步骤（3）制得的伯克霍尔德氏菌am20菌液与草炭土按1:10的质量比例混合搅拌，调节含水率至25~30%，室温下放置至伯克霍尔德氏菌am20的活菌数为2.5
×
109cfu/g，即得修复菌剂。
38.对比例4如实施例1所述的重金属及石油复合污染修复菌剂，不同之处在于，修复菌剂中只含有鞘氨醇单胞菌am22，不含有伯克霍尔德氏菌am20，制备步骤如下：（1）将鞘氨醇单胞菌am22在lb固体培养基中于35℃条件下活化培养2天，制得活化鞘氨醇单胞菌am22；其中，lb固体培养基的组分如下：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；121℃灭菌20min；（2）将步骤（1）制得的活化鞘氨醇单胞菌am22接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得鞘氨醇单胞菌am22种子液；其中，种子培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（3）将步骤（2）制得的鞘氨醇单胞菌am22种子液按发酵培养基5%的体积百分比接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养33h，制得菌体浓度为8.5
×
109cfu
·
ml-1
的鞘氨醇单胞菌am22菌液；其中，发酵培养基的组份如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；（4）取步骤（3）制得的鞘氨醇单胞菌am22菌液与草炭土按1:10的质量比例混合搅拌，调节含水率至25~30%，室温下放置至鞘氨醇单胞菌am22的活菌数为2.5
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109cfu/g，即得修复菌剂。
39.实验例1负载镉的石油污染土壤的制备：从胜利油田取石油含量为4.3%的石油污染土壤，自然风干后粉碎，配制0.5g/l的氯化镉水溶液浇灌于石油烃污染土壤中，老化60天，最终土壤中理论总镉浓度为4.2mg/kg。
40.试验所用修复菌剂为本发明中实施例1-2以及对比例1-4制备的修复菌剂。
41.称取1.5kg负载镉的石油污染土壤于塑料盆(直径17cm
×
高度18cm)中，每盆施加磷酸二氢钾、尿素各0.35g，并添加15g不同实施例及对比例制备的修复菌剂，然后均匀撒播100粒多年生黑麦草种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，种子发芽后每盆保留60棵黑麦草。每个组设置三次重复。黑麦草生长60d后，收获植物，分为地上部分和地下部分，分别测定植物干重及植物和土壤的重金属含量，并检测土壤中石油含量。
42.重金属转移系数＝植物地上部分重金属含量/植物地下部分重金属含量
重金属富集系数＝植物地上部分重金属含量/处理后土壤中重金属含量总镉去除率＝(植物地上部分重金属含量
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地上部分生物量+地下部分重金属含量
×
地下部分生物量)/(处理前土壤中重金属含量
×
土壤质量)*100％表1不同处理的黑麦草生物量和总镉去除率的影响注：各处理组中添加的修复菌剂对应各实施例以及对比例中制备的修复菌剂；实测总镉浓度为修复菌剂处理前实际测得的土壤中初始总镉浓度，下同。
43.结果显示（表1），ck组在种植黑麦草后，能够降解部分石油烃，但去除率较低，只有12.30%，也能够通过植物对镉的吸收转运后取出部分镉，去除率为4.08%。实施例1和实施例2中，伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌am22共同作用，促进了石油烃的降解，而且促进了黑麦草的生长，提高了镉的转移系数，最终的总镉去除率显著提高。而对比例中，替换其中的某一种微生物或者只采用其中一种微生物后，石油烃的去除率及总镉的去除率降低。可见，本发明中两种微生物相互促进提高了石油烃的降解，且促进了黑麦草的生长及总镉的去除率。
44.实验例2负载镉的石油污染土壤的制备同实验例1。
45.试验所用修复菌剂为本发明中实施例1-2以及对比例1-4制备的修复菌剂。
46.与实验例1的不同之处在于，将种植的黑麦草替换为紫花苜蓿，具体如下：称取1.5kg负载镉的石油污染土壤于塑料盆(直径17cm
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高度18cm)中，每盆施加磷酸二氢钾、尿素各0.35g，并添加15g不同实施例及对比例制备的修复菌剂，然后均匀撒播30粒紫花苜蓿种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，种子发芽后每盆保留20棵紫花苜蓿。每个组设置三次重复。紫花苜蓿生长100d后收获植物，分为地上和地下部分，分别测定植物干重及植物和土壤的重金属含量，并检测土壤中石油含量。
47.重金属转移系数＝植物地上部分重金属含量/植物地下部分重金属含量重金属富集系数＝植物地上部分重金属含量/处理后土壤中重金属含量总镉去除率＝(植物地上部分重金属含量
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地上部分生物量+地下部分重金属含量
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地下部分生物量)/(处理前土壤中重金属含量
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土壤质量)*100％表2不同处理的紫花苜蓿生物量和总镉去除率的影响
注：各处理组中添加的修复菌剂对应各实施例以及对比例中制备的修复菌剂。
48.结果如表2，同实验例1类似，ck组中种植紫花苜蓿后石油烃的去除率为10.3%，总镉的去除率为7.3%。而实施例1组和实施例2组中石油烃的去除率以及总镉的去除率显著提高，石油烃降解率提高到50%以上，总镉去除率达到30%左右。对比例1处理组中石油烃的去除率为38.6%，对比例2处理组中替换掉鞘氨醇单胞菌am22后石油烃的去除率下降至35.3%，可见鞘氨醇单胞菌am22有较好的石油烃去除效果。而且，对比例1处理组以及对比例2处理组中分别替换掉鞘氨醇单胞菌am22和伯克霍尔德氏菌am20后，以及对比例3和对比例4处理组中仅采用其中一种微生物后，石油烃的去除率和总镉的去除率也有明显下降，可见鞘氨醇单胞菌am22和伯克霍尔德氏菌am20在石油烃降解及镉的去除过程中有协同促进作用。
49.结果分析：通过实验例的结果可以看出，鞘氨醇单胞菌am22和伯克霍尔德氏菌am20在石油烃降解及镉的去除过程中有协同促进作用，协同提高石油烃的去除率，降低石油烃对植物的毒害作用，促进植物的生长及植物对镉的吸收，进一步提高石油烃及总镉的去除，在重金属及石油复合污染土壤的修复领域有良好的应用前景。

技术特征：
1. 一株鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22，其特征在于，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27034。2. 一种修复菌剂，其特征在于，包括伯克霍尔德氏菌am20和权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22；所述伯克霍尔德氏菌am20于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27032。3.如权利要求2所述的一种修复菌剂，其特征在于，所述修复菌剂还包括草炭土。4. 如权利要求2所述的一种修复菌剂，其特征在于，所述修复菌剂中伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22的活菌数之比为1:（1.1~3.8），总活菌数为（2.5~3.5）
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109cfu/g。5.权利要求2所述的一种修复菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）分别将伯克霍尔德氏菌am20和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22在lb固体培养基上进行活化培养，制得活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22；（2）将步骤（1）制得的活化伯克霍尔德氏菌am20和活化鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22分别接种于种子培养基中进行种子培养，制得伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22种子液；（3）将步骤（2）制得的伯克霍尔德氏菌am20种子液和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22种子液分别接种于发酵培养基中进行发酵培养，制得伯克霍尔德氏菌am20菌液和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22菌液；（4）将步骤（3）制得的伯克霍尔德氏菌am20菌液和鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)am22菌液混合，并加入草炭土，混合搅拌均匀，调节含水率至25~30%，室温放置后，得修复菌剂。6.如权利要求5所述的一种修复菌剂的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：i. 步骤（1）中所述活化培养的条件为：35℃活化培养2天；所述lb固体培养基的组份如下：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；ii. 步骤（2）中所述种子培养的条件为：35℃、150转/分钟摇床培养24h；所述种子培养基的组分如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0；iii. 步骤（3）中所述发酵培养的接种量为发酵培养基体积的5%；iv. 步骤（3）中所述发酵培养的条件为：35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养32h；所述发酵培养基的组分如下：蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，nacl 10 g，蒸馏水1 l，ph 7.0。7.权利要求2所述的一种修复菌剂的应用，其特征在于，应用于修复重金属和/或石油污染土壤。
8.如权利要求7所述的一种修复菌剂的应用，其特征在于，所述重金属为镉。

技术总结
本发明涉及一株鞘氨醇单胞菌和一种修复菌剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明从自然界筛选出的伯克霍尔德氏菌AM20能够活化土壤中的重金属，促进植物对土壤中重金属的吸收；筛选的鞘氨醇单胞菌AM22，能够高效降解石油烃，修复石油烃污染土壤。本发明的修复菌剂中，伯克霍尔德氏菌AM20与鞘氨醇单胞菌AM22协同作用，共同促进植物吸收土壤重金属的同时快速修复石油烃污染，在重金属及石油复合污染的修复中有广阔的应用前景。油复合污染的修复中有广阔的应用前景。


技术研发人员：张强 王新杰 季蕾 于国明 李琪 张晓飞 李天元 邢颖娜 傅晓文 杨普青
受保护的技术使用者：东营金岛环境工程有限公司 胜利油田金岛实业有限责任公司农工贸分公司
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/8