一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法

一种检测长枝木霉的lamp引物组、试剂盒和检测方法
技术领域
1.本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测长枝木霉的lamp引物组、试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.在栽培过程中，由于食用菌菌棒污染导致减产甚至绝产的情况尤为严重，污染的菌棒如若处理不当，会造成循环污染，菇农连年受灾，不仅污染环境、浪费资源，更给菇农造成了巨大经济损失。在接种前导致菌棒污染的真菌病害中长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)尤为严重，因此建立长枝木霉菌快速检测体系，早期对被污染的食用菌菌棒进行快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌爆发、及时处理、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。
3.目前对长枝木霉的检测大多仍沿用传统的组织分离培养及形态学鉴定方法，但是，这种鉴定方法耗时长，一般完成一次检测要一周以上，工作量大，并且分离成功率不高，有着很大的局限性。若所分离的病害样本不新鲜，则更难确诊病原菌，难以满足对菌棒污染诊断的实际需要，这对病原菌的检测和防控十分不利。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通pcr的方法已经成功用于病原菌的检测，但pcr法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时pcr方法需要昂贵仪器pcr仪，检测过程较繁杂。且大多数pcr检测方法都是用病菌的培养物进行，前期需要进行病菌的分离、培养和纯化，无法进行现场检测，实际应用意义不大。
4.环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)因其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代pcr的新的核酸扩增技术，但是目前并没有关于检测长枝木霉的lamp研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种检测长枝木霉的lamp引物组、试剂盒和检测方法，引物特异性强，扩增效率高，可从食用菌菌棒中快速检测长枝木霉。
6.本发明提供了一种检测长枝木霉的lamp引物组，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的外引物上游引物，seq id no.2所示的外引物下游引物，seq idno.3所示的内引物上游引物，seq id no.4所示的内引物下游引物。
7.本发明提供了一种检测长枝木霉的lamp试剂盒，包括上述lamp引物组和lamp反应液。
8.优选的，所述lamp反应液包括10
×
thermopolbuffer、dntps、mgcl2、甜菜碱、bstdna聚合酶和ddh2o。
9.优选的，所述lamp试剂盒中还包括染料。
10.本发明还提供了一种检测长枝木霉的方法，包括以下步骤：以待测样品的基因组dna为模板，与上述lamp试剂盒中的试剂构建lamp反应体系，进行lamp反应，对反应结果进
行可视化鉴定。
11.优选的，所述lamp反应体系中外引物上游引物和外引物下游引物的终浓度均为0.2μm，内引物上游引物和内引物下游引物的终浓度均为1.6μm。
12.优选的，所述lamp反应体系以15μl计，包括：1.5μl10
×
thermopolbuffer、2.1μl1.4mmtpmix、1μl6mmmgso4、各2.4μl1.6μmfip/bipprimers、各0.6μl0.2μmf3/b3、0.6μl320u/mlbstdnapolymeraselargefragment、2.4μl0.8mbetaine(5m)、0.6μl150μmhnb(3.75mm)、1μl模板dna(100ng/μl)和余量的ddh2o。
13.优选的，所述lamp反应包括在60℃反应60min。
14.优选的，所述可视化鉴定包括利用颜色变化进行鉴定，所述lamp反应体系中还包括150μm羟基萘酚蓝；反应结束后，观察到天蓝色判断为阳性，即判定为含长枝木霉。
15.优选的，所述可视化鉴定包括琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带判断为阳性，即判定为含长枝木霉。
16.有益效果：本发明提供了一种检测长枝木霉的lamp引物组，并基于所述lamp引物组构建了lamp检测试剂盒，所述lamp引物组特异性强，有样本中含有长枝木霉才能产生阳性结果，即便是针对相同属真菌中相对保守的基因，也能特异性识别长枝木霉。
17.本发明还提供了利用所述lamp引物组或检测试剂盒进行长枝木霉的检测方法，通过倍比稀释长枝木霉基因组dna进行灵敏度检测，lamp技术可检测到最低长枝木霉真菌dna浓度为64fg/μl，比常规pcr高出100倍，灵敏度高。本发明所述方法可直接检测菌棒的带菌情况，无需经过病菌的分离、培养，也无需对培养的病毒进行dna提取程序；且成本低廉，无需昂贵仪器就能完成反应，适合普通实验室及田间大批量检测；反应结束后，可以肉眼直接观察反应结果，全部过程只需60min，大大缩短了检测时间。
附图说明
18.图1为本发明所述lamp引物组的引物筛选结果图；
19.图2为本发明所述lamp引物组的特异性鉴定结果图；
20.图3为反应温度对lamp反应的影响结果图；
21.图4为反应时间对lamp反应的影响结果图；
22.图5为lamp反应的灵敏度结果图，图中b.lamp反应产物的凝胶电泳；c.常规pcr产物的凝胶电泳；
23.图6为不同菌株的lamp检测结果图，图中1～14分别表示长枝霉菌的不同菌株。
具体实施方式
24.本发明提供了一种检测长枝木霉的lamp引物组，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的外引物上游引物(f3：5
’‑
gtccttgatgtcgtccgtc-3’)，seq id no.2所示的外引物下游引物(b3：5
’‑
acggtatccgagaccttgg-3’)，seq id no.3所示的内引物上游引物(fip：5
’‑
caccacccagcgagtgggtagcgaggccgaaaactgtg-3’)，seq idno.4所示的内引物下游引物(bip：5
’‑
cggttccggtatgggtaccctgaaggtggccatcatgcg-3’)。
25.本发明优选根据食用菌菌棒中长枝木霉nprs31基因的dna序列设计上述特异性lamp引物组，且所述引物组可特异性识别长枝木霉的nprs31基因。本发明利用长枝木霉和
哈茨木霉(trichodermaharzianum)中相对保守的基因tubulin，进行lamp反应，结果显示只有长枝木霉能被扩增出来，证实了所述lamp引物组的特异性。
26.本发明提供了一种检测长枝木霉的lamp试剂盒，包括上述lamp引物组和lamp反应液。
27.本发明所述和lamp反应液优选包括10
×
thermopolbuffer、dntps、mgcl2、甜菜碱、bstdna聚合酶和ddh2o。利用本发明所述lamp试剂盒可进行可视化检测结果，所述可视化检测优选包括直接通过颜色变化进行结果判定，也可以通过琼脂糖凝胶电泳通过条带进行结果判定。当选择颜色变化进行结果判定时，所述lamp试剂盒中优选还包括染料，所述染料优选包括羟基萘酚蓝(hnb)。本发明所述试剂盒中，除lamp引物组外的其他成分，可作为预混液，也可单独存在，使用时直接配制lamp体系即可。
28.本发明还提供了一种检测长枝木霉的方法，包括以下步骤：以待测样品的基因组dna为模板，与上述lamp试剂盒中的试剂构建lamp反应体系，进行lamp反应，对反应结果进行可视化鉴定。
29.本发明所述待测样本优选包括食用菌菌棒，且在进行所述检测时，将菌株在pda上纯培养7d后，利用真菌dna快速抽提试剂盒(生物生工，上海)按照说明书进行dna提取。
30.本发明所述lamp反应体系与可视化鉴定的方法相关，当采用颜色变化进行结果判定时，其lamp反应体系中需要添加hnb，且hnb的终浓度优选为150μm；当采用琼脂糖凝胶电泳的方法判定时则不需要添加hnb。除hnb外，所述lamp的反应体系相同，均为15μm体系，优选包括：1.5μl10
×
thermopol buffer、2.1μl1.4mmtpmix、1μl6mmmgso4、各2.4μl1.6μmfip/bip primers、各0.6μl0.2μmf3/b3、0.6μl320u/mlbstdnapolymeraselarge fragment、2.4μl0.8mbetaine(5m)、0.6μl150μmhnb(3.75mm)、1μl模板dna(100ng/μl)和余量的ddh2o。
31.本发明在配制完成上述lamp反应体系后进行lamp反应，所述lamp反应的温度优选为60℃，反应时间优选为60min。
32.在进行结果判定时，如采用颜色变化评价时，当反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，即判定为待测食用菌菌棒中含长枝木霉；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即判定为待测食用菌菌棒中无长枝木霉、或待测食用菌菌棒中所含长枝木霉病菌含量未达检测的最低检测浓度0.01ng/μl；当采用琼脂糖凝胶电泳的方式进行评价时，取5～10μl扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即判定为待测食用菌菌棒中含长枝木霉；如果无扩增条带则判断为阴性，即判定为待测食用菌菌棒中无长枝木霉，或待测食用菌菌棒中所含长枝木霉未达最低检测浓度10fg/μl。
33.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种检测长枝木霉的lamp引物组、试剂盒和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.1、引物的设计：
36.首先根据长枝木霉的nprs31基因序列，使用primerexplorer v5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体gc含量以及tm值等综合因素进一步选择引物。最后为食用
菌菌棒中长枝木霉选择了4条引物，包括2条外引物(f3和b3)和2条内引物(fip和bip)，核苷酸序列如seq id no.1～4所示。
37.2、引物的特异性检测：
38.从食用菌菌棒中分离污染菌，使用its通用引物对分离到的污染菌进行鉴定，主要有长枝木霉trichoderma longibrachiatum，tubulin基因是一个在相同属真菌中相对保守的基因，通过在ncbi搜索已公布trichoderma属真菌的tubulin dna序列(gca_026259275.1)，设计了ttubf(seq id no.5：5
’‑
gttctcgtcgatctcgagc-3’)和ttubr(seq id no.6：5
’‑
aacagcgcggaaggagtgc-3’)，利用这对引物扩增了菌株长枝木霉部分tubulin基因片段，并进行比对。比对结果如图1所示，该片段在两种菌中相对保守，但有部分位置存在核苷酸多态性差异。
39.为确定引物是否具有种特异性，以长枝木霉的gdna为模板，进行lamp反应。
40.表1 lamp反应体系
[0041][0042][0043]
反应条件为63℃70min、85℃10min终止反应。
[0044]
反应结束后，分别用琼脂糖凝胶电泳法和hnb染料显色法判定引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳法：取5μllamp扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，eb染色，在凝胶成像系统中观察，出现特征性梯状条带为阳性，未出现条带为阴性；hnb染料显色法：肉眼观察颜色lamp反应混合液的颜色变化，产生天蓝色为阳性反应，蓝紫色为阴性反应。
[0045]
结果如图1和图2所示，最终确定了使用编号为id27的引物对来进行t.longibrachiatum菌株的鉴定，使用编号为id29的引物来进行t.harzianum菌株的鉴定。
[0046]
3、反应条件优化
[0047]
使用引物对id27(引物序列如seq id no.1～4所示)，以t.longibrachiatum菌株
的gdna为模板(100ng/μl)，进行反应温度的确定，结合颜色反应和凝胶电泳结果，id27的最佳反应温度区间为57.6-66.4℃(图3)。
[0048]
4、最优反应时间确定
[0049]
使用引物对id27，以t.longibrachiatum菌株的gdna为模板(100ng/μl)，进行最佳反应时间的确定，反应条件为60℃。结合颜色反应和凝胶电泳结果，id27的最佳反应时间为60min，45分钟时虽然凝胶电泳条带，但是并未引起hnb颜色变化(由紫罗兰色变为淡蓝色为阳性反应，图4)。后续检测中将以60℃、60min为反应条件。
[0050]
5、lamp扩增和常规pcr扩增灵敏性比较：
[0051]
以id27引物对作为反应引物，将t.longibrachiatum菌株的gdna稀释为不同浓度，并以60℃、60min为反应条件进行检测，对反应结果进行肉眼观察和琼脂糖凝胶电泳分离，同时，以上述不同浓度gdna为模板，进行常规pcr扩增检测。结果如图5所示，lamp反应可以在60℃恒温条件下，在1小时内检测到gdna浓度为10pg的t.longibrachiatum，而常规pcr反应最小只能检测到1ng，因此，lamp反应能够更加快速、省时的完成菌棒污染源的检测。
[0052]
6、不同菌株lamp检测
[0053]
以分离到的不同菌棒污染源菌株的gdna为模板(100ng/μl)，以引物对id27为反应引物，同时以ddh2o为阴性对照，反应条件为60℃、60min，检测结果如图6，其中菌株1、2、4、13和14为t.longibrachiatum。
[0054]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种检测长枝木霉的lamp引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的外引物上游引物，seq id no.2所示的外引物下游引物，seq id no.3所示的内引物上游引物，seq id no.4所示的内引物下游引物。2.一种检测长枝木霉的lamp试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述lamp引物组和lamp反应液。3.根据权利要求2所述lamp试剂盒，其特征在于，所述lamp反应液包括10
×
thermopolbuffer、dntps、mgcl2、甜菜碱、bstdna聚合酶和ddh2o。4.根据权利要求2或3所述lamp试剂盒，其特征在于，所述lamp试剂盒中还包括染料。5.一种检测长枝木霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的基因组dna为模板，与权利要求2～4任一项所述lamp试剂盒中的试剂构建lamp反应体系，进行lamp反应，对反应结果进行可视化鉴定。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述lamp反应体系中外引物上游引物和外引物下游引物的终浓度均为0.2μm，内引物上游引物和内引物下游引物的终浓度均为1.6μm。7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述lamp反应体系以15μl计，包括：1.5μl10
×
thermopolbuffer、2.1μl1.4mmtpmix、1μl6mm mgso4、各2.4μl1.6μmfip/bipprimers、各0.6μl0.2μmf3/b3、0.6μl320u/mlbstdnapolymeraselargefragment、2.4μl0.8mbetaine、0.6μl150μmhnb、1μl模板dna和余量的ddh2o。8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述lamp反应包括在60℃反应60min。9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述可视化鉴定包括利用颜色变化进行鉴定，所述lamp反应体系中还包括150μm羟基萘酚蓝；反应结束后，观察到天蓝色判断为阳性，即判定为含长枝木霉。10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述可视化鉴定包括琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带判断为阳性，即判定为含长枝木霉。

技术总结
本发明公开了一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法，属于分子检测技术领域。本发明提供了一种检测长枝木霉的LAMP引物组，并基于所述LAMP引物组构建了LAMP检测试剂盒，所述LAMP引物组特异性强。本发明还提供了利用所述LAMP引物组或检测试剂盒进行长枝木霉的检测方法，灵敏度高，检测限高达64fg/μL。本发明所述方法可直接检测菌棒的带菌情况，操作简单、成本低廉，适合普通实验室及田间大批量检测。本发明建立了长枝木霉的快速、简便、特异性强、灵敏度高而且可用肉眼观察的监测技术体系，可在农业生产中推广应用。可在农业生产中推广应用。可在农业生产中推广应用。


技术研发人员：付春伶 朱姝蕊 张国宾 刘沁雨
受保护的技术使用者：丽水职业技术学院
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/10/8