β-桉叶醇合酶CcTPS6和其编码基因及其应用

β-桉叶醇合酶cctps6和其编码基因及其应用
技术领域：
1.本发明技术属于合成生物学和天然药物化学领域，具体涉及β-桉叶醇倍半萜合酶及其编码基因，与其应用和其产物作为在制备抗衰老药物中的应用。


背景技术：

2.萜类化合物为种类最多、化学结构变化最为丰富的一类天然产物，广泛存在于高等植物和微生物中，具有重要的经济和药用价值。倍半萜β-桉叶醇通常存在于植物的挥发油中，药理活性广泛，具有抗炎、抗肿瘤、抑制血管生成、促进胃排空和抑制乙酰胆碱辅酶等活性，但其抗衰老活性未有文献报道。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供β-桉叶醇合酶cctps6编码基因cdna序列及其应用。
4.为实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
5.β-桉叶醇cctps6，其为：
6.(1)seq id no.1所示氨基酸序列构成的蛋白；
7.(2)seq id no.1所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
8.所述β-桉叶醇合酶cctps6的编码基因，其为：
9.(a)seq id no.2所示的核苷酸序列；
10.(b)seq id no.2所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
11.含有所述的cctps6编码基因的重组载体。
12.含有所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的表达盒。
13.含有所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的转基因细胞系。
14.含有所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的重组菌。
15.所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备含有β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌中的应用。
16.所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备含有化合物β-桉叶醇的发酵液中的应用，所述的应用是采用：构建含有编码所述基因的表达载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养，得到含有β-桉叶醇的发酵液。
17.化合物β-桉叶醇(c1)的制备方法，该方法包括下述步骤：构建含有编码β-桉叶醇合酶cctps6的编码基因的表达载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养，得到含有β-桉叶醇的发酵液，通过石油醚或乙酸乙酯萃取后获得含有β-桉叶醇的浸膏，经硅胶柱层析方法分离纯化，最终得到化合物β-桉叶醇(c1)。
[0018][0019]
所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备化合物β-桉叶醇中的应用。
[0020]
β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备香精香油、日用化妆品、抗衰老药物中的应用。
[0021]
上述任意一项所述制备方法得到的倍半萜类化合物β-桉叶醇在制备香精香油、日用化妆品、抗衰老药物中的应用。
[0022]
所述抗衰老药物包括所用大肠杆菌和秀丽线虫株。
[0023]
一种药物组合物，包括药剂学上可接受的药物辅料和化合物β-桉叶醇。所述药物组合物包括片剂、胶囊剂、冲剂、口服液体制剂、静脉注射剂或肌肉注射剂。
[0024]
本发明还提供获取β-桉叶醇合酶cctps6编码基因cdna序列的特异性引物对，包括：
[0025]
正向引物(cctps6-f)：5
’‑
atggctgcacttatcgccg-3’[0026]
反向引物(cctps6-r)：5
’‑
ttaaatctctatttgatcgacgagc-3’[0027]
上述引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
[0028]
本发明提供的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的开放阅读框(orf)为1650bp(seq id no.2)，编码549个氨基酸(seq id no.1)，将其放在ncbi中进行blastn分析比对，结果显示与唇形科植物火把花(colquhounia coccinea var.mollis)的lctps2的同源性为80％。
[0029]
本发明提供的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因是从火把花(colquhounia coccinea var.mollis)中克隆获得的萜类合酶基因，其能够特异性催化倍半萜的直接前体法尼基焦磷酸酯(fpp)合成单一产物倍半萜β-桉叶醇，该基因是首次从植物中克隆得到，该酶的发现丰富了萜类合酶的多样性。
[0030]
本发明从唇形科药用植物火把花中克隆并功能鉴定了倍半萜合酶cctps6，并利用大肠杆菌生成β-桉叶醇的应用。
[0031]
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
[0032]
本发明从唇形科植物火把花(colquhounia coccinea var.mollis)出发，克隆并功能鉴定了一个合成β-桉叶醇的单功能萜类合酶cctps6编码基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示，对其进行密码子优化和定点突变后，与表达载体pcold-tf连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至大肠杆菌中构建成为工程细胞，实现了大肠杆菌异源高效合成化合物β-桉叶醇，本发明构建的该基因工程细胞安全稳定，生产周期短，显示出其在应用开发中的重大价值。本发明提供的产物具有抗衰老活性，能够在制备抗衰老药物中应用。实施例结果表明，本发明提供的β-桉叶醇可以使模式生物秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)的寿命延长约32％，其效果接近于盐酸二甲双胍的寿命延长作用(35％)。
附图说明
[0033]
图1为实施例1中β-桉叶醇合酶cctps6的多序列比对图。
[0034]
图2为实施例1中β-桉叶醇合酶cctps6的三维结构预测图。
[0035]
图3为实施例3中表达β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的工程大肠杆菌提取物的gc-ms分析总离子流图。
[0036]
图4为实施例4中表达密码子优化后、定点突变后β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的工程大肠杆菌提取物的gc-ms分析总离子流图。
[0037]
图5为实施例5中β-桉叶醇对野生型秀丽隐杆线虫寿命的影响图。
[0038]
图6为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫抵抗胁迫能力的影响图。
[0039]
图7为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响图。
[0040]
图8为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫脂褐素积累的影响图。
[0041]
图9为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫活性氧积累的影响图。
[0042]
图10为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫脂肪积累的影响图。
[0043]
图11为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫体长发育、咽泵频率和头摆频率的影响图。
[0044]
图12为实施例5中β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫代谢的影响图。
[0045]
图13为实施例5中β-桉叶醇对e.coli op50生长曲线的影响图。
[0046]
图14为实施例5中热灭活e.coli op50对秀丽隐杆线虫寿命的影响图。
[0047]
图15为实施例5中β-桉叶醇对功能缺失突变体秀丽隐杆线虫寿命的影响图。
[0048]
图16为实施例5中β-桉叶醇对daf-16核转位的影响图。
[0049]
图17为实施例5中β-桉叶醇对skn-1、hsp-16.2和gst-4基因的影响图。
[0050]
图18为实施例5中β-桉叶醇对衰老相关基因的影响图。
[0051]
图19为实施例2和3中表达β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的大肠杆菌表达质粒结构示意图。
具体实施方式
[0052]
以下结合附图，用本发明的实施例来说明本发明的实质性内容，但不用来限制本发明的范围。除特殊标明外，实验例均按照常规实验条件进行。如参照分子克隆手册，相关参考文献或厂家制造商说明书相关建议条件。
[0053]
实施例1
[0054]
单功能倍半萜合酶cctps6编码基因cdna序列的获取及生物信息学分析：
[0055]
火把花rna提取，操作步骤参见分子克隆手册，获取rna，利用one-step gdna removal and cdna synthesis supermix试剂盒进行反转录合成cdna，并以特异性引物对(cctps6-f：5
’‑
atggctgcacttatcgccg-3’cctps6-r：5
’‑
ttaaatctctatttgatcgacgagc-3’)为引物进行pcr扩增，得到cctps6基因全长cdna序列(如seq id no.2)。
[0056]
单功能倍半萜合酶cctps6编码基因的开放阅读框(orf)为1650bp(seq id no.2)，编码549个氨基酸(seq id no.1)，分子量大小为63kda，该单功能倍半萜合酶cctps6基因编码的氨基酸序列包含典型的基序[rxr]、[ddxx(d,e)]和[rxx(n,d)dxx(s,t,g)xxxe]。将单功能倍半萜合酶cctps6编码基因放在ncbi中运用blastn进行同源性搜索，该基因在核苷酸
水平上进行分析比对，结果显示与唇形科植物米团花(leucosceptrum canum)倍半萜\二萜合酶lctps2的同源性为80％。
[0057]
实施例2
[0058]
β-桉叶醇合酶cctps6编码基因表达载体构建：
[0059]
使用trizol法提取火把花rna，操作步骤参见invitrogen的trizol试剂盒说明书，获取rna，以smart
tm race cdna amplification kit试剂盒中引物5
’‑
cds primer进行反转录合成cdna为模板，上述cctps6-f和cctps6-r为引物，利用高保真酶primestar hs dnapolymerase进行pcr扩增，pcr体系为50μl，反应程序为：10μl5
×
primestar hs buffer，4μl dntp mixture(2.5mm each)，1μl primer f，1μl primer r，0.5μl template cdna，0.5μlprimestar hs dna polymerase，去离子水补足至50μl。pcr程序为：98℃10sec，60℃ 15sec，72℃ 2min，35个循环，程序结束后以1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。纯化的产物和pcold-tf载体均经限制性核酸内切酶kpn i和pst i双酶切，37℃反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。酶切后的pcr产物与载体pcold-tf连接，即将β-桉叶醇合酶cctps6编码基因cdna克隆到n末端含有his标签的pcold-tf表达载体上，转化大肠杆菌dh5α，涂布在添加氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体平板进行筛选，37℃恒温培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆进行pcr及酶切验证，选出阳性克隆进行dna测序验证。
[0060]
实施例3
[0061]
β-桉叶醇合酶cctps6在大肠杆菌中的异源表达：
[0062]
将重组pcold-tf/cctps6质粒和pbba5c-mevt-mbis质粒共同转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，利用含氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb固体平板筛选转化菌落，挑取单克隆进行验证，将验证正确的单克隆接种到500ml含相同抗生素的tb培养基中，37℃震荡培养至od
600
值约为0.6，加入0.3mm iptg，16℃诱导18h，温度调节至25℃，继续培养3天，石油醚萃取，取有机层，减压蒸发浓缩至1ml，得到体内酶活反应样品，利用gc-ms对样品进行分析检测。gc-ms色谱条件：hp-5ms石英毛细管(30m
×
250μm
×
0.25μm)；柱温程序设置：起始温度80℃，保持2min；15℃/min升温至220℃，保持0min；再4℃/min升温至270℃，保持2min；以不分流模式进样，进样量为5μl，载气为氦气，氦气流量为3ml/min，柱前压为40kpa。gc-ms质谱条件：离子源ei源，离子源温度250℃，电子能量70ev，质量范围为35-550amu。
[0063]
石油醚萃取物经硅胶柱层析，以石油醚:乙酸乙酯(100:0，80:1，70:1，50:1)梯度洗脱，最终得到化合物β-桉叶醇。
[0064][0065]
实施例4
[0066]
对实施例1中β-桉叶醇合酶基因cctps6进行密码子优化和改造β-桉叶醇合酶
cctps6提升β-桉叶醇产量。
[0067]
具体方法：
[0068]
β-桉叶醇合酶基因cctps6密码子优化：
[0069]
将基因β-桉叶醇合酶基因cctps6针对e.coli表达体系进行密码子优化，将优化后的序列optcctps6构建至表达载体pcold-tf，得到重组质粒pcold-tf/optcctps6，此部分工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0070]
定点突变和同源重组技术构建突变表达载体：
[0071]
表1构建突变表达载体所需引物
[0072][0073][0074]
表2采用高保真酶phanta max dna polymerase扩增目标基因。反应体系如下：
[0075][0076]
表3涡旋混匀上述体系，离心后，按下表程序扩增目的基因：
[0077][0078]
待pcr反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，切下相应条带进行目标dna片段的回收。
[0079]
表4同源重组反应体系如下：
[0080][0081]
将各组分混匀，于37℃反应30min，冰浴3min，最后将体系转化进e.coli dh5α感受态细胞，用于菌落pcr验证测序。
[0082]
突变体在大肠杆菌中的异源表达：
[0083]
将质粒pcold-tf/optcctps6、c271s、a292s、f305a、f513a，分别和pbba5c-mevt-mbis质粒共同转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，利用含氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb固体平板筛选转化菌落，挑取单克隆进行验证，将验证正确的单克隆接种到500ml含相同抗生素的tb培养基中，37℃震荡培养至od
600
值约为0.6，加入0.3mm iptg，16℃诱导18h，温度调节至25℃，继续培养3天，石油醚萃取，取有机层，减压蒸发浓缩至1ml，得到体内酶活反应样品，利用gc-ms对样品进行分析检测，检测条件参见实施例3。
[0084]
实施例5
[0085]
利用秀丽隐杆线虫对实施例3中的化合物β-桉叶醇进行抗衰老活性评价具体方法：β-桉叶醇对野生型秀丽隐杆线虫寿命的影响：
[0086]
用野生型秀丽隐杆线虫、功能缺失突变线虫株daf-2、daf-16和skn-1和ngm固体培养基进行寿命实验。本实验采用50mm的met
·
hcl作为阳性对照，使用0.1％ dmso作空白对照，给药组为200μmβ-桉叶醇。将同步化的l1期虫子转移至各组的培养皿中。两天后，虫子进入l4期，用铂丝铲将虫子转移至新的培养皿中，20条/皿，6皿/组，恒温20℃培养，此即寿命实验第0天，记为day 0(d 0)，此时的线虫简称为p 0代线虫。l4期后，成虫期的线虫进入生殖期，在此期间，每天转移p 0代线虫至新的培养皿上，8d后，隔一天转移线虫至新皿中。实验中每天观察记录虫体的存活、死亡、剔除情况，直至所有线虫死亡。判断线虫死亡标准为铂丝铲触碰线虫头部后无反应。剔除情况包括：意外死亡、逃逸(爬壁干燥死亡)、囊袋虫、内
部孵育。每组3个重复，数据采用graphpad prism 7进行分析。
[0087]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫抵抗胁迫能力的影响：
[0088]
氧化应激。
[0089]
实验分为空白对照组(0.1％ dmso)和实验组(200μmβ-桉叶醇)。l1期线虫转接至不同培养皿，恒温20℃生长，记为d 0。3天后，分别挑取30条各组l4期线虫，将各组线虫转入含有200μm胡桃醌的新板中，恒温培养箱20℃生长，每隔1h统计线虫生存情况，直至所有线虫死亡，死亡确认方法及剔除方法与寿命实验相同，每组3个重复。
[0090]
热应激
[0091]
实验分为空白对照组(0.1％ dmso)和实验组(200μmβ-桉叶醇)。l1期线虫转接至不同培养皿，恒温20℃生长，记为d 0。3天后，分别挑取30条各组l4期线虫至相应的新板中，放进35℃的培养箱，每隔1h统计线虫生存情况，直至所有线虫死亡，死亡确认方法及剔除方法与寿命实验相同，每组3个重复。
[0092]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响：
[0093]
将同步化的l1期线虫转接至含有200μmβ-桉叶醇或0.1％ dmso的ngm平板，20℃培养60h，然后转移虫子。转移时，分别挑取各组虫子至各自的新板中，每个平板放10条虫子，6皿/组，于20℃培养，每24h转移亲代虫子至新板中，直到所有虫子不再产卵。含子代的培养皿于培养箱中继续孵育培养，待生长至l4期统计线虫数目，每组线虫3个重复。
[0094]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫脂褐素积累的影响。
[0095]
实验分为空白对照组(0.1％ dmso)和实验组(100、150、200、250和300μmβ-桉叶醇)，将同步化l1期线虫转接至不同培养皿，恒温20℃生长，记为d 0。10d后，用m9 buffer冲洗各组线虫，用左旋咪唑溶液麻醉线虫(25mm，3min)，离心后用m9 buffer清洗虫体，再将虫体转移至激光共聚焦培养皿，用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍摄，激发波长设为340nm，发射波长设为430nm，通过las x分析图片中整条线虫脂褐素的自发荧光强度，每组至少60条虫子。
[0096]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫活性氧积累的影响：
[0097]
实验分为空白对照组(0.1％ dmso)和实验组，实验组用五个浓度处理线虫(100，150，200，250和300μmβ-桉叶醇)，l1期线虫转接至不同培养皿，恒温20℃生长，记为d 0。给药5d后，m9 buffer冲洗各组线虫，通过自然沉降的办法去掉大部分的幼虫，清洗幼虫的步骤至少重复三次，得到约50μm的成虫虫体，用m9 buffer补充至约250μm，避光条件下加探针dcfh-da，探针终浓度约50μm，20℃培养箱避光孵育约50min，随后清洗虫体，左旋咪唑溶液麻醉线虫，将线虫转移至激光共聚焦培养皿，用激光共聚焦显微镜观察并拍摄照片，激发光488nm，发射波长525nm，荧光光源选择fitc，每组至少90条线虫。
[0098]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫脂肪积累的影响：
[0099]
将同步化的l1期线虫转接至含有200μm的β-桉叶醇或0.1％ dmso的ngm上，20℃培养60h。用1
×
pbs缓冲液收集并清洗线虫。加入1％多聚甲醛溶液于4℃固定1h。液氮-冰浴-水浴的顺序反复冻融2次，离心收集虫体，弃去上清液并用pbs清洗3次。加入60％异丙醇(蒸馏水稀释)，室温静置15min后离心，弃去上清液。用油红o染液对线虫进行染色，室温下避光染色4h。染色结束后用pbs洗去染液，虫体可置于载玻片上，用体式显微镜进行观察并拍摄照片，通过image j对整条线虫的染色程度进行量化。每组3个重复，每个重复随机选择至少
60条线虫进行观察。
[0100]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫体长发育、咽泵频率、头摆频率的影响：
[0101]
将同步化的l1期n2线虫，分别转移到空白对照组、给药组的ngm培养皿中，20℃培养60h。用m9 buffer清洗各组线虫，将清洗后的虫子转移至空白的ngm培养皿，做好相应标记，在体视显微镜下观察线虫，通过手动计数器统计线虫30s内的咽泵频率和头摆频率，每组至少90只线虫。随后用盐酸左旋咪唑溶液麻醉线虫(25mm，3min)，在体视显微镜下观察并拍照，每组至少90只线虫，用image j统计各组线虫的体长。
[0102]
β-桉叶醇对秀丽隐杆线虫代谢的影响：
[0103]
将同步化的l1期线虫转接至含有200μm的β-桉叶醇或0.1％ dmso的ngm平板，20℃培养60h。每组线虫用m9 buffer清洗干净，保留n2线虫虫体约400μl，每个重复加1ml甲醇，经超声破碎，离心(12000rpm，10min)，取上清，沉淀分别用500μl丙酮和石油醚超声萃取30min，合并上清，经氮气浓缩，然后用1ml甲醇复溶，并用lc-ms分析代谢产物，每组3个重复。
[0104]
β-桉叶醇对e.coli op50生长曲线的影响：
[0105]
取出e.coli op50甘油菌，于无抗性的lb固体琼脂培养基划线，倒置放进37℃恒温培养箱过夜培养，第二天挑取一个单克隆菌落，接种至100ml的lb液体培养基，37℃摇床培养至od
595
接近0.55后，取出10ml稀释1000倍备用。使用稀释后的菌液配制含有不同组分的e.coli op50悬浮菌液，本实验以含0.1％ dmso的悬浮菌液作为空白对照，含50mm盐酸二甲双胍(met
·
hcl)的菌液作阳性对照，含β-桉叶醇的菌液为实验组，β-桉叶醇的浓度分别设为100、150、200、250和300μm。使用96孔板培养悬浮菌液，每组设置5个重复，每隔一小时测od
595
，并绘制生长曲线。
[0106]
热灭活e.coli op50对秀丽隐杆线虫寿命的影响。
[0107]
在200μm的给药浓度下，以0.1％ dmso做空白对照，分别用正常的和经热灭活(121℃，15min)e.coli op50饲喂野生型秀丽隐杆线虫，将同步化的l1期虫子转移至各组的培养皿中。两天后，虫子进入l4期，用铂丝铲将虫子转移至新的培养皿中，20条/皿，6皿/组，恒温20℃培养，此即寿命实验第0天，记为day 0(d 0)，此时的线虫简称为p 0代线虫。l4期后，成虫期的线虫进入生殖期，在此期间，每天转移p 0代线虫至新的培养皿上，8d后，隔一天转移线虫至新皿中。实验中每天观察记录虫体的存活、死亡、剔除情况，直至所有线虫死亡。判断线虫死亡标准为铂丝铲触碰线虫头部后无反应。剔除情况包括：意外死亡、逃逸(爬壁干燥死亡)、囊袋虫、内部孵育。每组3个重复，数据采用graphpad prism 7进行分析。
[0108]
β-桉叶醇对daf-16、skn-1、hsp-16.2和gst-4基因的影响
[0109]
使用绿色荧光蛋白(gfp)融合株品系线虫tg356(daf-16::gfp)、ld1008(skn-1::gfp)、tg375(hsp-16.2::gfp)和cl2166(gst-4::gfp)检测β-桉叶醇对基因daf-16、skn-1、hsp-16.2、gst-4的影响。实验分为空白对照组和给药组，l1期同步化线虫转接于含100μm 5-fudr的各组培养皿，记为d 0，恒温培养5d后，m9 buffer清洗并收集线虫，转移线虫至干净的载玻片上，盐酸左旋咪唑麻醉后，盖上盖玻片，用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍摄照片，激发波长488nm，发射波长500-550nm，每组至少60条虫子，实验重复3次。daf-16有三种分布状态，分布是细胞质、质核间及细胞核三种，若一条线虫上有20个以上核荧光点，即为细胞核状态，少于20个核荧光点的为质核间状态，没有核荧光点分布的即为细胞质状态。除
了tg356是根据核荧光点判断daf-16的表达情况，其它几种线虫均以荧光强度作为判断标准，通过软件las x统计各组线虫的荧光强度，计算给药组相对于空白对照组的荧光强度。
[0110]
β-桉叶醇对衰老相关基因表达的影响：
[0111]
将同步化的l1期线虫转接至含有200μmβ-桉叶醇或0.1％ dmso的ngm(100μm，5-fudr)平板，记为d 0。6d后，m9 buffer冲洗、收集各组线虫，转移干净的虫体到无rna酶(rnase-free)的离心管中，根据艾科瑞trizol总rna提取试剂说明书提取秀丽隐杆线虫的总rna。使用one-step gdnaremoval and cdnasynthesis supermix试剂盒进行反转录，体系总体积20μl，所需成分及体积如下表：
[0112]
表5反转录所需成分及体积如下表：
[0113][0114]
按照上表添加相应成分至200μlrnase-free离心管(冰上操作)，混合离心后，进行pcr反应，反应程序如下：
[0115]
表6pcr反应程序如下
[0116][0117]
实时荧光定量pcr:
[0118]
按照2
×
master qpcr mix(sybr greenⅰ)试剂盒的说明书进行。20μlqrt-pcr反应体系如下表7。
[0119]
表7 20μl qrt-pcr反应体系
[0120][0121]
按上表将各组分加入96孔pcr板，所有操作在冰上操作,abi7500 real-time pcr system qrt-pcr程序设置如下表8(两步法反应程序)。
[0122]
表8两步法反应程序
[0123][0124]
actin-1作为内参基因，目的基因的引物如下表，用2-δδct
法计算各基因mrna相对表达量。
[0125]
表9 qrt-pcr所需引物
[0126][0127]
药物制剂实施例1-8：
[0128]
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物β-桉叶醇能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
[0129]
1.将化合物β-桉叶醇，用无水乙醇溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5-5mg/ml。
[0130]
2.将化合物β-桉叶醇，用二甲基亚砜溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
[0131]
3.将化合物β-桉叶醇，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
[0132]
4.将化合物β-桉叶醇，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0133]
5.将化合物β-桉叶醇，按常规口服液制备方法制成口服液。
[0134]
6.将化合物β-桉叶醇，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
[0135]
7.将化合物β-桉叶醇，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
[0136]
8.胶囊剂：化合物β-桉叶醇20mg，乳糖180mg，硬脂酸镁5mg。
[0137]
制备方法：将化合物与助溶剂混和均匀，过筛，把得到的混合物装入明胶胶囊,每个胶囊重205mg,活性成分含量为20mg。
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142][0143]
本发明不受上述具体文字描述的限制，应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，在此发明基础上本领域技术人员做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.β-桉叶醇合酶cctps6，其特征在于其为：(1)seq id no.1所示氨基酸序列构成的蛋白；(2)seq id no.1所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。2.权利要求1所述β-桉叶醇合酶cctps6的编码基因，其特征在于其为：(a)seq id no.2所示的核苷酸序列；(b)seq id no.2所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述的cctps6编码基因的重组载体。4.含有权利要求2所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的表达盒。5.含有权利要求2所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的转基因细胞系。6.含有权利要求2所述的β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的重组菌。7.权利要求1或2所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备含有β-桉叶醇合酶cctps6编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌中的应用。8.权利要求1或2所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备含有化合物β-桉叶醇的发酵液中的应用，其特征在于所述的应用是采用：构建含有编码所述基因的表达载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养，得到含有β-桉叶醇的发酵液。9.化合物β-桉叶醇的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：构建含有编码β-桉叶醇合酶cctps6的编码基因的表达载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养，得到含有β-桉叶醇的发酵液，通过石油醚或乙酸乙酯萃取后获得含有β-桉叶醇的浸膏，经硅胶柱层析方法分离纯化，最终得到如下结构式所示的化合物β-桉叶醇，10.权利要求1或2所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备化合物β-桉叶醇中的应用。11.权利要求1或2所述的β-桉叶醇合酶cctps6或其编码基因在制备香精香油、日用化妆品、抗衰老药物中的应用。12.权利要求9所述的倍半萜类化合物β-桉叶醇或权利要求3～8任意一项所述制备方法得到的倍半萜类化合物β-桉叶醇在制备香精香油、日用化妆品、抗衰老药物中的应用。13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述抗衰老药物包括所用大肠杆菌和秀丽线虫株。

技术总结
本发明公开了一种用于合成β-桉叶醇的萜类合酶CcTPS6和其编码基因及其产物β-桉叶醇作为抗衰老药物的应用，属于合成生物学和天然药物化学技术领域。本发明从唇形科植物火把花（Colquhounia coccinea var.mollis）出发，克隆并功能鉴定了一个合成β-桉叶醇的单功能萜类合酶CcTPS6编码基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示，对其进行密码子优化和定点突变后，与表达载体pCold-TF连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至大肠杆菌中构建成为工程细胞，实现了大肠杆菌异源高效合成化合物β-桉叶醇，本发明构建的该基因工程细胞安全稳定，生产周期短，显示出其在应用开发中的重大价值。本发明提供的CcTPS6产物β-桉叶醇具有抗衰老活性，能够在制备抗衰老药物中应用。衰老药物中应用。衰老药物中应用。


技术研发人员：刘燕 黎胜红 石琳琳 李德森 刘艳春
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/11