一种定向偶联免疫吸附剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明生物医学材料领域，具体涉及一种定向偶联免疫吸附材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，全球单抗药物发展迅速，2020年全球最畅销top 10产品中，有5个属于单抗药物。在下游的抗体药物纯化中，protein a 层析介质在捕获阶段起着至关重要的作用，随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈。随着技术的发展，蛋白a层析填料的耐碱性进一步增强，吸附性能也在不断提高，由最初的20mg/ml提高至60mg/ml以上。
3.层析填料的吸附性能与固相微球有关，微球的粒径越小，表面积越大，接入的配基密度更高，吸附性能也更高。影响吸附性能的另一因素是配基的偶联方式。常用的蛋白质偶联技术主要通过氨基进行偶联，蛋白质上含有大量的氨基，会形成多点偶联，由于空间位阻的作用，造成吸附性能的下降。近年来出现了单点偶联的方法，以提高介质的吸附性能。cn110624274a通过碘乙酰基或者溴乙酰基与rprotein a-cys配体上的巯基反应合成蛋白a填料。cn113406320a、cn109781978a、cn112305222a通过双功能交联剂smcc等（4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）与巯基的加成反应进行偶联。碘乙酰的方法因中间体碘基或溴基团较活泼，反应速度快，工艺的稳定性控制难度大；smcc溶解性较差，其磺化后的衍生物sulfo-smcc稳定性和溶解性均较好，但是制备工艺复杂，价格昂贵。
4.为了获得更好的定向偶联效果，有必要开发一种新型的定向偶联免疫吸附剂。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种定向偶联免疫吸附材料及其制备方法和应用。
6.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种定向偶联免疫吸附材料，所述吸附剂载体为具有环氧基的聚乙烯醇多糖复合微球，吸附剂配基为重组蛋白，所述重组蛋白通过巯基与所述聚乙烯醇多糖复合微球上的环氧基反应，定向偶联在微球表面。
7.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球通过将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇通过乳化法反应获得。
8.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述环氧基位于微球表面和内部。
9.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球中环氧基的摩尔含量为20～40 μmol/g。
10.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球的粒径为40～70 μm。
11.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述多糖选自纤维素、琼脂糖、葡聚糖和壳聚糖中的至少一种。
12.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球中环氧基的摩尔含量为20～40 μmol/g，所述聚乙烯醇多糖复合微球的粒径为40～70 μm。
13.本发明的第二个方面，提供：本发明第一个方面所述定向偶联免疫吸附材料的制备方法，包括如下步骤：s1) 将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇溶解，然后通过乳化法获得聚乙烯醇多糖复合微球；s2) 将重组蛋白溶解于缓冲液中，必要时加入二硫键还原剂，混合得到重组蛋白溶液；s3) 将所述聚乙烯醇多糖复合微球和所述重组蛋白溶液混合交联反应，交联反应完成后加入封端试剂封端，清洗得到定向偶联免疫吸附剂。
14.在一些制备方法的实例中，重组蛋白的投料量为5～30mg/ml微球。
15.在一些制备方法的实例中，所述二硫键还原剂选自三(2-羧乙基)膦、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和3-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐中的至少一种。
16.在一些制备方法的实例中，所述二硫键还原剂在反应体系中的浓度为2～15mm。
17.在一些制备方法的实例中，聚乙烯醇多糖复合微球的制备方法具体包括：1)将多糖水溶液和环氧修饰的聚乙烯醇水溶液混合，搅拌得到水相溶液，所述水相溶液中的环氧基的摩尔含量为30～55μmol/g；2)将表面活性剂溶于油相获得油相溶液；3)所述水相溶液与油相溶液混合得到乳液，充分乳化、固化得到复合微球。
18.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述多糖水溶液中多糖的质量分数为1%～10%。
19.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述环氧修饰的聚乙烯醇水溶液中，环氧修饰的聚乙烯醇的质量分数为5～20wt.％。
20.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述水相溶液的温度为60～75℃。
21.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述搅拌的时间为30～150min。
22.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述表面活性剂选自司班40、司班60、司班80和司班85、吐温20中的至少一种。
23.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述油相选自液体石蜡、环己烷和甲苯中的至少一种。
24.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述表面活性剂在油相中的含量为0.1%～5%。
25.在一些制备方法的实例中，所述环氧修饰的聚乙烯醇的制备方法包括：a)将聚乙烯醇和水混合，加热得到聚乙烯醇水溶液；b)降温后加入环氧化试剂，在碱性环境下反应即得环氧修饰的聚乙烯醇。
26.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述聚乙烯醇的羟
基与环氧化试剂的摩尔比为(1～10):1。
27.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述环氧化试剂选自双缩水甘油醚、季戊四醇缩水甘油醚、环氧氯丙烷的至少一种。
28.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，降温至37～70℃后加入双缩水甘油醚。
29.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述环氧修饰的聚乙烯醇的环氧基的摩尔含量为90～150μmol/g。
30.本发明的第三个方面，提供：定向偶联免疫吸附材料在制备蛋白分离纯化剂或血液净化剂中的应用，所述定向偶联免疫吸附材料如本发明第一个方面所述，或按本发明第二个方面所述的制备方法制备得到。
31.本发明的有益效果是：本发明一些实例的定向偶联免疫吸附材料，制备的反应条件温和，可以在更低的温度(如室温)下有效偶联重组蛋白，偶联后重组蛋白的活性损失更小，可以更好的吸附目标物质。
32.本发明一些实例的定向偶联免疫吸附材料，多糖复合微球制备过程中，聚乙烯醇上修饰的环氧基一方面可以与多糖的羟基交联形成醚键，增加微球强度，无需进行二次交联，另一方面，表面裸露的环氧基可以作为活性基团，起到预活化作用。复合微球制备完成后即可直接与蛋白偶联制备吸附剂，活化和二次偶联在制球过程中即可完成。
33.本发明一些实例的定向偶联免疫吸附材料，复合微球表面的环氧基为聚乙烯醇提供，延长微球与偶联蛋白之间的距离，减少空间位阻，对蛋白性能影响小。
34.本发明一些实例的定向偶联免疫吸附材料，可以利用重组蛋白上巯基与环氧基进行定点偶联，空间位阻小，可以充分暴露蛋白的活性位点从而显著提高吸附性能。
35.本发明一些实例的定向偶联免疫吸附材料，多糖与聚乙烯醇在成球前即部分交联，复合微球内部和表面均有活性环氧基团，活性位点增加，蛋白偶联密度提高。
具体实施方式
36.本发明的第一个方面，提供：一种定向偶联免疫吸附材料，所述吸附剂载体为具有环氧基的聚乙烯醇多糖复合微球，吸附剂配基为重组蛋白，所述重组蛋白通过巯基与所述聚乙烯醇多糖复合微球上的环氧基反应，定向偶联在微球表面。
37.聚乙烯醇多糖复合微球上的环氧基可以和重组蛋白的巯基或打开二硫键形成的巯基反应偶联，反应条件温和。
38.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球通过将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇通过乳化法反应获得。
39.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述环氧基位于微球表面和内部。
40.环氧基的具体含量可以根据偶联蛋白的量进行相应的调整，以可以有效偶联重组蛋白即可。在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球中环氧基的摩尔含量为20～40 μmol/g。
41.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球的粒径为40～70 μm。
42.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述多糖选自纤维素、琼脂糖、葡聚糖和壳聚糖中的至少一种。这些多糖是常用的材料，性质较为稳定，安全性高。
43.在一些定向偶联免疫吸附材料的实例中，所述聚乙烯醇多糖复合微球中环氧基的摩尔含量为20～40 μmol/g，所述聚乙烯醇多糖复合微球的粒径为40～70 μm。
44.本发明的第二个方面，提供：本发明第一个方面所述定向偶联免疫吸附材料的制备方法，包括如下步骤：s1) 将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇溶解，然后通过乳化法获得聚乙烯醇多糖复合微球；s2) 将重组蛋白溶解于缓冲液中，必要时加入二硫键还原剂，混合得到重组蛋白溶液；s3) 将所述聚乙烯醇多糖复合微球和所述重组蛋白溶液混合交联反应，交联反应完成后加入封端试剂封端，清洗得到定向偶联免疫吸附剂。
45.具体的，当重组蛋白存在巯基时，则不需要添加二硫键还原剂以形成巯基。巯基可以和环氧基在不会使重组蛋白变性的温和条件下反应偶联，将重组蛋白和聚乙烯醇多糖复合微球偶联在一起。
46.重组蛋白的投料量可以根据具体的需要和微球上的环氧基量进行相应的调整，一般而言投料量越大、环氧基的量越多，将有更多的重组蛋白偶联，反之偶联的重组蛋白就会减少。在一些制备方法的实例中，重组蛋白的投料量为5～30mg/ml微球。
47.二硫键还原剂的作用打开重组蛋白中的二硫键以形成巯基，其种类没有特别的要求，以对重组蛋白活性影响小、还原效率高为宜。在于在一些制备方法的实例中，所述二硫键还原剂选自三(2-羧乙基)膦(tcep)、β-巯基乙醇（bme）、二硫苏糖醇（dtt）和3-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐中的至少一种（tcep-hcl）等。
48.二硫键还原剂的用量可以根据重组蛋白的用量、需要的巯基的量进行相应的调整。在一些制备方法的实例中，所述二硫键还原剂在反应体系中的浓度为2～15mm。
49.在一些制备方法的实例中，聚乙烯醇多糖复合微球的制备方法具体包括：1)将多糖水溶液和环氧修饰的聚乙烯醇水溶液混合，搅拌得到水相溶液，所述水相溶液中的环氧基的摩尔含量为30～55μmol/g；2)将表面活性剂溶于油相获得油相溶液；3)所述水相溶液与油相溶液混合得到乳液，充分乳化、固化得到复合微球。
50.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述多糖水溶液中多糖的质量分数为1%～10%。
51.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述环氧修饰的聚乙烯醇水溶液中，环氧修饰的聚乙烯醇的质量分数为5～20wt.％。
52.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述水相溶液的温度为60～75℃。这样可以保证聚乙烯醇保持溶解，同时有较好的反应效果。
53.搅拌的时间可以根据反应的情况(进度)进行相应的调整，以聚乙烯醇可以充分环氧化修饰为宜。在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述搅拌的时间
为30～150min。
54.表面活性剂没有特殊要求，利于水相油相混合后可以很好地乳化即可。在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述表面活性剂选自司班40、司班60、司班80和司班85、吐温20中的至少一种。这些表面活性剂安全性高，乳化效果好。
55.在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述油相选自液体石蜡、环己烷和甲苯中的至少一种。这些油相安全性高，成本低。
56.表面活性剂的量以可以有效乳化为宜。在一些制备方法的实例中，制备聚乙烯醇多糖复合微球时，所述表面活性剂在油相中的含量为0.1%～5%。
57.在一些制备方法的实例中，所述环氧修饰的聚乙烯醇的制备方法包括：a)将聚乙烯醇和水混合，加热得到聚乙烯醇水溶液；b)降温后加入环氧化试剂，在碱性环境下反应即得环氧修饰的聚乙烯醇。
58.环氧修饰反应为可逆反应，碱性环境有利于环氧基的开环偶联，可以更好地在聚乙烯醇上修饰环氧基。一般而言，反应体系的ph控制在7.5～11，优先8～10时，可以很好地促进环氧修饰，同时保留更多的环氧基。
59.通过调整聚乙烯醇的羟基与环氧化试剂的混合比，可以调节环氧修饰的程度，满足不同应用的需要。在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述聚乙烯醇的羟基与环氧化试剂的摩尔比为(1～10):1。
60.环氧化试剂只要满足安全、稳定、易反应即可。在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述环氧化试剂选自双缩水甘油醚、季戊四醇缩水甘油醚、环氧氯丙烷的至少一种。这些环氧化试剂来源广泛，安全性好，使用方便。
61.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，降温至37～70℃后加入双缩水甘油醚。这样可以获得较好的反应速度。
62.在一些制备方法的实例中，制备所述环氧修饰的聚乙烯醇时，所述环氧修饰的聚乙烯醇的环氧基的摩尔含量为90～150μmol/g。
63.本发明的第三个方面，提供：定向偶联免疫吸附材料在制备蛋白分离纯化剂或血液净化剂中的应用，所述定向偶联免疫吸附材料如本发明第一个方面所述，或按本发明第二个方面所述的制备方法制备得到。
64.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
65.实施例1：聚乙烯醇-琼脂糖复合微球的制备s1) 将聚乙烯醇使用水温90-98℃的热水溶解，配制10%的聚乙烯醇溶液；s2) 待聚乙烯醇溶液降温至50～60℃，加入双缩水甘油醚，聚乙烯醇羟基与双缩水甘油醚的摩尔比为5:1，在碱性环境(ph=10)下反应3 h，得到环氧修饰的聚乙烯醇水溶液，经检测，环氧基密度为105μmol/g环氧修饰的聚乙烯醇；s3) 将琼脂糖使用水温90-98℃的热水溶解，配制5%琼脂糖溶液；s4) 将环氧修饰的聚乙烯醇水溶液、琼脂糖溶液按体积比为1:1在60～75℃混合均匀，搅拌60 min，得到水相溶液；s5) 制备含2%的司班80与吐温60(质量比5:1)混合表面活性剂的甲苯油相溶液，将水相溶液和油相溶液按1.2：1的体积比混合均匀，70℃下机械搅拌2 h形成油包水小液
滴，最后降温至35℃固化、清洗即得到预活化的聚乙烯醇-琼脂糖复合微球，经检测，环氧基密度为32μmol/g聚乙烯醇-琼脂糖复合微球。
66.实施例2：聚乙烯醇-琼脂糖复合微球的制备s1) 将聚乙烯醇使用水温90-98℃的热水溶解，配制20%的聚乙烯醇溶液；s2) 待聚乙烯醇溶液降温至70℃，加入环氧氯丙烷，聚乙烯醇羟基与环氧氯丙烷的摩尔比为1:1，在碱性环境(ph=9)下反应2h，得到环氧修饰的聚乙烯醇水溶液，经检测，环氧基密度为150μmol/g环氧修饰的聚乙烯醇；s3) 将琼脂糖使用水温90-98℃的热水溶解，配制1%琼脂糖溶液；s4) 将环氧修饰的聚乙烯醇水溶液、琼脂糖溶液按体积比为1:1在60～75℃混合均匀，搅拌150 min，得到水相溶液；s5) 制备含2%的司班80与吐温60(质量比5:1)混合表面活性剂的甲苯油相溶液，将水相溶液和油相溶液按1.2：1的体积比混合均匀，70℃下机械搅拌2 h形成油包水小液滴，最后降温至35℃固化、清洗即得到预活化的聚乙烯醇-琼脂糖复合微球，经检测，环氧基密度为40μmol/g聚乙烯醇-琼脂糖复合微球。
67.实施例3：聚乙烯醇-琼脂糖复合微球的制备s1) 将聚乙烯醇使用水温90-98℃的热水溶解，配制5%的聚乙烯醇溶液；s2) 待聚乙烯醇溶液降温至37℃，加入双缩水甘油醚，聚乙烯醇羟基与季戊四醇缩水甘油醚的摩尔比为10:1，在碱性环境(ph=9)下反应2-4h，得到环氧修饰的聚乙烯醇水溶液，经检测，环氧基密度为90μmol/g环氧修饰的聚乙烯醇；s3) 将琼脂糖使用水温90-98℃的热水溶解，配制10%琼脂糖溶液；s4) 将环氧修饰的聚乙烯醇水溶液、琼脂糖溶液按体积比为10:1在60～75℃混合均匀，搅拌30min，得到水相溶液；s5) 制备含2%的司班80与吐温60(质量比5:1)混合表面活性剂的甲苯油相溶液，将水相溶液和油相溶液按1.2：1的体积比混合均匀，70℃下机械搅拌2 h形成油包水小液滴，最后降温至35℃固化、清洗即得到预活化的聚乙烯醇-琼脂糖复合微球，经检测，环氧基密度为20μmol/g聚乙烯醇-琼脂糖复合微球。
68.实施例4：定向偶联免疫吸附剂的制备s1) 配制质量浓度为20mg/ml的重组蛋白a溶液，加入3mm tcep 反应过夜，得到活化蛋白液；s2) 取实施例1、实施例2、实施例3制备得到的聚乙烯醇-琼脂糖复合微球20 ml，加入40 ml pb 缓冲液，得到微球溶液；s3) 将微球溶液与蛋白溶液按体积比3：2混合，35℃振荡反应1 h，反应结束后，纯水洗涤干净，洗涤，得到偶联完的琼脂糖；s4) 封端：加入2倍填料体积的1m乙醇胺与偶联完的琼脂糖35℃、180 rpm反应过夜。反应完之后，用大量纯化水冲洗，最后将其保存于20%乙醇中备用。
69.对比例1：按cn110026166a的实施例2制备得到。具体为：s1) 将100g琼脂糖凝胶(sepharose 6ff)用10倍体积左右的注射用水冲洗干净后，加入100ml的1m naoh溶液、30ml环氧溴丙烷和70ml、1，4-丁二醇二缩水甘油醚和0 .2g
硼氢化钠，搅拌，30℃下反应1 .5h，反应结束后用大量的注射用水冲洗干净，得到环氧活化的琼脂糖凝胶；s2) 在500ml的反应容器中加入上述合成的环氧活化琼脂糖凝胶100ml，0 .1mol/l的硼酸盐缓冲液150ml，控制体系ph值为7 .5到8 .5，加入14g基因工程重组蛋白a，在37℃恒温体系里反应20h，停止反应，用大约10倍体积的注射用水冲洗填料，冲洗干净后，加入200ml 0 .2m的乙醇胺溶液封闭未反应的环氧基，20℃反应10h。反应完之后，用大量注射用水冲洗，最后将其保存在含有防腐剂的溶液中保存。
70.吸附性能测试分别取1ml的实施例4制备的3种合成填料和对比例1中合成的填料于10ml ep管中，加入8ml人血浆，置于摇床中，室温下缓慢摇匀1h。吸附完成后，将上述悬浊液倒入一次性亲和层析柱中，先用约100ml pbs冲洗，然后用80ml ph3.0 0.1 m 醋酸缓冲溶液洗脱，收集洗脱峰，用紫外检测od280的数值，吸附性能(mg/ml)＝[(od280/1.38)
×
80]/1。
[0071]
实施例4合成的3种免疫吸附柱填料对igg的吸附性能为分别为：75mg/ml、68 mg/ml、55mg/ml，对比例1合成免疫吸附柱填料对igg的吸附性能为28mg/ml，有较好的清除igg抗体的能力，但是明显弱于实施例4的3种填料。
[0072]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种定向偶联免疫吸附材料，其特征在于，所述吸附剂载体为具有环氧基的聚乙烯醇多糖复合微球，吸附剂配基为重组蛋白，所述重组蛋白通过巯基与所述聚乙烯醇多糖复合微球上的环氧基反应，定向偶联在微球表面。2.根据权利要求1所述的定向偶联免疫吸附材料，其特征在于，其满足如下条件中的至少一个：所述聚乙烯醇多糖复合微球通过将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇通过乳化法反应获得；所述环氧基位于微球表面和内部；所述聚乙烯醇多糖复合微球中环氧基的摩尔含量为20～40 μmol/g；所述聚乙烯醇多糖复合微球的粒径为40～70 μm；所述多糖选自纤维素、琼脂糖、葡聚糖和壳聚糖中的至少一种。3.权利要求1或2所述定向偶联免疫吸附材料的制备方法，包括如下步骤：s1) 将多糖与环氧修饰的聚乙烯醇溶解，然后通过乳化法获得聚乙烯醇多糖复合微球；s2) 将重组蛋白溶解于缓冲液中，必要时加入二硫键还原剂，混合得到重组蛋白溶液；s3) 将所述聚乙烯醇多糖复合微球和所述重组蛋白溶液混合交联反应，交联反应完成后加入封端试剂封端，清洗得到定向偶联免疫吸附剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，重组蛋白的投料量为5～30mg/ml微球。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二硫键还原剂选自三(2-羧乙基)膦、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和3-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐中的至少一种。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，聚乙烯醇多糖复合微球的制备方法具体包括：1) 将多糖水溶液和环氧修饰的聚乙烯醇水溶液混合，搅拌得到水相溶液，所述水相溶液中的环氧基的摩尔含量为30～55μmol/g；2) 将表面活性剂溶于油相获得油相溶液；3) 所述水相溶液与油相溶液混合得到乳液，充分乳化、固化得到复合微球。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其满足如下条件中的至少一个：所述多糖水溶液中多糖的质量分数为1%～10%；所述环氧修饰的聚乙烯醇水溶液中，环氧修饰的聚乙烯醇的质量分数为5～20wt.％；所述水相溶液的温度为60～75℃；所述搅拌的时间为30～150min；所述表面活性剂选自司班40、司班60、司班80和司班85、吐温20中的至少一种；所述油相选自液体石蜡、环己烷和甲苯中的至少一种；所述表面活性剂在油相中的含量为0.1%～5%。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述环氧修饰的聚乙烯醇的制备方法包括：a) 将聚乙烯醇和水混合，加热得到聚乙烯醇水溶液；b) 降温后加入环氧化试剂，在碱性环境下反应即得环氧修饰的聚乙烯醇。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述环氧修饰的聚乙烯醇的制备方法
满足如下条件中的至少一个：所述聚乙烯醇的羟基与环氧化试剂的摩尔比为(1～10):1；降温至37～70℃后加入环氧化试剂；所述环氧化试剂选自双缩水甘油醚、季戊四醇缩水甘油醚、环氧氯丙烷的至少一种；所述环氧修饰的聚乙烯醇的环氧基的摩尔含量为90～150μmol/g。10.定向偶联免疫吸附材料在制备蛋白分离纯化剂或血液净化剂中的应用，所述定向偶联免疫吸附材料如权利要求1或2所述，或按权利要求3～9任一项所述的制备方法制备得到。

技术总结
本发明公开了一种定向偶联免疫吸附剂及其制备方法和应用。定向偶联免疫吸附材料的载体为具有环氧基的聚乙烯醇多糖复合微球，吸附剂配基为重组蛋白，重组蛋白通过巯基与聚乙烯醇多糖复合微球上的环氧基反应，定向偶联在微球表面。制备该定向偶联免疫吸附材料的反应条件温和，可以在更低的温度(如室温)下有效偶联重组蛋白，偶联后重组蛋白的活性损失更小，可以更好的吸附目标物质。聚乙烯醇上修饰的环氧基一方面可以与多糖的羟基交联形成醚键，增加微球强度，无需进行二次交联，另一方面，表面裸露的环氧基可以作为活性基团，起到预活化作用。复合微球制备完成后即可直接与蛋白偶联制备吸附剂，活化和二次偶联在制球过程中即可完成。成。


技术研发人员：杨正根 张海珍 牛月伟 郭欣然 黄秋灿 刘秀梅 陈校园
受保护的技术使用者：广州康盛生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/10/11