OsbHLH186基因在改良水稻粒型中的应用的制作方法

osbhlh186基因在改良水稻粒型中的应用
技术领域
1.本发明涉及水稻粒型改良的技术领域，具体而言，涉及osbhlh186基因在改良水稻粒型中的应用。


背景技术：

2.水稻是重要的粮食作物之一，是世界上一半以上人口的主要能量来源。随着全球变暖，粮食安全问题日益突出，因此提高粮食生产能力对保障全球粮食安全具有重要意义。此外，人民生活水平随着社会的发展水平不断提高，人们对稻米品质的追求更加迫切。水稻粒型作为重要的产量性状和品质性状，是水稻优质高产育种的重要靶标。一般来说，大的籽粒能有效增加水稻籽粒的重量，进而提高产量；而细长粒型能有效减少垩白度从而增加水稻的外观品质，提高稻米的商业价值。因此，水稻粒型基因的挖掘以及分子调控机制的解析，不仅能为优质高产新品种的选育提供一定的理论基础，还能为粒型改良以及水稻优质高产育种的分子设计提供新的基因资源。
3.碱性螺旋环螺旋(bhlh)蛋白是一类重要的转录因子家族，其通过结合靶基因的启动子序列，抑制或激活靶基因的转录活性，并通过转录因子的级联调控网络，影响生物的各项生命活动，如细胞发育、信号转导等。近年来，越来越多的bhlh家族基因被报道参与水稻粒型的调控，如osbc1、osbul1、osbu1、ospil15等。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供提供osbhlh186基因在改良水稻粒型中的应用以解决上述技术问题。
6.本发明是这样实现的：
7.第一方面，本发明提供了一种osbhlh186基因、包含osbhlh186基因的载体或包含osbhlh186基因的重组菌在改善水稻粒型和/或提高水稻产量中的应用，osbhlh186基因编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.发明人克隆了一个水稻粒型调控基因(osbhlh186基因)，经过基因敲除和过表达验证，发现该基因可以改变水稻的粒型，表现为基因敲除水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著变小，粒长、粒宽、粒厚和千粒重都显著减小；而过表达水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著增大，粒长、粒宽、粒厚和千粒重显著增加。
9.因此，osbhlh186基因在改良水稻粒型、提高水稻产量上具有潜在的工业应用价值，产生了更高的经济效益。
10.本发明为osbhlh186基因的克隆和应用，为水稻高产育种提供了重要的理论依据和新的基因资源，具有广阔的应用前景。
11.seq id no.1所示的氨基酸序列如下：
12.msssrrsrtssraaatdmaiskavtrgganakassavacryi rrhradasrasdaingadvdirsm*。
13.在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：在水稻中过表达osbhlh186基因。
14.在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得osbhlh186基因的核酸序列。
15.在一种可选的实施方式中，osbhlh186基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
16.seq id no.2所示的核苷酸序列(即cds序列)如下：
17.atgtcgtcgagccggcggagccgtacatcgtcgagattggcggcggcgccgccgccgacggatgagcagatggcggagctcatctcgaagctgcaggccgtcctccccacccgcggcggcgaggccaatgccaagcaggcgtcaagtgccgaggtgctgcaggaggcgtgccgctacatccggaggcttcaccgggaggcggacgccctcagcgagaggctcgccgagctcctcctcctccagccgtccgatctcgccatcaacggcgcagatgtgcccgacctcatccgtagcctactcatgtaa。
18.osbhlh186基因cdna序列306bp，编码的蛋白序列包括101个氨基酸，dna全长1318bp，dna全长的核苷酸序列如seq id no.3所示。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，将包含osbhlh186基因的载体转化水稻或水稻细胞中。
20.上述转化的方法包括不限于使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
21.上述的载体包括不限于表达载体、穿梭载体和整合载体。
22.本发明中，术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
23.在一种可选的实施方式中，表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
24.此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
25.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述载体为过表达载体。
27.在一种可选的实施方式中，osbhlh186基因过表达载体中，在osbhlh186转录起始核苷酸前加上启动子；
28.在一种可选的实施方式中，启动子为增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
29.在一种可选的实施方式中，用于构建过表达载体的载体为农杆菌载体或适用于植物微弹轰击的载体。
30.在一种可选的实施方式中，农杆菌载体为pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia3301、pcambia1301-ubin、pcubi1390或pcambia1300。
31.在本发明应用较佳的实施方式中，将包含osbhlh186基因的重组菌侵染水稻的愈
伤组织。
32.在一种可选的实施方式中，重组菌的类型为根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、发根农杆菌或中美根瘤菌(rhizobium mesoamericanum)。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，上述水稻的品种为粳稻或籼稻。
34.在本发明应用较佳的实施方式中，上述粳稻为日本晴。
35.在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括如下至少一种的用途：
36.增大水稻籽粒；
37.增加水稻的粒长；
38.增加水稻的粒宽；
39.增加水稻的粒厚；
40.和增加水稻的千粒重。
41.第二方面，本发明还提供了一种改善水稻粒型和/或提高水稻产量的方法，在水稻中过表达osbhlh186基因，osbhlh186基因编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。在水稻中采用过表达osbhlh186基因的方法，可以改善水稻粒型，提高水稻的产量。
42.在本发明应用较佳的实施方式中，将osbhlh186基因过表达载体转化到水稻或水稻细胞中，培育获得水稻粒型改良的水稻。
43.或者将包含osbhlh186基因的重组菌侵染水稻的愈伤组织，培育获得水稻粒型改良的水稻。水稻的愈伤组织包括不限于：水稻的种子、根、茎或叶。优选为水稻的种子。
44.在本发明应用较佳的实施方式中，用于构建osbhlh186基因过表达载体的载体为农杆菌载体或适用于植物微弹轰击的载体。
45.在一种可选的实施方式中，农杆菌载体为pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia3301、pcambia1301-ubin、pcubi1390或pcambia1300。
46.在一种可选的实施方式中，osbhlh186基因过表达载体中，在osbhlh186转录起始核苷酸前加上启动子；
47.在一种可选的实施方式中，启动子为增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
48.本发明具有以下有益效果：
49.本发明克隆了一个水稻粒型调控基因(osbhlh186基因)，经过基因敲除和过表达验证，发现该基因可以改变水稻的粒型，表现为基因敲除水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著变小，粒长、粒宽、粒厚和千粒重都显著减小；而过表达水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著增大，粒长、粒宽、粒厚和千粒重显著增加。
50.因此，osbhlh186基因在改良水稻粒型、提升外观品质、提高水稻产量上具有潜在的工业应用价值，产生了更高的经济效益。
51.本发明osbhlh186基因的克隆和应用，为水稻高产育种提供了重要的理论依据和新的基因资源，具有广阔的应用前景。
附图说明
52.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
66.步骤如下：
67.1、提取rna：将用液氮冷冻的组织放入预冷的研钵中研磨至粉碎，趁组织未解冻时将其转入1.5ml rna-free离心管中；向离心管中加入1ml trizol溶液，上下颠倒混匀后室温放置5min；将离心管转移至高速离心机中，12000rpm离心5min；取800μl上清液至新的1.5ml离心管(rna-free)中；向离心管中加入200μl氯仿，上下颠倒混匀后室温放置15min；随后4℃，12000rpm，离心15min；吸取大约400μl上层液体至新的1.5ml离心管中；向离心管中加入400μl异丙醇，温和震荡混匀，室温放置5-10min；4℃条件下，15000rpm离心10min，倒掉上清；向管中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，直至沉淀悬浮；4℃条件下，80000rpm离心3min，去掉上清，将离心管室温晾3-6min；向管中加入20ml rna-free h2o，用手轻弹管壁，促进rna沉淀的溶解。
68.2.去除dna污染：
[0069][0070]
反应程序：37℃处理30min，75℃处理5min，立即使用或贮存于-80℃冰箱。
[0071]
3.反转录合成cdna：
[0072]
使用toyobo公司的反转录试剂盒first strand cdna synthesis kit进行反转录合成cdna。
[0073]
(a)去除dnase i酶污染：
[0074][0075]
用pcr仪75℃处理5min，然后冰上放置2min；
[0076]
(b)合成第一链cdna：
[0077][0078]
用pcr仪器42℃处理60min，75℃处理5min，然后置于-20℃保存。
[0079]
经过测序分析，结果表明osbhlh186基因成功克隆。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例进行osbhlh186基因敲除转基因株系的获取。
[0082]
(1)基因敲除载体的构建
[0083]
通过网站(https://crispr.dbcls.jp/)设计osbhlh186基因敲除靶点，随后使用引物cr-osbhlh186-f/r生成二聚体，随后将其构建至bgk03载体上；
[0084]
cr-osbhlh186-f:5
’‑
tgtgtgggtgaagcctccggatgtag-3’[0085]
cr-osbhlh186-r:5
’‑
aaacctacatccggaggcttcaccca-3’。
[0086]
(2)将构建好的基因敲除载体转入农杆菌eha105中，步骤如下：加入1μl质粒于100μl农杆菌感受态中，冰上放置5min；将加入质粒的农杆菌感受态置于液氮中冷冻5min；液氮处理结束后将感受态转移至37℃水浴锅中水浴5min；向感受态中加入400μl yep培养基(不含抗生素)，28℃摇床低速培养2-4h；将培养好的农杆菌涂在含卡那霉素和利福平抗生素的平板上，28℃培养2-3d。
[0087]
(3)遗传转化
[0088]
利用农杆菌介导转化法将敲除载体转入到粳稻品种日本晴中，经过选择培养、分化、生根。
[0089]
(4)转基因阳性苗获取及基因型鉴定
[0090]
利用引物对hyg-f/r对t0代转基因植株进行pcr扩增检测，能扩增出条带的即为阳性植株；随后利用引物对jc-f/r扩增出目的片段并进行测序，测序结果参照图1中的a图所示，分析突变类型，cr-osbhlh186-1发生了碱基的删除突变，cr-osbhlh186-2发生了碱基的插入突变。
[0091]
hyg-f：5'-gtgctttcagcttcgatg-3'
[0092]
hyg-r：5'-aaccaagctctgatagag-3'
[0093]
jc-f：5'-ctgaaagagctggagac-3'
[0094]
jc-r：5'-agtaggctacggatgagg-3'
[0095]
实施例3
[0096]
本实施例进行osbhlh186基因过表达转基因株系的获取。
[0097]
(1)构建过表达载体
[0098]
以日本晴cdna为模板，通过引物ox-f/r扩增osbhlh186的cds片段并将其构建至载体pcubi1390上，随后通过农杆菌介导转化法将其导入粳稻品种日本晴中。
[0099]
ox-f：
[0100]
5'-ttacttctgcactaggtaccatgtcgtcgagccggc-3'
[0101]
ox-r：5'-cgacctgcaggtacccatgagtaggctacggat-3'。
[0102]
(2)过表达阳性植株检测
[0103]
利用引物对hyg-f/r对osbhlh186过表达t0代转基因植株进行pcr扩增检测，能扩增出条带的即为阳性植株。
[0104]
实施例4
[0105]
osbhlh186基因表达量检测。
[0106]
实施例2获得的osbhlh186基因敲除t0代转基因阳性植株收获后的种子为t1代osbhlh186基因敲除种子，播种后的osbhlh186敲除株系(t1，两个株系分别编号cr-osbhlh186-1、cr-osbhlh186-2)。
[0107]
实施例3获得的osbhlh186基因过表达t0代转基因阳性植株收获后的种子为t1代
osbhlh186基因过表达种子，播种后的osbhlh186基因过表达(t1，两个株系分别编号ox-osbhlh186-1、ox-osbhlh186-2)。
[0108]
分别提取日本晴，osbhlh186敲除株系(t1，cr-osbhlh186-1、cr-osbhlh186-2)和过表达株系(t1，ox-osbhlh186-1、ox-osbhlh186-2)的叶片组织rna，反转录得到cdna，进行实时荧光定量pcr实验。用于检测osbhlh186基因表达量的引物为：
[0109]
rt-f：5'-cgtacatcgtcgagattggc-3'；
[0110]
rt-r：5'-ctgcagcttcgagatgagc-3'。
[0111]
本实验使用thunderbird tmqpcr mix without rox(toyobo)试剂盒进行。
[0112]
实时荧光定量pcr反应体系：
[0113][0114]
实时荧光定量pcr反应程序：95℃30s；扩增40个循环(95℃5s，60℃30s)；95℃15s；60℃1min；95℃15s。
[0115]
实时荧光定量pcr结果计算：以水稻actin基因(os03g0718150)作为内参，使用2-δδct
方法对实验结果进行计算与分析。
[0116]
水稻osbhlh186敲除株系和过表达株系的相对表达量检测结果如图1所示，与野生型相比，敲除转基因株系中osbhlh186的表达水平显著下降，而过表达阳性株系中则显著上升。
[0117]
分别对日本晴，osbhlh186敲除株系(t1，cr-osbhlh186-1、cr-osbhlh186-2)和过表达株系(t1，ox-osbhlh186-1、ox-osbhlh186-2)进行水稻粒型的观察和分析。
[0118]
如图2和图3所示，敲除osbhlh186后水稻籽粒显著变小，粒长、粒宽、粒厚和千粒重都显著减小；而过表达osbhlh186则能增加水稻的粒长、粒宽、粒厚和千粒重。
[0119]
表明osbhlh186基因可以改变水稻的粒型，表现为基因敲除水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著变小，粒长、粒宽、粒厚和千粒重都显著减小；而过表达水稻中的osbhlh186基因后，水稻的籽粒显著增大，粒长、粒宽、粒厚和千粒重显著增加。
[0120]
因此，osbhlh186基因在改良水稻粒型、提高水稻产量上具有潜在的工业应用价值，产生了更高的经济效益。本发明为水稻高产育种提供了重要的理论依据和新的基因资源，具有广阔的应用前景
[0121]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.osbhlh186基因、包含osbhlh186基因的载体或包含osbhlh186基因的重组菌在改善水稻粒型和/或提高水稻产量中的应用，其特征在于，所述osbhlh186基因编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：在水稻中过表达osbhlh186基因；优选地，所述osbhlh186基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将包含osbhlh186基因的载体转化水稻或水稻细胞中。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体为过表达载体pcubi1390；优选地，用于构建所述过表达载体的载体为农杆菌载体或适用于植物微弹轰击的载体；优选地，所述农杆菌载体为pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia3301、pcambia1301-ubin、pcubi1390或pcambia1300。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将包含osbhlh186基因的重组菌侵染水稻的愈伤组织；优选地，所述重组菌的类型为根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、发根农杆菌或中美根瘤菌(rhizobium mesoamericanum)。6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述水稻的品种为粳稻或籼稻；优选地，所述粳稻为日本晴。7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下至少一种的用途：增大水稻籽粒；增加水稻的粒长；增加水稻的粒宽；增加水稻的粒厚；和增加水稻的千粒重。8.一种改善水稻粒型和/或提高水稻产量的方法，其特征在于，在水稻中过表达osbhlh186基因，所述osbhlh186基因编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将osbhlh186基因过表达载体转化到水稻或水稻细胞中，培育获得水稻粒型改良的水稻；或者将包含osbhlh186基因的重组菌侵染水稻的愈伤组织，培育获得水稻粒型改良的水稻。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于构建所述osbhlh186基因过表达载体的载体为农杆菌载体或适用于植物微弹轰击的载体；优选地，所述农杆菌载体为pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia3301、pcambia1301-ubin、pcubi1390或pcambia1300；优选地，所述osbhlh186基因过表达载体中，在osbhlh186转录起始核苷酸前加上启动子；优选地，所述启动子为增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。

技术总结
本发明公开了OsbHLH186基因在改良水稻粒型中的应用，涉及水稻粒型改良的技术领域。该基因可以改变水稻的粒型，表现为基因敲除水稻中的OsbHLH186基因后，水稻的籽粒显著变小，粒长、粒宽、粒厚和千粒重都显著减小；而过表达水稻中的OsbHLH186基因后，水稻的籽粒显著增大，粒长、粒宽、粒厚和千粒重显著增加。因此，OsbHLH186基因在改良水稻粒型、提高水稻产量上具有潜在的工业应用价值，产生了更高的经济效益。效益。效益。


技术研发人员：陈炜 蔡怡聪 谢红卫 李永辉 蔡耀辉 罗来杨 龙伟雄 罗立华 徐伟标
受保护的技术使用者：江西省超级水稻研究发展中心（江西省农科院海南水稻育种中心）
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/11