一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽的制备方法

1.本发明涉及一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽的制备方法，属于生物医药领域。


背景技术：

2.细胞坏死早期被认为是受极端物理、化学或其他严重病理性因素诱发的细胞死亡，然而近年来研究揭示该过程受蛋白质信号通路调控，称之为坏死性凋亡。普遍认为，细胞坏死凋亡主要由受体作用蛋白激酶1和3(ripk1和ripk3)与混合谱系激酶结构域样蛋白(mlkl)通路调控，当ripk1与ripk3发生异质性聚集、形成坏死小体，促使ripk3及mlkl的磷酸化并激活肿瘤坏死因子(tnf)介导的细胞膜破裂及细胞坏死凋亡。针对该机制已有报道一些具有激活肿瘤细胞坏死通路的材料，比如通过抑制拓扑异构酶活性或者活性氧发生器物质，破坏dna从而促进ripk1与ripk3表达，诱导细胞坏死。但是，这些材料在肿瘤治疗中缺乏针对细胞坏死机制的选择调控特征，导致通过肿瘤细胞坏死机制的治疗效果有限，且伴随有一定的生物安全性问题。
3.在细胞程序性坏死凋亡过程中，诱导受体作用蛋白激酶ripk1-ripk3的异质性聚集是细胞坏死信号通路激活的关键步骤。文献研究表明，ripk1与ripk3聚集由受体作用蛋白同源作用结构域偶合驱动，该同源结构域往往含有iqig或vqvg疏水片段，有利于形成β-折叠氢键作用而促使ripk1与ripk3形成交替组装体。


技术实现要素：

4.本发明目的是解决现有材料无法针对细胞坏死机制选择调控，从而限制通过肿瘤细胞坏死机制的治疗效果有限的问题，提供一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽及其制备方法。
5.本发明的技术方案
6.一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，所述仿生肽为dri-pr1，其结构式如下所示：
[0007][0008]
所述仿生肽dri-pr1制备所用氨基酸均为d-型氨基酸，制备步骤如下：
[0009]
1)称量二氯树脂置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂，使用fmoc-d-thr(tbu)-oh氨基酸连接到树脂上；加入无水甲醇对树脂上未反应的-cl进行封闭；
[0010]
2)再通过常规的fmoc固相合成法连接之后的氨基酸，待连接完毕后，脱出最后一个氨基酸的保护基团，使用切割剂将其从树脂上裂解下来。
[0011]
本发明得到的仿生肽dri-pr1的表征，包括临界聚集浓度、圆二色光谱、原子力显微镜、透射电子显微镜、tht动力学和离子淌度质谱的表征，详见具体实施方式。
[0012]
在一些实施方式中，本发明的仿生肽可以与其他活性成分组合使用，例如化疗药物/光敏剂等，只要不产生其他不利的反应即可。
[0013]
本发明的优点和有益效果：
[0014]
(1)本发明所形成的多肽具有生物兼容性、低免疫原性等优点。(2)本发明所有的反应条件非常温和，制备方法简单，操作简便。(3)本发明得到的多肽能够实现与细胞中ripk3结合促进ripk3的聚集和磷酸化，从而开启细胞坏死性凋亡通路。(4)本发明制备的dri-pr1具有促进ripk3聚集和肿瘤细胞的毒性效果，且不会造成炎症反应，从而为未来创建用于促进坏死性凋亡的超分子治疗诊断剂提供了一种独特的策略。
[0015]
下面将通过实例描述，阐述本发明的优点和效果。
附图说明
[0016]
图1.本发明仿生肽dri-pr1及表征涉及分子pr3,pr1,d-pr1,tamra-pr1,tamra-d-pr1和tamra-dri-pr1的化学结构式。
[0017]
图2.(a和b)肽pr3、pr1、d-pr1和dri-pr1的cd(a)和ftir(b)光谱。(c)分别由肽pr3、pr1、d-pr1和dri-pr1组成的组装体的afm图像。比例尺:500nm。(d)在pbs中37℃孵育下，tht在单独肽pr3、pr1、d-pr1和dri-pr1存在下，在485nm处荧光强度的变化曲线。
[0018]
图3.(a)pr1、d-pr1和dri-pr1在37℃pbs中孵育的肽混合物含量为25％或50％时，tht在485nm处荧光强度的变化曲线。(b)在不同多肽混合物存在下达到tht最大荧光强度一半的次数(t
1/2
)。(c)肽pr3与pr1、d-pr1或dri-pr1混合物的cd谱图。(d)pr1、d-pr1或dri-pr1的单个肽或肽混合物含量为25％时，tht的最大荧光强度。(e和f)由肽混合物pr3+pr1、pr3+d-pr1和pr3+dri-pr1(25％为ripk1仿生肽)组成的共组装体的afm(e)和tem(f)图像。比例尺:300nm(e)和200nm(f)。
[0019]
图4.(a)pr3自组装及其与pr1、d-pr1和dri-pr1共组装的代表性im-ms热图。(b)pr3和dri-pr1共组装物的代表性质谱。(c)由单个pr3或与其他肽共组装的pr3形成的不同低聚物的丰度比较。(d)同质低聚物(b3/b4
…
)和异质低聚物(ab2/a2b2
…
)在三个共聚基团上的分布。
[0020]
图5.(a)mst检测肽pr1、d-pr1或dri-pr1与ripk3蛋白的结合亲和力。(b)肽dri-pr1与蛋白ripk3片段分子对接示意图。虚线表示蛋白质残基和肽残基之间的氢键。
[0021]
图6.多肽pr1、d-pr1或dri-pr1处理不同时间点ht-29细胞的clsm图像。
[0022]
图7.(a)不同抑制剂处理后ht-29细胞经tamra(红色信号)标记的肽pr1、d-pr1或dri-pr1孵育后的clsm图像。(b)多肽和内吞抑制剂处理的ht-29细胞内与肽信号相关的定量荧光。(c)不同浓度肽pr1、d-pr1和dri-pr1处理ht-29细胞的细胞活力及相应的ic
50
值。
[0023]
图8.(a和b)pbs、pr1、d-pr1和dri-pr1处理ht-29细胞24小时后ripk3、pripk3、mlkl和pmlkl表达的wb测定(a)和相应的定量(b)。(c)pr1、d-pr1和dri-pr1处理ht-29细胞的ldh释放谱与肽浓度的关系。(d)pbs、pr1、d-pr1和dri-pr1孵育24小时ht-29细胞炎性细
胞因子的分泌情况。(e)ripk1-ripk3复合物诱导的自然坏死坏死和ripk1-仿生肽诱导的坏死坏死的图示，其中dri-pr1-ripk3复合物作为人工坏死体诱导ripk3聚集磷酸化，从而激活坏死信号通路，促进细胞死亡。
[0024]
图9.激酶仿生肽pr3和dri-pr1的设计示意图，以及dri-pr1在促进ripk3聚集激活坏死坏死信号通路和细胞坏死中的作用。上:ripk1-ripk3复合物片段的堆叠模型，激酶-仿生肽pr3和dri-pr1及其共组装体的化学结构。下:多肽dri-pr1的内化使其在细胞内与ripk3形成复合物，激活坏死信号通路，在此过程中ripk3被磷酸化，从而促进mlkl磷酸化并转运至质膜，诱导膜通透和细胞死亡。
具体实施方式
[0025]
实施例1：
[0026]
一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽dri-pr1的制备，主要操作步骤如下：
[0027]
1)称量二氯树脂500mg置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂30min，抽滤弃除溶剂，使用fmoc-d-thr(tbu)-oh氨基酸的dmf溶液加入反应器震荡3h，反应结束后，加入无水甲醇对树脂上未反应的-cl进行封闭15min；待反应结束后，使用二氯甲烷和dmf交替洗涤树脂3次；
[0028]
2)再通过常规的fmoc固相合成法连接之后的氨基酸，待连接完毕后，脱出最后一个氨基酸的保护基团，使用切割剂将其从树脂上裂解下来。
[0029]
最终得到的仿生肽dri-pr1结构式如下所示
[0030][0031]
实施例2：
[0032]
一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽dri-pr1的自组装和共组装形貌表征：
[0033]
将仿生肽dri-pr1的粉末溶于超纯水使用氨水调节ph为7.2-7.4，制备浓度为1mm的仿生肽母液，退火并静置48小时使其组装，使用afm、tem、圆二色谱、傅里叶红外光谱仪、tht荧光动力学和离子淌度质谱对其组装形貌、构象和组装动力学进行表征。
[0034]
测定结果：如图2、3所示，圆二色谱和红外谱图结果表明dri-pr1在溶液中均形成β-sheet的二级结构，afm和tem显示出纤维束的形貌；tht荧光动力学曲线显示出dri-pr1比对照组具有更短的组装时间和更高的荧光强度，表明dri-pr1具有更好的自组装以及和pr3共组装的能力。如图4所示，与其他对照组相比，dri-pr1加入pr3溶液后形成更多的寡聚物。
[0035]
实施例3：
[0036]
一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽dri-pr1对ripk3蛋白的结合亲和力研究：
[0037]
使用微量热按照制造商提供的标准说明对ripk3进行标记，将标记后的ripk3溶液使用含有0.05％tween 20的磷酸盐缓冲液稀释至160nm浓度；在其中分别加入dri-pr1和其
他对照组pr1和d-pr1，其中多肽的浓度范围为1.525nm至100mm；室温孵育多肽和蛋白混合液30分钟，通过monolith nt.115仪器测试得到多肽和ripk3的kd值。
[0038]
测定结果：与对照组pr1和d-pr1相比，dri-pr1和ripk3蛋白的结合常数值最低，表明dri-pr1和ripk3具有更好的结合能力。
[0039]
实施例4：
[0040]
一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽dri-pr1对人结直肠癌细胞ht-29的细胞摄取和特异性治疗效果：
[0041]
1、细胞摄取检测：ht-29人结直肠癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞以每孔1
×
105个细胞的密度接种于12孔板中，并在37℃下培养24小时；然后，向所述细胞中添加含有2％tamra标记的pr1，d-pr1和dri-pr1，其中tamra部分的剂量为1μm；孵育2、4小时后，用pbs洗涤细胞，使用共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。
[0042]
测定结果：如图6所示，dri-pr1可以被细胞摄取，摄取量随时间延长而增加。
[0043]
2、细胞毒性检测：将所述ht-29人结直肠癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞以每孔5000个的密度分别接种于含有10％fbs和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基和1640培养基的96孔板中；孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的仿生肽dri-pr1及其他对照组(pr1，d-pr1)再共孵育48小时；其中所述不同浓度分别为：0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400μm；弃除培养基，使用pbs洗每孔三次，加入含有cck8的培养基孵育2小时；最后，在酶标仪上通过记录450nm处的吸收强度测量所述细胞的活力。
[0044]
测定结果：如图7所示，dri-pr1与其他组相比，对ht-29细胞具有更强的细胞毒性，ic
50
值约为43.8μm，远低于其他对照组；而对huvec细胞没有明显的细胞毒性，上述结果说明了dri-pr1对ht-29癌细胞的特异性治疗效果，对正常细胞没有明显毒副作用。
[0045]
实施例5：
[0046]
一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡仿生肽dri-pr1激活肿瘤细胞坏死性凋亡通路，并不会引起炎症反应：
[0047]
将细胞分为四组，分别为pbs，pr1，d-pr1和dri-pr1组。
[0048]
1、蛋白印迹检测：将ht-29细胞以2
×
105的密度接种于六孔板中在dmem/f12培养基中培养过夜，然后，使用50μm的dri-pr1及其他对照组(pbs，pr1，d-pr1)持续培养24小时；弃除培养基，使用pbs洗每孔之后，将细胞用ripa裂解液处理并收集，通过bradford蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度后，将蛋白质与上样缓冲液在100℃下孵育10分钟；随后，将每个样品中20μg的蛋白上样到sds-page凝胶并电泳转移到pvdf膜上，将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在相应的特异性一抗(ripk3，pripk3，mlkl，pmlkl)中在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，在tanon-5200multi仪器下用ecl化学发光检测对蛋白条带进行成像。
[0049]
测定结果：如图8所示，与对照组相比dri-pr1孵育过的癌细胞ripk3表达量减少，pripk3和pmlkl表达量增加，mlkl表达量无明显变化，表明该仿生肽可以有效激活肿瘤细胞坏死性凋亡的通路。
[0050]
2、促炎因子检测：将ht-29细胞以2
×
105的密度接种于六孔板中在dmem/f12培养基中培养过夜，然后，使用50μm的dri-pr1及其他对照组(pbs，pr1，d-pr1)持续培养24小时；收集上清液待测；然后使用pbs洗每孔之后，将细胞用ripa裂解液处理并收集，按照制造商
提供的标准说明，通过酶联免疫吸附测定分析上清液，对促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-1β的分泌定量化，通过酶标仪监测450nm处的吸收强度记录数据。
[0051]
测定结果：如图8所示，dri-pr1孵育过的癌细胞表达的炎症因子与其他组相比没有明显升高，说明了该仿生肽治疗的同时不会造成炎症反应。
[0052]
3、ldh乳酸脱氢酶检测：将ht-29细胞以每孔5000个的密度接种于含有10％fbs和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基的96孔板中；孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的仿生肽dri-pr1及其他对照组(pr1，d-pr1)再共孵育24小时；其中所述不同浓度分别为：6.25、12.5、25、50、100、200μm；收集上清液，按照标准说明进行操作，在酶标仪上通过记录490nm处的吸收强度测量所述乳酸脱氢酶释放情况。
[0053]
测试结果：如图8所示，随着dri-pr1浓度升高，ldh释放率与对照组相比有明显提高，表明了经过dri-pr1治疗后的癌细胞可以开启坏死性凋亡通路，坏死体转移到细胞膜上造成细胞膜的渗透增加，从而导致了乳酸脱氢酶的释放。

技术特征：
1.一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，所述仿生肽为dri-pr1，其结构式如下所示：2.权利要求1所述仿生肽的制备方法，其特征在于，所述仿生肽dri-pr1制备所用氨基酸均为d-型氨基酸，制备步骤如下：1)称量二氯树脂置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂，使用fmoc-d-thr(tbu)-oh氨基酸连接到树脂上；加入无水甲醇对树脂上未反应的-cl进行封闭；2)再通过常规的fmoc固相合成法按照结构式连接之后的氨基酸，待连接完毕后，脱出最后一个氨基酸的保护基团，使用切割剂将仿生肽dri-pr1从树脂上裂解下来。3.根据权利要求1所述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的仿生肽dri-pr1的表征，包括临界聚集浓度、圆二色光谱、原子力显微镜、透射电子显微镜、tht动力学和离子淌度质谱的表征，各种表征方法如下：1)圆二色(cd)光谱：cd光谱由biologic mos-500光谱仪在25℃下使用2mm石英比色皿记录；所有多肽的cd样品通过将1mm多肽母液稀释至100μm制备，cd光谱扫描均以1.0nm的波长间隔和190至260nm的波长范围进行记录；2)原子力显微镜：afm图片是由cspm 5500仪器在轻敲模式下拍摄的；所有多肽的afm样品是通过将多肽母液稀释至1mm的浓度制备的；将10μl多肽溶液滴至新切割的云母片表面放置5分钟，然后用滤纸去除剩余的溶液并在大气条件下干燥后用于样品测试；3)透射电子显微镜：tem图像由hitachi ht7700 exalens显微镜在200kv的加速电压下记录；所有多肽的tem样品是通过将母液稀释至1mm的浓度制备的；将8μl多肽溶液滴在碳涂层铜网上放置5分钟并用滤纸除去剩余溶液之后，将铜网放置于干燥器中干燥以备后期测试；4)tht动力学：tht动力学由agilent cary eclipse荧光分光光度计在37℃下使用微量石英比色皿记录；所有多肽样品通过2mm的多肽dmso溶液稀释到100μm制备，激发波长为440nm；5)离子淌度质谱：离子淌度质谱由waters synapt g2si记录；所有多肽样品使用c18纯化柱除盐处理并冻干，使用超纯水溶解并调节ph为7.4；所有多肽样品的总浓度为100μm。4.根据权利要求1所述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的仿生肽dri-pr1的体外细胞毒性的表征，通过使用标准cck-8测试确定多肽对ht-29人结直肠癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞的细胞毒性，方法如下：1)将所述ht-29人结直肠癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞以每孔5000个的密度
分别接种于含有10％fbs和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基和1640培养基的96孔板中；2)孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的仿生肽再共孵育48小时；其中所述不同浓度分别为：0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400μm；3)弃除培养基，使用pbs洗每孔三次，加入含有cck8的培养基孵育2小时；4)最后，在酶标仪上通过记录450nm处的吸收强度测量所述细胞的活力。5.根据权利要求1所述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的仿生肽dri-pr1的细胞摄取的表征，通过共聚焦显微镜确定细胞摄取情况，具体方法如下：ht-29人结直肠癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞以每孔1
×
105个细胞的密度接种于12孔板中，并在37℃下培养24小时；然后，向所述细胞中添加含有2％tamra标记的dri-pr1和对照分子pr1及d-pr1，其中tamra部分的剂量为1μm；孵育2、4小时后，用pbs洗涤细胞，使用共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。6.根据权利要求1所述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的多仿生肽dri-pr1调控细胞内蛋白表达的表征，通过免疫蛋白印迹的方法验证上述多肽调控细胞内蛋白表达的情况，方法如下：对ht-29人结直肠癌细胞暴露于仿生肽dri-pr1后细胞中ripk3，pripk3，mlkl和pmlkl的表达进行了蛋白质印迹研究；细胞以2
×
105的密度接种于六孔板中在dmem/f12培养基中培养过夜，然后，使用50μm的多肽持续培养24小时，之后，将细胞用ripa裂解液处理并收集，通过bradford蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度后，将蛋白质与上样缓冲液在100℃下孵育10分钟，随后，将每个样品中20μg的蛋白质上样到sds-page凝胶并电泳转移到pvdf膜上，将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在相应的特异性一抗中在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，在tanon-5200multi仪器下用ecl化学发光检测对蛋白条带进行成像。7.根据权利要求1述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的仿生肽dri-pr1调节细胞内促炎因子的表征，通过elisa检测验证多肽调节细胞内促炎因子的情况，方法如下：ht-29细胞接种于6孔板中，细胞密度为2
×
105个细胞/孔，37℃培养24小时，使用浓度为50μm dri-pr1和对照组pr1，d-pr1分别处理24小时，收集上清液；然后ht-29细胞用pbs洗涤3次后，用ripalysis buffer处理，12000r/min离心15min，收集上清液，按照制造商提供的标准说明，通过酶联免疫吸附测定分析上清液，对促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-1β的分泌定量化，通过酶标仪监测450nm处的吸收强度记录数据。8.根据权利要求1所述的促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽，其特征在于，得到的仿生肽dri-pr1的蛋白结合亲和力的测定，通过微量热泳动仪检测多肽和ripk3的结合力，方法如下：按照制造商提供的标准说明对ripk3进行标记，将标记后的ripk3溶液使用含有0.05％tween 20的磷酸盐缓冲液稀释至160nm浓度；在其中分别加入dri-pr1和其他对照组pr1和d-pr1，其中多肽的浓度范围为1.525nm至100mm；室温孵育多肽和蛋白混合液30分钟，通过monolithnt.115仪器测试得到多肽和ripk3的kd值。

技术总结
本发明公开了一种促进肿瘤细胞坏死性凋亡的仿生肽(DRI-PR1)，并研究了其对肿瘤细胞治疗效果。本发明通过截取天然RIPK1和RIPK3蛋白片段，设计合成了基于RIPK1的坏死性凋亡仿生肽DRI-PR1，DRI-PR1在体外和RIPK3模拟肽具有强相互作用，并且可以共组装形成纤维束的结构，细胞水平实验证实了DRI-DR1可以和RIPK3蛋白相互作用从而选择性激活坏死信号通路，对结直肠癌细胞产生特异性的细胞毒性，并且细胞炎症因子的分泌没有明显增加。症因子的分泌没有明显增加。症因子的分泌没有明显增加。


技术研发人员：余志林 郭若宸
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/11