一种离体培育野生番茄多倍体的方法

1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种离体培育野生番茄多倍体的方法。


背景技术：

2.番茄(solanum lycopersicum)是茄科茄属一年生或多年生草本植物，又名西红柿。番茄酸甜多汁，富含可溶性糖、有机酸、蛋白质、维生素、胡萝卜素等多种丰富的营养物质，深受人们的喜爱，是我国广泛栽培的重要蔬菜作物。
3.目前，国内外推广应用的栽培番茄(普通番茄)均为二倍体，其抗病性、抗旱性和抗寒性相对较差，而多倍体番茄则表现出生长强壮、抗病力强、维生素c含量较高等优点，因而，生产上亟需多倍体的番茄新品种，番茄多倍体的培育成为了番茄育种的一个重要的热点研究方向。
4.在我国，分布着丰富的野生番茄。野生番茄是一种果重只有1～2g，酸涩味浓郁的野果子，经过人类千百年的驯化后发展为现在的栽培番茄，虽然番茄的重量和味道都有了显著的改良，但某些功能性成分随之散失。同时，尽管野生番茄和栽培番茄同为二倍体，但野生番茄在植物学特性上(如：茎秆、叶片、果实等)显著区别于栽培番茄，且野生番茄拥有与生俱来的优异性状或基因，如非常强大的抗病性、抗寒性、营养价值高等，这是栽培番茄远远不能相提并论的。因此，野生番茄成为了植物育种者的基因组库。
5.综合上述可知，培育出多倍体野生番茄，对推动番茄的育种进步和产业发展具有重要的意义。
6.目前番茄多倍体的培育全是针对栽培番茄，而未见对野生番茄进行多倍体培育的报道；目前栽培番茄多倍体的培育方法是利用质量浓度为0.01％～0.2％秋水仙素溶液处理番茄幼苗生长点或种子8～120h，或将番茄的种子经培养后得到子叶愈伤组织再接种到含质量浓度为0.2％秋水仙素固体培养基中进行诱导48h等，但存在三个主要问题：秋水仙素溶液处理番茄幼苗生长点或种子的致死率相对较高；愈伤组织的遗传变异性较大，难于稳定地保持母株的遗传背景；染色体诱导加倍的成功率不高(仅有个别报道了试验数据，仅为50％)。因此，如何克服现有技术的不足是目前植物生物技术领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种离体培育野生番茄多倍体的方法，该方法可以高效、快速、大量地培育出野生番茄多倍体，可为番茄育种提供重要的种质材料。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，包括以下步骤：
10.a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.0～1.5cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；
11.b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30～35d；
12.所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.2～0.6mg/l+萘乙酸0.01～0.02mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；
13.c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30～40d；
14.所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；
15.d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35～50d，得到近死状态但保持有活力的茎段；
16.所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l+秋水仙素0.30wt％～0.40wt％，ph为5.8～6.0；
17.e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为40～45d；
18.所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；
19.f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为30～40d，得到生根苗；
20.所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；
21.或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；
22.g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴凉处5～7d，期间的白天间隔0.5～1h喷雾2～3min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；
23.h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。
24.进一步，优选的是，a步骤中的茎尖清洗的具体方法为：
25.先用流水冲洗茎尖0.5～1min；再用洗洁精水溶液浸泡1.5～3min；浸泡后流水冲洗0.5～1min，最后用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s。
26.进一步，优选的是，a步骤茎尖灭菌的具体方法为：
27.先用质量浓度为0.2％升汞溶液灭菌2～3min，再用无菌水浸泡清洗2～5mi n，最后用无菌滤纸吸干茎尖上的表面水分。
28.进一步，优选的是，b步骤中，启动诱导培养时，光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d；茎尖长成高3.5～6.0cm植株时完成启动诱导。
29.进一步，优选的是，c步骤、d步骤和f步骤中，培养时，光照强度均为2500～2800lx，光照时间均为12h/d。
30.进一步，优选的是，d步骤中，染色体加倍诱导完成的判定特征为：叶片全部变黄，并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。
31.进一步，优选的是，e步骤中，恢复培养时，先暗培养3～4d，后按光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d进行培养；培养至长成高为3.0～4.5cm植株时完成恢复培养。
32.进一步，优选的是，f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。
33.进一步，优选的是，g步骤中，基质采用混合均匀的椰糠和珍珠岩；椰糠和珍珠岩的体积比为7︰2；施肥时，每次亩用水溶性复合肥4～5kg喷施，每周1次，喷施3～4次；所述的水溶性复合肥的氮磷钾含量比为17:17:17。
34.进一步，优选的是，h步骤中，e步骤得到的恢复苗和f步骤得到的生根苗的显著特征是在同一类型的苗中，个体的株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上；
35.g步骤得到的驯化苗的显著特征是个体的株高是其它个体均值的1.5倍以上或茎粗是其它个体均值的1.6倍以上或分枝数是其它个体均值的2倍以上或叶片大小是其它个体均值的3倍以上。
36.本发明a步骤中，剪取的茎尖需要迅速带回组培室进行外植体清洗及灭菌处理。
37.本发明中，生根苗为长势较好、健壮、生根质量较好(从基部发出，无愈伤组织)的植株。
38.本发明采用的琼脂粉强度优选为1200g/cm2。
39.本发明中，含腋芽的茎段可以理解为还包括顶端的茎尖在内。经过本发明c步骤多代增殖扩繁后可获得大量的苗。
40.本发明改良的基础培养基ms中，nh4no3、kh2po4均改为原来的2倍，其余成分均保持不变。
41.本发明喷雾时，对于喷雾的流量没有具体限制，按照常规设置即可。
42.本发明采用的灭菌方法，便于野生番茄茎尖的高效灭菌；采用染色体加倍诱导以便于野生番茄染色体高效加倍；对诱导后的苗进行恢复培养，恢复培养时，先暗培养，再于光照强度为2500～2800lx条件下培养，便于良好地恢复培养野生番茄；本发明对生根培养得到的苗进行移栽驯化，基质采用椰糠和珍珠岩，并进行施肥管理，以便于良好地进行野生番茄组培苗的移栽驯化；本发明先通过观察培养所得到的苗是否具有显著特征，从而便于野生番茄多倍体植株的判断。
43.本发明采用流式细胞术快速鉴定野生番茄的倍性。流式细胞术是20世纪80年代兴起的一种以流式细胞仪为工具的倍性鉴定方法，能简单、快速、准确的检测植物的倍性，已被用于多种植物育种及倍性的鉴定。经流式细胞仪检测后，野生番茄植株的倍性(c)＝(检测植株出高峰时的荧光强度值/对照植株出高峰时的荧光强度值)
×
2，当c﹥2时即为多倍体(表示染色体加倍成功)，c＝2时为二倍体，c＝3时为三倍体，c＝4时为四倍体，依此类推。
44.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
45.(1)首次研究提出了一种离体培育野生番茄多倍体的方法，试验显示野生番茄染色体诱导加倍的成功率可达85％以上，而致死率低于38％。野生番茄染色体加倍诱导培养是在茎段分化的整个过程中实施，此时的组织细胞分化活跃，且诱导加倍时间相对较长(培养时间为35～50d)，这样可促使野生番茄染色体加倍具有较高的成功率；野生番茄染色体加倍诱导培养完成的判断特征是非常明显，易观察和掌握操作，能确保大概率地使野生番茄染色体成功加倍；
46.(2)通过野生番茄茎尖的“直接器官发生”途径的培养，可成功获得优质的组培苗，且可以高度保持野生番茄母株的遗传稳定性；
47.(3)野生番茄染色体加倍诱导培养完成后的茎段保持有活力，在其恢复培养后可容易再生快繁(增殖系数大于4)，从而在短期内可获得大量多倍体材料；
48.(4)野生番茄恢复培养中采用提高培养基中的氮磷钾养分浓度及先暗培养后再正常培养，可以促使在染色体加倍诱导阶段受秋水仙素影响生长的野生番茄培养材料能得到良好快速的恢复，本发明的试验显示：材料在接种8d后开始普遍转绿，生长迅速，接种13d后可恢复到近正常态；
49.(5)野生番茄多倍体植株判定采用先判断后鉴定的方法，可以根据显著特征实现快速、大概率地判断找到染色体加倍成功的材料，试验显示，根据显著特征判断的植株经鉴定后的染色体加倍成功率比较高(大于87％)，可较大程度地节省了人力、物资成本、时间成本等；
50.(6)本发明的技术操作方法简单、成本低、成效显著、应用价值可观，可实现野生番茄多倍体的高效培育，易于实施和推广。
附图说明
51.图1为本发明实施例中的野生番茄启动诱导图；
52.图2为本发明实施例中的野生番茄增殖培养图；
53.图3为本发明实施例中的野生番茄染色体加倍诱导图；
54.图4为本发明实施例中的野生番茄恢复培养图：图中最前面的个体茎粗约是其它个体均值的2.1倍，有显著特征，经鉴定后该个体为四倍体；
55.图5为本发明实施例中的野生番茄生根壮苗培养图；
56.图6为本发明实施例中的野生番茄移栽驯化后表型及对应染色体倍性鉴定结果图：a为通过本发明培育出的植株，记为1号，表型明显，相比对照植株(c)，显示出植株较高，分枝较多(3个)等；b为通过本发明培育出的植株，记为2号，表型明显，相比对照植株(c)，显示出植株较高，分枝较多(2个)等；c为对照株，记为3号；d为1号株的染色体倍性鉴定结果，高峰值荧光强度为100
×
103，是对照株高峰值荧光强度50
×
103(f)的2倍，说明1号株为四倍体；e为2号株的染色体倍性鉴定结果，高峰值荧光强度为75
×
103，是对照株高峰值荧光强度50
×
103(f)的1.5倍，说明2号株为三倍体；f是3号对照株的染色体倍性鉴定结果，高峰值荧光强度为50
×
103，属于二倍体。
具体实施方式
57.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
58.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
59.实施例1
60.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，包括以下步骤：
61.a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.0～1.5cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；
62.b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为32d；
63.所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.4mg/l+萘乙酸0.015mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.6g/l，ph为5.9；
64.c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35d；
65.所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l，ph为5.9；
66.d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为40d，得到近死状态但保持有活力的茎段；
67.所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l+秋水仙素0.35wt％，ph为5.9；
68.e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为43d；
69.所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l，ph为5.9；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；
70.f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为35d，得到长势较好、健壮、生根质量较好(从基部发出，无愈伤组织)的植株；
71.所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l，ph为5.9；
72.或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖27g/l+琼脂粉5.6g/l，ph为5.9；
73.g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴
凉处6d，期间的白天间隔0.8h喷雾2.5min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；
74.h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。
75.实施例2
76.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，包括以下步骤：
77.a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.0～1.3cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；
78.b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30d；
79.所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.2mg/l+萘乙酸0.01mg/l+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l，ph为5.8；
80.c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～1.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30d；
81.所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8mg/l+萘乙酸0.01mg/l+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l，ph为5.8；
82.d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～1.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35d，得到近死状态但保持有活力的茎段；
83.所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8mg/l+萘乙酸0.01mg/l+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l+秋水仙素0.30wt％，ph为5.8；
84.e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为40d；
85.所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8mg/l+萘乙酸0.01mg/l+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l，ph为5.8；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；
86.f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～1.5cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为30d，得到长势较好、健壮、生根质量较好(从基部发出，无愈伤组织)的植株；
87.所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l，ph为5.8；
88.或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖25g/l+琼脂粉5.5g/l，ph为5.8；
89.g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴凉处5d，期间的白天间隔0.5h喷雾2min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；
90.h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得
到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。
91.a步骤中的茎尖清洗的具体方法为：
92.先用流水冲洗茎尖0.5min；再用洗洁精水溶液浸泡1.5min；浸泡后流水冲洗0.5min，最后用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s。
93.a步骤茎尖灭菌的具体方法为：
94.先用质量浓度为0.2％升汞溶液灭菌2min，再用无菌水浸泡清洗2min，最后用无菌滤纸吸干茎尖上的表面水分。
95.b步骤中，启动诱导培养时，光照强度为2500～2600lx，光照时间为12h/d；茎尖长成高3.5～6.0cm植株时完成启动诱导。
96.c步骤、d步骤和f步骤中，培养时，光照强度均为2500～2600lx，光照时间均为12h/d。
97.d步骤中，染色体加倍诱导完成的判定特征为：叶片全部变黄，并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。
98.e步骤中，恢复培养时，先暗培养34d，后按光照强度为2500～2600lx，光照时间为12h/d进行培养；培养至长成高为3.0～4.5cm植株时完成恢复培养。
99.f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。
100.g步骤中，基质采用混合均匀的椰糠和珍珠岩；椰糠和珍珠岩的体积比为7︰2；施肥时，每次亩用水溶性复合肥5kg喷施，每周1次，喷施3次；所述的水溶性复合肥的氮磷钾含量比为17:17:17。
101.h步骤中，e步骤得到的恢复苗和f步骤得到的生根苗的显著特征是在同一类型的苗中，个体的株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上；
102.g步骤得到的驯化苗的显著特征是个体的株高是其它个体均值的1.5倍以上或茎粗是其它个体均值的1.6倍以上或分枝数是其它个体均值的2倍以上或叶片大小是其它个体均值的3倍以上。
103.实施例3
104.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，包括以下步骤：
105.a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.2～1.5cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；
106.b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35d；
107.所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.6mg/l+萘乙酸0.02mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l，ph为6.0；
108.c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为2.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为40d；
109.所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤1.0mg/l+萘乙酸0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l，ph为6.0；
110.d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为2.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为50d，得到近死状态但保持有活力的茎段；
111.所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤1.0mg/l+萘乙酸0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l+秋水仙素0.40wt％，ph为6.0；
112.e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为45d；
113.所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤1.0mg/l+萘乙酸0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l，ph为6.0；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；
114.f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为2.0～2.5cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为40d，得到生根苗；
115.所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l，ph为6.0；
116.或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖30g/l+琼脂粉5.8g/l，ph为6.0；
117.g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴凉处7d，期间的白天间隔1h喷雾3min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；
118.h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。
119.a步骤中的茎尖清洗的具体方法为：
120.先用流水冲洗茎尖1min；再用洗洁精水溶液浸泡3min；浸泡后流水冲洗1min，最后用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s。
121.a步骤茎尖灭菌的具体方法为：
122.先用质量浓度为0.2％升汞溶液灭菌3min，再用无菌水浸泡清洗5min，最后用无菌滤纸吸干茎尖上的表面水分。
123.b步骤中，启动诱导培养时，光照强度为2700～2800lx，光照时间为12h/d；茎尖长成高3.5～6.0cm植株时完成启动诱导。
124.c步骤、d步骤和f步骤中，培养时，光照强度均为2700～2800lx，光照时间均为12h/d。
125.d步骤中，染色体加倍诱导完成的判定特征为：叶片全部变黄，并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。
126.e步骤中，恢复培养时，先暗培养4d，后按光照强度为2700～2800lx，光照时间为12h/d进行培养；培养至长成高为3.0～4.5cm植株时完成恢复培养。
127.f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。
128.g步骤中，基质采用混合均匀的椰糠和珍珠岩；椰糠和珍珠岩的体积比为7︰2；施肥时，每次亩用水溶性复合肥4kg喷施，每周1次，喷施4次；所述的水溶性复合肥的氮磷钾含量比为17:17:17。
129.h步骤中，e步骤得到的恢复苗和f步骤得到的生根苗的显著特征是在同一类型的苗中，个体的株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上；
130.g步骤得到的驯化苗的显著特征是个体的株高是其它个体均值的1.5倍以上或茎粗是其它个体均值的1.6倍以上或分枝数是其它个体均值的2倍以上或叶片大小是其它个体均值的3倍以上。
131.实施例4
132.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，包括以下步骤：
133.a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.1～1.4cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；
134.b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为33d；
135.所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.4mg/l+萘乙酸0.015mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l，ph为5.9；
136.c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.5～2.0cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35d；
137.所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.6g/l，ph为5.9；
138.d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.3～2.2cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为40d，得到近死状态但保持有活力的茎段；
139.所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l+秋水仙素0.35wt％，ph为5.9；
140.e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为43d；
141.所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.9mg/l+萘乙酸0.03mg/l+白砂糖28g/l+琼脂粉5.7g/l，ph为5.9；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；
142.f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.2～2.0cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为35d，得到生根苗；
143.所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖26g/l+琼脂粉5.6g/l，ph为5.9；
144.或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖26g/l+琼脂粉5.6g/l，ph为5.9；
145.g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴凉处6d，期间的白天间隔0.8h喷雾2.5min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；
146.h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。
147.a步骤中的茎尖清洗的具体方法为：
148.先用流水冲洗茎尖0.8min；再用洗洁精水溶液浸泡2min；浸泡后流水冲洗0.8min，最后用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s。
149.a步骤茎尖灭菌的具体方法为：
150.先用质量浓度为0.2％升汞溶液灭菌2.5min，再用无菌水浸泡清洗3min，最后用无菌滤纸吸干茎尖上的表面水分。
151.b步骤中，启动诱导培养时，光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d；茎尖长成高3.5～6.0cm植株时完成启动诱导。
152.c步骤、d步骤和f步骤中，培养时，光照强度均为2500～2800lx，光照时间均为12h/d。
153.d步骤中，染色体加倍诱导完成的判定特征为：叶片全部变黄，并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。
154.e步骤中，恢复培养时，先暗培养3.5d，后按光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d进行培养；培养至长成高为3.0～4.5cm植株时完成恢复培养。
155.f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。
156.g步骤中，基质采用混合均匀的椰糠和珍珠岩；椰糠和珍珠岩的体积比为7︰2；施肥时，每次亩用水溶性复合肥4.5kg喷施，每周1次，喷施3次；所述的水溶性复合肥的氮磷钾含量比为17:17:17。
157.f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。
158.试验结果
159.1.外植体灭菌
160.野生番茄的茎尖经质量浓度为0.2％升汞(hgcl2)溶液灭菌不同时间，会产生不同的灭菌效果。其中，0.2％升汞灭菌野生番茄茎尖2～3min时，污染率低于15％，死亡率低于8％(见表1)，说明此种灭菌方法具有较好的灭菌效果，适宜用于灭菌野生番茄的茎尖。
161.表1野生番茄茎尖的灭菌效果
[0162][0163]
2.启动诱导
[0164]
野生番茄茎尖经9种处理的启动诱导培养基培养后，均能分化长成植株(株高范围为4.06～4.83cm)，但处理间的植株生长势差别明显，其中植株生长势最好的处理是1、2、4、5，它们的植株生长势是个体形态较好、健壮(见表2)，说明了这些培养基对番茄茎尖具有较好的诱导培养效果。因此，适宜野生番茄茎尖启动诱导培养的培养基是基础培养基ms+6-ba0.2～0.6mg/l+naa0.01～0.02mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8。
[0165]
表2不同处理对野生番茄茎尖启动诱导培养的影响
[0166][0167][0168]
注：表中的各种培养基含有白砂糖30g/l，琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为
5.8，下同。
[0169]
3.增殖扩繁
[0170]
9个处理的增殖培养基均能促进野生番茄的增殖扩繁，增殖的植物形态主要是茎段，增殖系数为3.93～5.40，但处理间的植株生长势差别明显，其中生长势较好的处理是1、2、4、5(见表3)，它们的生长势是较好、健壮。因此，适宜野生番茄增殖的培养基是基础培养基ms+6-ba0.8～1.0mg/l+naa0.01～0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8。
[0171]
表3不同处理对野生番茄增殖培养的影响
[0172][0173]
4.染色体加倍诱导
[0174]
在培养基中添加不同浓度的秋水仙素进行野生番茄染色体加倍诱导培养试验，不同处理对野生番茄染色体加倍诱导培养的影响差异明显。随着秋水仙素的浓度增高，野生番茄染色体加倍成功率增加，但幼苗的致死率也随着增加，其中，当秋水仙素的浓度为0.30wt％～0.40wt％时(处理3、4)，具有相对较高的染色体加倍成功率和相对较小的致死率(见表4)。因此，适宜野生番茄染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8mg/l+萘乙酸0.01mg/l+秋水仙0.30wt％～0.40wt％+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8。
[0175]
表4不同处理对野生番茄染色体加倍诱导培养的影响
[0176][0177]
在野生番茄染色体加倍诱导培养中，不同判断特征对野生番茄染色体加倍诱导效果的影响差异较大(见表5)，其中按照处理2判断，经鉴定后的染色体加倍成功率较大(85.93％)。因此，适宜野生番茄染色体加倍诱导完成的判断特征是：茎段的叶片全部变黄并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。
[0178]
表5不同判断特征对野生番茄染色体加倍诱导效果的影响
[0179][0180]
5.恢复培养
[0181]
接种经染色体加倍诱导培养后的野生番茄茎段到不同的恢复培养基和培养方式中培养，产生了明显差别的材料恢复表现(见表6)，其中，处理4的材料恢复较快，生长迅速，能较快地恢复到近正常状态。因此，适宜野生番茄恢复培养的培养基和培养方式为：改良的基础培养基ms(nh4no3、kh2po4均改为原来的2倍，其余成分保持不变)+6-苄氨基嘌呤1.0mg/l+萘乙酸0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8；先暗培养4d，后按光照强度为2500lx，光照时间为12h/d进行培养。
[0182]
表6不同处理对野生番茄恢复培养的影响
[0183][0184]
6.生根壮苗培养
[0185]
野生番茄茎段在6种处理的生根培养基中均能分化形成植株，植株的生根率均达到100％，根系比较发达(有较好的生根量、根长、根粗)，说明野生番茄比较容易生根，但处理间根发生特点和植株长势的差异明显，其中生根较好(根从基部发出，基部无愈伤组织)和植株长势较好的处理是1、2(见表7)，因此，适宜野生番茄生根的培养基是：基础培养基ms+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8；或基础培养基1/2ms+白砂糖30g/l+琼脂粉(强度1200g/cm2)5.5g/l，ph为5.8。
[0186]
表7不同处理对野生番茄生根培养的影响
[0187][0188]
7.移栽驯化
[0189]
不同处理对野生番茄组培苗移栽驯化的影响差异明显(见表8)，其中处理2的野生番茄组培苗的成活率最高，且植株生长势较好、健壮，根系发达。因此，适宜用于野生番茄组培苗移栽驯化的基质是v椰糠：v珍珠岩＝7︰2。
[0190]
表8不同处理对野生番茄组培苗移栽驯化的影响
[0191]
[0192][0193]
8.多倍体植株的判定
[0194]
在野生番茄染色体加倍诱导培养完成后，不同判断特征对野生番茄多倍体植株判定的影响见表9，从表中可以看出，处理1、2、3的特征判断的植株经鉴定后的染色体加倍成功率比较高，大于87％，而处理4的特征判断的植株经鉴定后的染色体加倍成功率比较低(13.10％)，说明处理1、2、3的特征适宜用于野生番茄多倍体植株的高效判断。
[0195]
表9不同判断特征对野生番茄多倍体植株判定的影响
[0196][0197]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、外植体采集与灭菌：于晴天中午，剪取无病虫害、生长健壮的野生番茄主枝或分枝上顶端长1.0～1.5cm茎尖，对茎尖清洗后进行灭菌处理；b、启动诱导：将a步骤灭菌好的茎尖接种到启动诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30～35d；所述的启动诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.2～0.6mg/l+萘乙酸0.01～0.02mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；c、增殖扩繁：将b步骤培养得到的植株切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到增殖培养基中进行培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为30～40d；所述的增殖培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；d、染色体加倍诱导：将c步骤得到的苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm；然后将含腋芽的茎段接种到染色体加倍诱导培养基中培养，培养温度为25
±
2℃，培养时间为35～50d，得到近死状态但保持有活力的茎段；所述的染色体加倍诱导培养基为：基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l+秋水仙素0.30wt%～0.40wt%，ph为5.8～6.0；e、恢复培养：将经d步骤培养后得到的有活力的茎段接种到恢复培养基中培养，培养室温度在25
±
2℃，培养时间为40～45d；所述的恢复培养基为：改良的基础培养基ms+6-苄氨基嘌呤0.8～1.0mg/l+萘乙酸0.01～0.05mg/l+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；所述的改良的基础培养基ms是nh4no3、kh2po4的含量均为基础培养基ms中nh4no3、kh2po4相应各自含量的两倍，其余成分保持与基础培养基ms不变；f、生根壮苗培养：将经e步骤培养后得到的生长势有显著特征的个体单独进行生根壮苗培养，而无显著特征的个体则一起生根壮苗培养；培养的方法是将苗切成含腋芽的茎段，所述的茎段长为1.0～2.5cm，然后将含腋芽的茎段接种到到生根壮苗培养基中培养；培养室温度为25
±
2℃，培养时间为30～40d，得到生根苗；所述的生根壮苗培养基为：基础培养基ms+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；或者，所述的生根壮苗培养基为：基础培养基1/2ms+白砂糖25～30g/l+琼脂粉5.5～5.8g/l，ph为5.8～6.0；g、移栽驯化：将f步骤得到的苗洗净基部培养基后，移栽入至基质中，然后置于阴凉处5～7d，期间的白天间隔0.5～1h喷雾2～3min，之后置于自然环境中，并进行施肥管理；h、多倍体植株的判定：根据经e步骤得到的恢复苗、f步骤得到的生根苗、g步骤得到的驯化苗是否有显著特征进行多倍体植株的判断，再用流式细胞仪对具有显著特征的苗进行快速检测鉴定染色体倍性，从而得到野生番茄多倍体。2.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，a步骤中的茎尖清洗的具体方法为：
先用流水冲洗茎尖0.5～1min；再用洗洁精水溶液浸泡1.5～3min；浸泡后流水冲洗0.5～1min，最后用体积浓度为75%的酒精浸泡消毒30s。3.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，a步骤茎尖灭菌的具体方法为：先用质量浓度为0.2%升汞溶液灭菌2～3min，再用无菌水浸泡清洗2～5min，最后用无菌滤纸吸干茎尖上的表面水分。4.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，b步骤中，启动诱导培养时，光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d；茎尖长成高3.5～6.0cm植株时完成启动诱导。5.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，c步骤、d步骤和f步骤中，培养时，光照强度均为2500～2800lx，光照时间均为12h/d。6.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，d步骤中，染色体加倍诱导完成的判定特征为：叶片全部变黄，并伴有部分褐化或干枯脱落，茎段全部变黄微略带浅绿，表现出了近死状态。7.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，e步骤中，恢复培养时，先暗培养3～4d，后按光照强度为2500～2800lx，光照时间为12h/d进行培养；培养至长成高为3.0～4.5cm植株时完成恢复培养。8.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，f步骤中，生长势有显著特征的个体为株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上的植株。9.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，g步骤中，基质采用混合均匀的椰糠和珍珠岩；椰糠和珍珠岩的体积比为7︰2；施肥时，每次亩用水溶性复合肥4~5kg喷施，每周1次，喷施3~4次；所述的水溶性复合肥的氮磷钾含量比为17:17:17。10.根据权利要求1所述的离体培育野生番茄多倍体的方法，其特征在于，h步骤中，e步骤得到的恢复苗和f步骤得到的生根苗的显著特征是在同一类型的苗中，个体的株高是其它个体均值的1.8倍以上或茎粗是其它个体均值的2倍以上；g步骤得到的驯化苗的显著特征是个体的株高是其它个体均值的1.5倍以上或茎粗是其它个体均值的1.6倍以上或分枝数是其它个体均值的2倍以上或叶片大小是其它个体均值的3倍以上。

技术总结
本发明涉及一种离体培育野生番茄多倍体的方法，属于植物生物技术领域。该方法包括外植体采集与灭菌、启动诱导、增殖扩繁、染色体加倍诱导、恢复培养、生根壮苗培养、移栽驯化、多倍体植株的判定等8个步骤，本发明可以高效、快速、大量地培育出野生番茄多倍体，可为番茄育种提供重要的种质材料，易于推广应用。易于推广应用。


技术研发人员：李晓亮 杨进成 胡靖锋 段永华 张钟 徐学忠 张玉荣 左丽娟 邓成忠 胡新洲 杨红丽 李祥 兰梅 李艳兰 李艳 刘坚坚 黄晓霞 和江明
受保护的技术使用者：云南省农业科学院园艺作物研究所
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/11