IFN-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用

ifn-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程及医学技术领域，具体涉及ifn-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。


背景技术：

2.i型ifn是病毒感染细胞的首要响应细胞因子，具有典型的抗病毒作用。ifn-α作为干扰素系统中最大的一类，自身还包含多种亚型，已知人类基因组含13种ifn-α亚型，然而目前仅有有限的干扰素种类应用于临床。ifn-α2作为研究最多的一个亚型，自上世纪八十年代开始，已被批准进入我国的诊疗方案之中，主要用于治疗慢性乙肝病毒感染等病毒感染所致疾病等。在hiv抗感染研究中，ifn-α2是目前为止最为有效的抗hiv类ifn，和抗hiv药物联用能够有效的降低hiv潜伏病毒的rna水平，有研究证实il-21和ifn-α2联用能有效降低siv感染的恒河猴体内的炎症水平和病毒复制，并在抗病毒药物停止后依然显著抑制siv病毒反弹。在既往小儿合胞病毒感染研究中，在病程早期给予外源性干扰素补充是必要的，能有效增强免疫细胞清楚能力，达到控制病程进展的目的。目前，ifn-α2在抗呼吸道病毒免疫应用中的研究较少，有进一步开发的潜力。
3.不同亚型的ifn-α间具有较多的相似结构，同时也拥有三分之一左右的特异非保守序列，且不同亚型ifn-α皆通过与i型ifn受体的两个不同亚基ifnar1和ifnar2相互作用而调控下游反应及旁路信号途径。但由于不同亚型ifn-α间与ifnar1和ifnar2的结合作用力差异及结合位点不同，因此表现出了各亚型间所激活下游通路的方式与活性程度不同的特点。现有研究已基本将干扰素氨基酸序列中与干扰素受体结合相关的氨基酸位点解析，对干扰素改造研究提供了基础。通过对ifn-α局部位点的突变，可改变其与ifn受体亚基间的结合能力，从而达到加强或减弱下游通路响应的效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供ifn-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用，以解决如何对ifn-α局部位点的突变，可改变其与ifn受体亚基间的结合能力，从而达到加强或减弱下游通路响应的效果的问题。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
6.本发明提供一种ifn-a2位点突变融合蛋白，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位突变为e。
7.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白中，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列seq id no：1所示。
8.本发明还提供上述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，包括：
9.设计包含突变碱基的引物对对ifn-a2进行pcr扩增得到ifn-a2-82e基因片段；
10.对所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态
dh5α细胞中进行扩增，提取得到重组表达质粒；
11.将重组表达质粒转染到293t细胞，48小时培养结束后将培养液离心，去掉沉淀，并进行分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液中和得到纯化后的iifn-a2位点突变融合蛋白。
12.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，所述引物对的序列为：
13.引物f:gaaaccctgctggagaagttctacaccgagctgtatc；
14.引物r:gtagaacttctccagcagggtttcgtcccaagcggcgc。
15.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，采用dpni酶将所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理。
16.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，采用protein g纯化柱结合蛋白。
17.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，所述pcr扩增的条件为：。
18.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，进行的酸性条件为：0.1m glycine，ph 2.5。
19.进一步地，在所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法中，进行的碱性条件为：1m tris，ph 8.5。
20.本发明还提供上述的ifn-a2位点突变融合蛋白或上述的制备方法制得的ifn-a2位点突变融合蛋白在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。
21.本发明还提供一种抗呼吸道病毒免疫制剂，包括上述的ifn-a2位点突变融合蛋白或上述的制备方法制得的ifn-a2位点突变融合蛋白。
22.本发明具有以下有益效果：
23.本发明提供的ifn-a2位点突变融合蛋白，通过对ifn-α2受体结合位点的序列改造，将ifn-α2上一特异氨基酸位点突变为相应的ifn-α4的氨基酸位点，并对ifn-α2突变体进行抗病毒能力测定以及信号转导通路检测，发现相对于未突变的ifn-α2，突变体具有更好的抗病毒能力，并且能有限降低病毒蛋白复制。
24.本发明通过对ifn-a2的第82位氨基酸突变为e，得到ifn-a2位点突变融合蛋白，提升其和干扰素受体亲和力，增强抗病毒能力，能有效解决制剂使用繁琐，时效性短，应用场景局限的问题，且表现出其广谱的抗病毒性，为制备新型抗呼吸道病毒免疫制剂提供思路。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
26.图1为本发明实施例2中ifnα2-e融合蛋白磷酸化stat1结果；
27.图2为本发明实施例3中ifnα2-e融合蛋白抑制流感病毒h1n1的复制结果一；
28.图3为本发明实施例3中ifnα2-e融合蛋白抑制流感病毒h1n1的复制结果二。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.本发明的技术方案为：
31.一种ifn-a2位点突变融合蛋白，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位为e。
32.进一步地，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
33.所述seq id no：1为：
34.cdlpqthslgsrrtlmllaqmrrislfsclkdrhdfgfpqeefgnqfqkaetipvlhemiqqifnlfstkdssaawdetllekfytelyqqlndleacviqgvgvtetplmkedsilavrkyfqritlylkekkyspcawevvraeimrsfslstnlqeslrskeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
35.发明人在前期抗呼吸道病毒免疫应用研究中，使用ifn-α4能有效抑制病毒复制，在同等使用浓度下ifn-α4表现出更强的抗感染能力。据此，进一步通过比对ifn-α2和ifn-α4的氨基酸序列，分析ifn-α与ifnar1和ifnar2结合的氨基酸位点，发现两者间有6个氨基酸位点存在差异。结合前期研究，对ifn-α2进行了氨基酸位点改造，将ifn-α2上一特异氨基酸位点突变为相应的ifn-α4的氨基酸位点，并对ifn-α2突变体进行抗病毒能力测定以及信号转导通路检测，发现相对于未突变的ifn-α2，突变体具有更好的抗病毒能力，并且能有限降低病毒蛋白复制。该研究结果丰富了ifn-α抗病毒的认知，并且对于开发新兴抗病毒制剂提供了新的研究思路及佐证。
36.一种ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，包括：
37.设计包含突变碱基的引物对对ifn-a2进行pcr扩增得到ifn-a2-82e基因片段；
38.其中，所述引物对的序列为：
39.引物f:gaaaccctgctggagaagttctacaccgagctgtatc；
40.引物r:gtagaacttctccagcagggtttcgtcccaagcggcgc。
41.pcr扩增的条件为：98℃3min，进入35个循环：98℃10s，55℃15s，72℃35s；循环结束后72℃5min。
42.采用dpni酶对所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态dh5α细胞中进行扩增，37℃培养14小时，提取得到重组表达质粒；
43.将重组表达质粒转染到293t细胞，转染后6h更换培养基为expi293表达培养基，于37℃5％ co2培养箱中继续培养48小时后将培养液离心，去掉沉淀，采用protein g纯化柱分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件(0.1m glycine，ph 2.5)下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液(1m tris，ph 8.5)中和得到纯化后的ifn-a2融合蛋白。
44.呼吸道病毒感染相关基因ifn-a2融合蛋白在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。
45.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的吸道病毒感染相关基因ifn-a2融合蛋白进行描述，但是应当理解，这些实施例是以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
46.将呼吸道病毒感染相关基因ifn-a2位点突变融合蛋白记为ifnα2-e融合蛋白。
47.实施例1ifnα2-e融合蛋白的制备
48.设计包含突变碱基的引物对ifn-a2进行pcr扩增得到ifn-a2-82e基因片段；其中，pcr扩增的条件为：98℃3min；进入35个循环：98℃10s，55℃15s，72℃35s；循环结束后72℃5min。
49.其中，所述引物的序列为：
50.引物f:gaaaccctgctggagaagttctacaccgagctgtatc；
51.引物r:gtagaacttctccagcagggtttcgtcccaagcggcgc。
52.采用dpni酶对所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态dh5α细胞中进行扩增，37℃培养14小时提取得到重组表达质粒；
53.将重组表达质粒转染到293t细胞，转染后6h更换培养基为expi293表达培养基，于37℃5％ co2培养箱中继续培养48小时后将培养液离心，去掉沉淀，48小时培养结束后将培养液离心，去掉沉淀，采用protein g纯化柱分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件(0.1m glycine，ph 2.5)下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液(1m tris，ph 8.5)中和得到纯化后的ifnα2-e融合蛋白。
54.实施例2ifnα2-e融合蛋白磷酸化stat1的能力
55.干扰素通过与细胞表面的干扰素受体结合，导致受体胞内段招募结合tyk/jak激酶并磷酸化，进一步磷酸化stat1，磷酸化的stat1二聚体易位到细胞核从而起始下游干扰素刺激基因的表达，进而发挥抗病毒作用。
56.为了验证ifnα2-e是否具有更好的磷酸化stat1的作用，本实施列采用在12孔板铺板a549细胞，分别使用1ml浓度为5nm的ifnα2、ifnα2-e和ifnα4融合蛋白在co2细胞培养箱中培养1h后，通过蛋白免疫印迹法分析流感病毒核蛋白np的表达。所用一抗分别为anti-pstat1-mouse(abcam，ab281999，1：1000)，anti-pstat1-rabbit(cst，14994，1：1000)，anti-actin-rabbit(cst，3700，1：1000)；二抗为anti-rabbit-hrp(cst，7074，1:4000)，anti-muose-hrp(cst，7076，1:4000)。
57.结果见图1显示，三者均能磷酸化stat1，而ifnα2磷酸化stat1的能力最弱，ifnα2-e能明显增强ifnaα2磷酸化stat1的能力，显示了变体ifnα2-e具有更好的刺激干扰素刺激基因表达的能力。
58.实施例3ifnα2-e融合蛋白抑制流感病毒h1n1的复制
59.肺上皮细胞系a549来源于人非小细胞肺癌上皮细胞，是用于研究流感病毒感染的主要细胞模型。
60.为了验证ifnα2-e对不同亚型流感病毒感染的作用，本实施例采用在12孔板铺板a549，使用1ml浓度为5nm的ifnα2、ifnα2-e和ifnα4融合蛋白在co2细胞培养箱中培养24h，吸去培养基后使用pbs清洗细胞一次，加入400μl含h1n1流感病毒的dmem处理2h，平均每个细胞感染病毒的颗粒数(moi)为0.01。2h后，吸掉含病毒的培养基，加入1ml含2％ fbs的
dmem继续培养细胞24h后收细胞，通过蛋白免疫印迹法分析流感病毒核蛋白np的表达。所用一抗分别为anti-np-rabbit(义翘神州，11675-t62，1：5000)，anti-gapdh-rabbit(cst，2118，1：1000)；二抗为anti-rabbit-hrp(cst，7074，1:4000)。
61.结果见图2和图3显示，与病毒对照相比，三者均能明显抑制流感病毒h1n1亚株ca04、pr8核蛋白np的复制(图2)，而ifnα2-e与ifnα4的抗流感病毒核蛋白np复制的能力相当，且ifnα2-e对ca04亚株复制的抑制能力显著强于ifnα2，显示了ifnα2-e变体具有更好的抗流感病毒的效果。
62.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种ifn-a2位点突变融合蛋白，其特征在于，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位突变为e。2.根据权利要求1所述的ifn-a2位点突变融合蛋白，其特征在于，所述ifn-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。3.一种如权利要求1或2所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：设计包含突变碱基的引物对对ifn-a2进行pcr扩增得到ifn-a2-82e基因片段；对所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态dh5α细胞中进行扩增，提取得到重组表达质粒；将重组表达质粒转染到293t细胞，48小时培养结束后将培养液离心，去掉沉淀，并进行分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液中和，得到纯化后的ifn-a2位点突变融合蛋白。4.根据权利要求3所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述引物对的序列为：引物f:gaaaccctgctggagaagttctacaccgagctgtatc；引物r:gtagaacttctccagcagggtttcgtcccaagcggcgc。5.根据权利要求3所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，采用dpni酶将所述ifn-a2-82e基因片段进行酶切处理。6.根据权利要求3所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，采用protein g纯化柱纯化结合蛋白。7.根据权利要求3所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，进行的酸性条件为：0.1m glycine，ph 2.5。8.根据权利要求3所述的ifn-a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，进行的碱性条件为：1m tris，ph 8.5。9.权利要求1或2所述的ifn-a2位点突变融合蛋白或权利要求3-8任一项所述的制备方法制得的ifn-a2位点突变融合蛋白在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。10.一种抗呼吸道病毒免疫制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的fn-a2位点突变融合蛋白或权利要求3-8任一项所述的制备方法制得的fn-a2位点突变融合蛋白。

技术总结
本发明公开了IFN-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用，属于生物工程及医学技术领域。所述IFN-a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位突变为E。本发明提供的IFN-a2位点突变融合蛋白，通过对IFN-α2受体结合位点的序列改造，将IFN-α2上一特异氨基酸位点突变为相应的IFN-α4的氨基酸位点，并对IFN-α2突变体进行抗病毒能力测定以及信号转导通路检测，发现相对于未突变的IFN-α2，突变体具有更好的抗病毒能力，并且能有限降低病毒蛋白复制。降低病毒蛋白复制。降低病毒蛋白复制。


技术研发人员：杨正林 何涌泉 尹燚 张易 黄璐琳 王蜀强
受保护的技术使用者：四川省医学科学院
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/11