一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物SERPIND1及其应用的制作方法

一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物serpind1及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物serpind1及其应用。


背景技术：

2.妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，icp)是妊娠中、晚期特有的并发症，发病有明显的地域和种族差异，智利、瑞典及我国长江流域等地发病率较高。临床表现主要为皮肤瘙痒，生化检测血清总胆汁酸升高。icp对孕妇是一种良性疾病，但对围产儿可能造成严重的不良影响。胆汁酸毒性作用会使围产儿的发病率和死亡率明显升高，可发生胎儿窘迫、早产、羊水胎粪污染。此外，尚有不能预测的突发的胎死宫内、新生儿颅内出血等。
3.然而,icp的病因和发病机制仍不清楚。多项研究报道炎症、凋亡、氧化应激、脂质代谢、细胞生长和免疫反应都与icp的表现密切相关。tba水平仍然是icp诊断最重要的实验室指标，尽管患有各种肝胆疾病的患者也会出现tba升高。因此，使用血清tba水平来诊断icp具有一定的局限性，迫切需要新的诊断和预后icp生物标志物。
4.为此，本发明旨在提供一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物serpind1及其应用，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物serpind1及其应用。
6.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.本发明提供了蛋白分子serpind1作为妊娠期肝内胆汁淤积症的标志物的应用。
8.进一步地，所述蛋白分子serpind1用于制备诊断妊娠期肝内胆汁淤积症的试剂或诊断试剂盒上的应用。
9.本发明解决技术问题的难度及意义在于：
10.妊娠期肝内胆汁淤积症的病因和发病机制尚不清楚，目前血清总胆汁酸(total bile acid,tba)测定是诊断icp的唯一诊断指标，也是监测病情及治疗效果的重要指标。但是tba升高也发生在肝内胆管结石、病毒性肝炎、妊娠急性脂肪肝等其他肝胆疾病中。因此，使用血清tba水平诊断icp其敏感性和特异性都具有一定的局限性。本发明基于孕妇胎盘组织和血浆的4d-dia蛋白质组学测序，通过韦恩图取交集，我们找到了17个在胎盘和血浆中共同表达差异的候选蛋白。同时，创新性地将胎盘和血浆中的差异表达蛋白进行相关性分析及验证，首次提出蛋白serpind1可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的分子标志物，并在临床上具有良好的应用前景。
11.与现有技术相比，本方案的有益效果：
12.本发明的方案中首次提出分泌蛋白serpind1可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的分子标志物并应用于临床，克服了现有技术中使用血清tba水平来诊断icp具有的局限性，其敏感性高，特异性较佳；并且，本发明首次利用4d-dia蛋白质组学技术，第一步生信分析筛选出胎盘和血浆中表达存在差异的蛋白质，然后通过相关性分析在共同表达差异蛋白中挑选出表达呈正相关，相关性系数强的蛋白。并结合实验验证，验证发现蛋白serpind1在正常对照组和疾病组中均是表达差异蛋白，并且在胎盘和血浆中的表达呈强正相关，扩大样本实验验证与测序结果一致，证明了sepind1蛋白可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的分子标志物并开发应用于临床。
附图说明
13.图1是本发明实施例中技术原理图。
具体实施方式
14.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
15.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
16.蛋白质组学领域大牛ruedi aebersold教授开创了基于质谱的生物样本数字化的data independent acquisition(dia，又称swath)技术，帮助蛋白质组学迈向下一时代。dia技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。dia技术具有全景式扫描、数据可回溯等优势。
17.4d-dia(即dia-pasef)则是全球蛋白质组领域顶尖科学家matthias mann教授团队、ruedi aebersold教授团队、hannes博士团队(university of toronto)以及ben collins博士团队联合布鲁克共同开发的基于dia-pasef的新一代的dia升级技术。4d-dia是在传统3d(rt，m/z，intensity)分离的基础上，增加了第四个维度
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离子淌度(mobility)的分离，有效降低了谱图的复杂性，进一步增强了定量的可靠性。4d-dia将dia技术与基于timstof pro上的pasef(平行累积连续碎裂)技术相结合，可以扫描并采集几乎全部的离子信号，实现了100％的离子利用率，极大的提升了检测的灵敏度、深度以及数据的完整性。鉴于4d-dia卓越的鉴定能力、高灵敏度、高通量、高数据完整性等优点，该技术特别适合于大规模及微量样本的蛋白质组学分析。
18.技术原理：在timstof仪器中，通过液相色谱分离的肽段被离子化，引入质谱仪中并立即被捕获在双tims中(图1中的a)。淌度分离的离子到达正交加速器，快速的tof脉冲产生高分辨率的质谱图(分辨率》35000)。对于给定电荷的肽段离子，离子淌度和质量是相关的(图1中的b)。该功能被用于隔离dia的母离子质量窗口，而不会丢失各个质量窗口外的离子。鉴于低迁移率(通常为高m/z)离子被捕获在t ims出口附近，它们首先被释放，因此质量选择四极杆首先定位在高m/z位置。随着更高迁移率(通常是低m/z)离子从t ims依次释放，
lc分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套液质串联系统为：1)液相系统：easy nlc系统(thermo fisher scientific)2)质谱系统:orbitrap exploris 480(thermo fisher scientific)。缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。样品以300nl/min的流速经分析柱(nano technology column,18cm c18 column,with 1.9μm c18 resin,catalog number:26350-3)中以非线性增长的梯度分离：0-1min，2％b至8％b；1-99min，8％b至27％b；99-113min，27％b至35％b；113-117min，35％b至100％b，117-120min，100％b。电喷雾电压2056v。
33.(4)dia质谱分析：从各样品中取200ng肽段，加入irt肽段混合后进样，采用纳升流速nanoelute系统进行分离，该系统和装有captivespray离子源的质谱仪timstof pro连用。缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为100％)。色谱柱以100％的a液平衡，样品由自动进样器上样到分析柱(ionopticks,australia,25cm x 75μm,c18填料1.6μm)分离，流速为300nl/min。2小时液相梯度为：0min-5min，b液3％；5min-95min，b液线性梯度从3％-28％；95min-110min，b液线性梯度从28％-38％；110min-115min，b液线性梯度从38％-100％；115min-120min，b液维持在100％。样品经色谱分离后用timstof pro(bruker,bremen,germany)质谱仪的pasef模式进行质谱分析。分析时长为120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围100-1700m/z，离子淌度1/k0的范围是0.75-1.4v
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s/cm2，离子累积或释放时间100ms，离子利用率为100％，毛细管电压1500v，干燥气体速度3l/min，干燥温度180℃。pasef的设置为：10个ms/ms scans(总的循环时间是1.16s)，电荷范围0-5，动态排除时间0.4min，离子目标强度20000，离子强度阈值2500，cid碎裂能量42ev。对于diapasef，我们调整了仪器固件，使得在单个tims间隔时间(100ms)内能够将多个母离子分为若干个窗口。我们在每100ms diapasef扫描中设置了两个窗口，每100ms扫描两个离子淌度范围下的两个m/z窗口的离子，每个m/z窗口大小为25，共36个窗口。
34.4.生信分析及实验验证
35.(1)利用生物信息学分析蛋白质组学的数据，我们发现在胎盘组织中，与对照组相比，icp组共有713个蛋白表达存在显著性差异，其中663上调，50下调。在血浆样本中，与对照组相比，icp组共有290个蛋白表达存在显著性差异，其中241上调，49下调。通过韦恩图取交集，我们找到了17个在胎盘和血浆中共同表达差异的候选蛋白。它们分别是cd177、enpp2、gm2a、podxl、nectin1、rps7、folr2、itih3、nectin3、cd320、cd59、spint1、cd55、mmrn1、serpina7、serpind1、fmod。我们进一步对这17个在胎盘和血浆中存在共同表达差异的蛋白进行分析。我们将定量蛋白质组学的数据进行log2对数转换后，进行胎盘和血浆表达的相关性分析。结果显示有9个蛋白相关系数r值大于0.5，蛋白在胎盘和血浆中的表达具有较强的相关性。
36.(2)elisa验证：我们进一步挑选了相关系数r值大于0.6的7个蛋白，购买elisa试剂盒进行验证。其中除cd320定位于plasma membrane(质膜),serpina7、nectin1、spint1、serpind1、enpp2、itih3都定位于extracellular region。我们将elisa结果与测序结果进行相关性分析，首先进行正态性检验,满足正态分布采用person相关，不满足正态性分布采用spearman相关。结果显示除cd320和enpp2 elisa实验结果和测序结果相关性差，其他5个蛋白elisa结果和定量蛋白质组学结果有较强的相关性。
37.(3)同时分析，22例正常对照组和21例icp组血样的elisa结果。满足正态性分布，方差齐，采用独立样本t检验；不满足正态分布方差不齐，采用mann-whitney u test曼-惠特尼秩和检验。分析发现除cd320和serpina7外，其他5个蛋白在正常对照组和icp组中表达具有显著性差异。综上所述，在elisa验证的7个蛋白中，nectin1、spint1、serpind1、itih3这四个蛋白都可以作为妊娠期肝内胆汁淤积症的潜在生物标志物和治疗靶点。
38.(4)另扩大icp疾病组样本量，22例正常样本，47例i cp样本，绘制roc曲线。进一步评价四个候选蛋白对i cp的诊断效能。roc曲线显示蛋白serpind1具有最佳的曲线下面积、敏感性和特异性，因此serpi nd1具有最优诊断效能。
39.(5)将22例正常对照组和21例icp组的胎盘组织进行石蜡包埋，组织芯片制作，组织芯片染色，免疫组化结果同时也验证了serpi nd1在icp疾病组较正常组中表达下降。
40.在本实施例中，本发明使用4d-dia蛋白质组学技术，通过对正常孕妇和icp患者的胎盘组织和血浆进行蛋白质组学测序，利用生信分析结合实验验证的综合方法创新性地提出了蛋白serpind1作为i cp的分子标志物并应用于临床诊断。
41.目前临床应用总胆汁酸tba诊断妊娠期肝内胆汁淤积症具有一定的局限性，tba指标的数值易受到其他肝胆类疾病的影响，另也常存在重度妊娠期肝内胆汁淤积症患者其tba水平并不高，从而影响诊断和耽误疾病治疗。本发明结果显示serpind1具有更好的诊断icp的潜力。
42.综上所述，通过本发明的上述实施例，本发明首次将孕妇胎盘组织和血浆的蛋白质组学测序结果联合分析，利用生物信息学方法筛选共同表达差异蛋白并验证最佳候选标志物。并且，本发明首次提出分泌蛋白serpind1可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的分子标志物并应用于临床。
43.以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.蛋白分子serpind1作为妊娠期肝内胆汁淤积症的标志物的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述蛋白分子serpind1用于制备诊断妊娠期肝内胆汁淤积症的试剂或诊断试剂盒上的应用。

技术总结
本发明公开了一种妊娠期肝内胆汁淤积症蛋白分子标志物SERPIND1及其应用，涉及生物医药技术领域，其技术要点为：将蛋白分子SERPIND1作为妊娠期肝内胆汁淤积症的标志物。所述蛋白分子SERPIND1用于制备诊断妊娠期肝内胆汁淤积症的试剂或诊断试剂盒上的应用。本发明首次提出分泌蛋白SERPIND1可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的分子标志物并应用于临床，克服了现有技术中使用血清TBA水平来诊断ICP具有的局限性，其敏感性高，特异性较佳。特异性较佳。特异性较佳。


技术研发人员：张岩 陈玲燕 李京阳 尤怡澜 顾颖 曹敏恺 曹晓辉 张霞
受保护的技术使用者：无锡市妇幼保健院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/11