一种可提升茶叶品质的芽孢杆菌May31及其筛选方法与应用与流程

一种可提升茶叶品质的芽孢杆菌may31及其筛选方法与应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种可提升茶叶品质的芽孢杆菌may31及其筛选方法与应用。


背景技术：

2.植物地上部分(包括叶、茎、花、果等)作为一个独立的微环境，其表面和内部通常栖息着大量的各种类型的微生物。这种植物的地上部分称为叶际(phyllosphere)，这些在叶际上生存并可以定居和增殖的微生物群体称为叶际微生物(epiphytes)。据估计，植物的叶面面积约为6.4
×
108km2，构成了庞大的微生物栖息环境。植物叶际生活着种类众多、数量丰富的微生物，这些微生物包括细菌、丝状真菌、酵母、病毒、藻类，偶尔还有原生动物和线虫等。在众多微生物中，细菌数量最多，每平方厘米叶面积的细菌个数约为10
6-107个。叶际微生物与植物互作关系包括有益、中性或者有害，绝大部分微生物对植物有益。科学家普遍认为植物微生物组(叶际微生物和根际微生物)是决定植物健康和产量的关键因素。
3.广泛的根际微生物被证明对其寄主植物的健康、适应性和生产性有着核心作用。叶际微生物群体通常比根际或土壤中的种类要少，但叶际微生物跟土壤微生物一样也可以在养分循环中发挥关键作用。植物叶际微生物对于植物主要具有5个方面的生态功能：叶际微生物固氮或产生激素，促进植物营养吸收和生长发育；叶际微生物提高植物对生物或非生物胁迫的抗性；叶际微生物诱导植物产生抗病性；叶际微生物抑制植物病原微生物，保障植物健康；叶际微生物与其他营养级生物互作。因此，叶际微生物、叶际环境和宿主植物三者所构成的微生态平衡对植物的健康生长具有重要意义。
4.对于茶树，叶际微生物可以向宿主提供某些代谢物或促进某些代谢通路的发生，从而有助于提升茶叶的性能、茶树的生长和抗逆性。正确的叶际微生物能使茶树产生更高水平的天然二次代谢物。因此在茶树生长阶段，通过在茶树叶片上增加茶叶可培养的有益叶际微生物的数量及活性，有助于提高茶叶品质。
5.目前，常规菌剂多应用于种土壤中，与传统的土壤肥料相比，喷施于叶面具有直接、迅速和高效的特点，可以快速为植物提供所需营养，可促进提升抗病能力，抑制病原微生物的生长和侵染，促进植物的次级代谢物的产生和植株健康生长。菌剂喷施于土壤对整个植株的发育和生长具有全面的促进作用，然而其效率相较喷施于叶面较慢。目前，通过直接对叶片喷施菌剂来提升茶叶品质这方面的研究较少，发明相关产品应用于茶树具有很广阔的应用前景。
6.因此，从茶叶叶片中筛选内生菌并将其制备为菌剂喷施到茶叶叶片上，发明一种提升茶叶品质的芽孢杆菌的筛选方法与应用，从而提升茶叶品质，显然具有实际的现实意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31及其筛选方法。
8.本发明的另一个目的是提供芽孢杆菌may31的应用，以芽孢杆菌may31为主制备的菌剂于茶叶萌芽期喷施于茶叶叶面，可促进茶叶游离氨基酸的含量升高从而提升茶叶品质。
9.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
10.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31所述芽孢杆菌may31由茶叶叶片内筛选获得，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述芽孢杆菌may31的保藏编号为：cgmccno.27501。
11.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的筛选方法，用于筛选芽孢杆菌may31，所述筛选方法包括如下步骤：
12.采样与富集：取茶叶1～5g，70％体积分数的酒精震荡浸泡60s，0.5％质量分数的次氯酸钠震荡8min，70％体积分数的酒精再次震荡浸泡60s，无菌水漂洗6次以上；优选地，所述茶叶为夏季茶树嫩叶，以获取生长旺盛期的茶叶的叶际微生物。
13.菌种分离纯化：将上述处理后的茶叶组织置于研钵中，加入ddh2o后研磨，于10ml离心管中静置10～20min，取上清液分级稀释1000倍；取100微升稀释的匀浆物涂布平板于lb固体培养基，并连续将分离的单菌落转接于lb固体平板上分离、纯化，培养，最后得到目标菌株。
14.菌株鉴定：对所述菌株进行pcr扩增测序，将所得序列上传至ncbi后用blast进行检索比对，选出与该序列相似性较高的rdna序列，用mega7.0构建系统发育树，确定所述目标菌株不是病原菌。
15.进一步地，所述pcr扩增体系包括：dna模板，forward primer，reverse primer，pcr premix，bsa，ddh2o。优选地，所述pcr扩增体系为：dna模板2ul，forward primer 1ul，reverse primer 1ul，pcr premix 25ul，bsa 6ul，ddh2o补足至50ul。
16.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的应用，含芽孢杆菌may31的菌液可与含贝莱斯芽孢杆菌的菌液和含鞘单胞菌的菌液混合后制备复合菌剂，将所述复合菌剂喷施于茶叶叶面，以促进茶叶游离氨基酸的含量升高从而提升茶叶品质。
17.进一步地，在所述混合菌剂中，所述芽孢杆菌may31、所述贝莱斯芽孢杆菌与所述鞘单胞菌的菌体浓度比为2.0～4.0:0.8～1.2:0.8～1.2。优选地，在所述混合菌剂中，所述芽孢杆菌may31、所述贝莱斯芽孢杆菌与所述鞘单胞菌的菌体浓度比为3:1:1。
18.进一步地，所述复合菌剂的终浓度为1
×
107～1
×
109cfu/ml；优选地，所述复合菌剂的终浓度为1
×
108cfu/ml。
19.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
20.本发明通过从茶叶上分离、筛选，获得了茶叶内生菌芽孢杆菌may31，并将其应用于制备提升茶叶品质的复合菌剂；以芽孢杆菌may31为主制备的复合菌剂在茶叶萌芽期喷施于茶叶叶面，可促进茶叶游离氨基酸的含量显著升高，从而提升茶叶品质；本发明采用的制备方法步骤较少，菌剂配方简单，对茶叶游离氨基酸含量的提升效果明显，具有低成本、高效率的技术优势和广泛的应用前景。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的一些附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1是本发明芽孢杆菌may31菌落形态图；
23.图2是本发明芽孢杆菌may31细胞形态图；
24.图3是本发明芽孢杆菌may31系统发育树。
具体实施方式
25.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
27.实施例一菌种筛选分离：
28.采样与富集：
29.样品采集于夏季的碧螺春嫩叶。取夏季茶叶嫩叶3g，70％酒精震荡浸泡60s，0.5％质量分数次氯酸钠震荡8min，70％酒精再次震荡浸泡60s，无菌水漂洗6次以上。
30.菌种分离：
31.将3g叶组织置于研钵中等比例加入ddh2o后研磨，于10ml离心管中静置15min，取上清液分级稀释至10-1
、10-2
和10-3
。取100ul稀释后的匀浆物涂布平板于lb固体培养基，30℃培养2d。
32.菌种纯化：
33.从培养好的lb平板上挑选培养出的单菌落，连续数次转接到新的lb平板上进行划线分离，于30℃生化培养箱培养2-3d。其间紧密观察菌落形态以及用显微镜观察细胞形态是否一致，保证最后一次分离得到的是纯菌菌落，最后得到菌株芽孢杆菌may31，转入斜面培养基加以保藏。
34.菌株的鉴定：
35.菌落形态：用接种环挑取少量上述保藏菌种，lb平板上进行划线，于30℃生化培养箱培养2-3d。
36.如图1所示，菌落灰白色偏米黄，边缘粗糙不规则，表面光滑，有很多隆起、皱褶，中间凹陷，粘稠、易挑起。
37.如图2所示，菌体形态：革兰氏阳性菌，染色后为紫色，显微镜下呈细菌形态为杆状。
38.分子鉴定：
39.模板准备：用无菌枪头蘸取单菌落于装有20ul无菌tritonx-100的200ul离心管中，100℃高温裂解后作为dna模板。
40.扩增体系为(50ul)：dna模板2ul，forward primer 1ul，reverse primer 1ul，pcrpremix25ul，bsa6ul，ddh2o补足至50ul。
41.反应程序为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火53℃40s，延伸72℃90s，35个循
环，72℃10min，4℃保存。
42.将所得序列上传至ncbi后用blast进行检索比对，选出与该序列相似性较高的rdna序列，用mega7.0构建系统发育树，如图3所示，结果显示菌株may31与芽孢杆菌(bacillussp.)同源性最高，同属一支。
43.实施例二菌剂制备与应用：
44.菌剂制备：用接种环挑取少量斜面保藏的菌株may31于装有5mllb液体培养基的试管中，30℃、180rpm培养18h，获得种子液；将5ml种子液接种于500mllb液体培养基中，置于摇床中30℃、180rpm扩大培养24h，获得发酵液。贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)和鞘单胞菌(sphingomonas sanguinis)由同种方法制备获得发酵液。通过紫外分光光度计对各发酵液进行od600测定，并用ddh2o将各发酵液稀释到同一浓度，根据体积比3：1：1进行混合，复合菌剂终浓度为1
×
108cfu/ml。将上述配置的菌剂，应用于春季萌发期茶树，明确复合微生物菌剂对茶树茶叶品质的影响。
45.试验材料与方法
46.选取苏州市东山镇吴侬有机茶园进行菌剂喷施，实验周期为14天，每7天喷施一次，共喷施两次。
47.实验处理共设置2个分别为：
48.处理组:喷施复合菌剂；
49.对照组：不喷施复合菌剂。
50.样品采集和储存
51.本试验分别在(0、7、14)天采集茶叶样品，样品用冰袋运输回实验室后马上使用冷冻干燥机进行杀青，24h后研磨，用于游离氨基酸含量的测定。
52.将不同处理的新鲜茶叶炒制成成品茶并保存，测定其游离氨基酸含量。
53.游离氨基酸含量测定方法
54.采用茚三酮显色发进行测定。主要分为两步，一是要完成试样溶液的制备，二是要完成其测定，记录数据，并按照如下公式进行计算：
55.茶叶中游离氨基酸含量以干态质量分数(％)表示，按下式计算：
56.游离氨基酸总量(以茶氨酸或谷氨酸计)＝(c/1000
×
v1/v2)/(m
×
ω)
×
100％
57.式中：
58.c—根据测定的吸光度从标准曲线上查得的谷氨酸的毫克数，单位为毫克(mg)
59.v1—试液总量，单位为毫升(ml)
60.v2—测定用试液量，单位为毫升(ml)
61.m一试样用量，单位为克(g)
62.ω—试样千物质含量(质量分数)，％。
63.测定结果
64.如表1表2所示，结果表明：
65.春茶采摘时，取新鲜原料叶检测，与同一茶园不喷施复合菌剂的茶叶相比，喷施过复合菌剂的茶叶中，游离氨基酸含量增加18.27％。将摘取的新鲜原料叶炒制成成品茶，与同一茶园不喷施复合菌剂的成品茶茶叶相比，游离氨基酸的含量增加14.61％。
66.表1新鲜原料叶游离氨基酸含量
[0067][0068]
表2成品茶叶游离氨基酸含量
[0069][0070]
综上，本发明通过从茶叶上分离、筛选，获得了茶叶内生菌芽孢杆菌may31，并将其应用于制备提升茶叶品质的复合菌剂；以芽孢杆菌may31为主制备的复合菌剂在茶叶萌芽期喷施于茶叶叶面，可促进茶叶游离氨基酸的含量显著升高，从而提升茶叶品质；本发明采用的制备方法步骤较少，菌剂配方简单，对茶叶游离氨基酸含量的提升效果明显，具有低成本、高效率的技术优势和广泛的应用前景。
[0071]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31，其特征在于，所述芽孢杆菌may31的保藏编号为：cgmcc no.27501。2.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的筛选方法，用于筛选如权利要求1所述的芽孢杆菌may31，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：采样与富集：取茶叶1～5g，70％体积分数的酒精震荡浸泡60s，0.5％质量分数的次氯酸钠震荡8min，70％体积分数的酒精再次震荡浸泡60s，无菌水漂洗6次以上；菌种分离纯化：将上述处理后的茶叶组织置于研钵中，加入ddh2o后研磨，于10ml离心管中静置10～20min，取上清液分级稀释1000倍；取100微升稀释的匀浆物涂布平板于lb固体培养基，并连续将分离的单菌落转接于lb固体平板上分离、纯化，培养，最后得到目标菌株；菌株鉴定：对所述菌株进行pcr扩增测序，将所得序列上传至ncbi后用blast进行检索比对，选出与该序列相似性较高的rdna序列，用mega7.0构建系统发育树，确定所述目标菌株不是病原菌。3.如权利要求2所述的提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的筛选方法。其特征在于，所述pcr扩增体系包括：dna模板，forward primer，reverse primer，pcr premix，bsa，ddh2o。4.一种提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的应用，其特征在于，将含如权利要求1所述的芽孢杆菌may31的菌液与含贝莱斯芽孢杆菌的菌液和含鞘单胞菌的菌液混合后制备复合菌剂，将所述复合菌剂喷施于茶叶叶面，以促进茶叶游离氨基酸的含量升高从而提升茶叶品质。5.如权利要求4所述的提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的应用，其特征在于，在所述混合菌剂中，所述芽孢杆菌may31、所述贝莱斯芽孢杆菌与所述鞘单胞菌的菌体浓度比为2.0～4.0:0.8～1.2:0.8～1.2。6.如权利要求4所述的提升茶叶品质的芽孢杆菌may31的应用，其特征在于，所述复合菌剂的终浓度为1
×
107～1
×
109cfu/ml。

技术总结
本发明公开了一种可提升茶叶品质的芽孢杆菌May31及其筛选方法与应用。本发明通过从茶叶上分离、筛选，获得了茶叶内生菌芽孢杆菌May31，并将其应用于制备提升茶叶品质的复合菌剂；以芽孢杆菌May31为主制备的复合菌剂在茶叶萌芽期喷施于茶叶叶面，可促进茶叶游离氨基酸的含量显著升高，从而提升茶叶品质；本发明采用的制备方法步骤较少，菌剂配方简单，对茶叶游离氨基酸含量的提升效果明显，具有低成本、高效率的技术优势和广泛的应用前景。高效率的技术优势和广泛的应用前景。高效率的技术优势和广泛的应用前景。


技术研发人员：向韵琦 丁晓艳 丁国春 毛静
受保护的技术使用者：中农新科（苏州）有机循环研究院有限公司
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/11