长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。


背景技术：

2.长林小蠹(hylurgus ligniperda fabricius)隶属鞘翅目(coleoptera)象虫科(curculionidae)小蠹亚科(scolytinae)，切梢小蠹族(tomicini)林小蠹属(hylurgus latreille)，又名红毛小蠹(red-haired pine bark beetle)，是国际重大林业检疫性害虫。长林小蠹寄主范围广、扩散能力强，严重威胁林业发展及生物安全。长林小蠹可危害松属pinus、落叶松属larix、云杉属picea等诸多针叶树种，通过取食、钻蛀坑道等方式影响林木生长。同时，该物种还可携带并传播多种微生物和线虫等病原体，如松树黑根病菌、蓝变菌、伞滑刃属线虫(bursaphelenchu spp.，与松材线虫为同一属)等，引发受害木主干以及根部的多种病害，导致树势衰退甚至树木死亡。长林小蠹的生活史隐蔽，扩散和入侵能力强。该物种主要生活于树皮内层和木质部之间，易随木材贸易进行大面积传播，是我国及世界各国在松树进口原木中截获最多的昆虫之一。同时，长林小蠹成虫的飞行能力强且适生环境广，随风飞行速度可高达2m/s，在除南极洲外各个大洲均有适生区分布。目前，长林小蠹已从起源地欧洲散至整个欧洲以及亚洲、非洲、美洲的部分国家和地区。2019年，在山东省烟台市首次发现在我国入侵并严重危害，此后，威海、泰安、青岛、日照等地不断有新的疫区被发现，被预测具有较高的进一步扩散风险。
3.植物检疫和早期监测，是防止外来有害生物入侵和扩散的最有效的手段。在实际工作中，为了将长林小蠹和国内常见小蠹类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的小蠹类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的分类特征。
4.近些年，分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支撑。目前，针对长林小蠹的分子鉴定需要利用昆虫通用引物对dna进行扩增，将产物送至基因检测公司进行核酸测序，获得测序结果后与数据库进行比对，最终经过软件分析和人工判读后明确是否为长林小蠹。此方法检测周期长，需要借助第三方公司完成，且对操作人员的技术水平有较高的要求，限制了其在海关检疫和林业部门的应用。目前尚未有准确高效的分子快速鉴定技术的报道。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于利用分子生物学手段，快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定，特别是除成虫以外其它虫态(卵、幼虫和蛹)的鉴定。
7.具体的，本发明提供的技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供了长林小蠹特异性引物，所述长林小蠹特异性引物包含
clssf2和clssr4，所述clssf2的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述clssr4的核苷酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明以长林小蠹为靶标，以纵坑切梢小蠹、横坑切梢小蠹、红脂大小蠹和华山松大小蠹为参照，设计得到了一组基于线粒体coⅰ基因序列的种特异性引物clssf2/clssr4。线粒体dna严格母系遗传，其中的细胞色素氧化酶i基因(co i)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。经验证，本发明提供的引物clssf2/clssr4具有极强的特异性，能快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定，灵敏度高。
10.第二方面，本发明提供了一种用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述的长林小蠹特异性引物。
11.优选的，所述试剂或试剂盒还包含样品基因提取试剂、2
×
taq plus pcr mastermix、无菌去离子水、阳性对照品中的至少一种。
12.基于所述的长林小蠹特异性引物的序列特点，本发明提供的用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒在长林小蠹的检测中能同样发挥良好的特异性和检测灵敏度。
13.第三方面，本发明提供了所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒在检测长林小蠹中的应用。
14.进一步的，本发明还具体提供了一种检测长林小蠹的方法，使用所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒。
15.优选的，所述检测长林小蠹的方法包括如下步骤：
16.s1、提取待测样本的基因组dna；
17.s2、以所述待测样本的基因组dna为模板，以所述clssf2和clssr4为引物，进行pcr扩增；
18.s3、分析pcr扩增产物。
19.进一步优选的，步骤s2所述pcr扩增的反应体系以25μl计，包括12μl mix，1μl上游引物clssf2，1μl下游引物clssr4，1μl基因组dna模板和10μl ddh2o；
20.优选的，在所述反应体系中，mix的浓度为2x，上游引物clssf2的浓度为100pmol/μl，下游引物clssr4的浓度为100pmol/μl，基因组dna模板的浓度为20ng/μl。
21.进一步优选的，步骤s2所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸5min。
22.进一步优选的，步骤s3所述分析pcr扩增产物的方法为：若所述pcr扩增得到261bp的条带，则判断所述待测样本的来源为长林小蠹。
23.本发明利用所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒检测长林小蠹，建立了基于ss-co i(species-specific co i,ss-co i)的长林小蠹的分子快速鉴定技术体系：首先提取小蠹样本的基因组dna，后运用普通pcr的方法，经琼脂糖凝胶电泳显像，即可实现对长林小蠹快速准确地鉴定。
24.本发明提供的检测长林小蠹的方法，可用于国内外苗木调运、货物运输等检疫工作中长林小蠹的快速检测。整个鉴定周期仅需2-3h，有助于提高检疫部门的工作效率。
25.第四方面，本发明还提供了所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒，或者所述检测长林小蠹的方法在区分长林小蠹和其他小蠹科昆虫中的应用，所述其他小蠹科昆虫包括如下至少一种：纵坑切梢小蠹、横坑切梢小蠹、红脂大小蠹、华山松大小蠹。
26.有益效果：
27.本发明提供了一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。所述长林小蠹特异性引物包含clssf2和clssr4，所述clssf2的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述clssr4的核苷酸序列如seq id no:2所示。本发明基于所述长林小蠹特异性引物，构建了长林小蠹的分子快速鉴定技术体系，利用分子生物学手段，能快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定，特别是除成虫以外其它虫态(卵、幼虫和蛹)的鉴定。本发明提供的长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒可用于国内外苗木调运、货物运输等检疫工作中长林小蠹的快速检测，灵敏度高，特异性强，有助于提高检疫部门的工作效率。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
29.图1是本发明实施例1中，五种小蠹利用coⅰ通用引物s1718/a2411进行pcr扩增产物的检测电泳图。图注：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
30.图2是本发明实施例1中，五种小蠹利用ss-coⅰ引物clssf1/clssr3扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
31.图3是本发明实施例1中，五种小蠹利用ss-coⅰ引物clssf1/clssr4扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
32.图4是本发明实施例1中，五种小蠹利用ss-coⅰ引物clssf2/clssr5扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
33.图5是本发明实施例1中，五种小蠹利用ss-coⅰ引物clssf3/clssr6扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
34.图6是本发明实施例1中，五种小蠹利用ss-coⅰ引物clssf4/clssr7扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹
t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
35.图7是本发明实施例1及实施例2中，五种小蠹利用长林小蠹特异性ss-coⅰ引物clssf2/clssr4扩增产物电泳图。图注：m：dl2000dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别为长林小蠹hylurgus ligniperda；纵坑切梢小蠹tomicus piniperda；横坑切梢小蠹t.minor；红脂大小蠹dendroctonus valens；华山松大小蠹d.armandi；泳道6的模板为无菌水。
36.图8是本发明实施例2中，利用长林小蠹特异性ss-co i引物clssf2/clssr4对不同地理区系的长林小蠹成虫扩增产物电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别代表来自山东日照、山东青岛、山东泰安、山东威海、山东烟台的长林小蠹成虫；泳道6的模板为无菌水。
37.图9是本发明实施例2中，利用长林小蠹特异性引物clssf2/clssr4扩增长林小蠹成虫、蛹、幼虫、卵dna样本电泳图。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-4泳道分别代表长林小蠹成虫、长林小蠹蛹、长林小蠹幼虫、长林小蠹卵；泳道5的模板为无菌水。
38.图10是本发明实施例2中，琼脂糖凝胶电泳检测长林小蠹特异性引物clssf2/clssr4的灵敏度结果。图注：m：dl2000 dna marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-6泳道分别代表20ng，2ng，200pg，20pg，2pg，200fg(条带较淡)的长林小蠹基因组dna；泳道7为阴性对照(20fg的长林小蠹基因组dna)。
具体实施方式
39.以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
40.实施例1
41.本实施例以长林小蠹为靶标，以其他4种在国内常见的小蠹种类作为参照，设计基于线粒体coⅰ基因序列的种特异性引物。
42.1、昆虫基因组dna的提取
43.利用dna微量提取试剂盒提取采自国内6个地区小蠹亚科5种小蠹的基因组dna，所用样品信息参见表1。
44.表1样品信息表
[0045][0046]
(1)将整个虫体放入1.5ml离心管中，加入200ul buffer pbs，用研磨棒研磨充分研磨。
[0047]
(2)加入150ul buffer pbs和0.9ul rnase a后温和地研磨30s。
[0048]
(3)收集350ul研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350ul，补充pbs至350ul。
[0049]
(4)加入150ul buffer c-l和20ul proteinase k。立即旋涡震荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。
[0050]
(5)加入350ul buffer p-d，漩涡震荡30s混合均匀，12000
×
g离心10min。
[0051]
(6)将dna制备管置于2ml离心管中，将上步中的混合液转移至制备管中，12000
×
g离心1min。
[0052]
(7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500ul buffer w1，12000
×
g离心1min。
[0053]
(8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700ul buffer w2，12000
×
g离心1min，以同样的方法，用700ul buffer w2再洗涤一次。
[0054]
(9)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000
×
g离心1min。
[0055]
(10)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，在制备管膜中央加100ul eluent，室温静置1min，12000
×
g离心1min洗脱dna。
[0056]
(11)dna浓度检测。利用超微量分光光度计检测所提dna的浓度。使用nanodrop 8000(thermo公司)，检测前用先用去离子水对检测孔进行清洗，擦干后吸取1ul dna提取时所用的洗脱缓冲液eluent进行修正，修正完成后吸取1ul样品点入检测孔中，分别测定所提
取的dna浓度。
[0057]
2、小蠹coⅰ基因序列的扩增
[0058]
合成小蠹类昆虫coⅰ基因序列扩增通用引物：
[0059]
s1718：5
’‑
ggaggatttggaaattgattagttcc-3’(序列3)
[0060]
a2411：5
’‑
gctaatcatctaaaaactttaattccwgtwg-3’(序列4)。
[0061]
pcr扩增反应使用2
×
taq plus pcr mastermix(北京睿博兴科生物技术有限公司)，总体系为25μl，各成分如表2所示：
[0062]
表2pcr反应体系
[0063]
体系组分各组分用量(μl)反应体系中各组分浓度mix122x上游引物s17181100pmol/μl下游引物a24111100pmol/μl基因组dna模板120ng/μlddh2o10-[0064]
混匀后放入pcr仪中进行扩增，pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，46℃退火1min，72℃延伸1min，共进行40个循环；最后72℃延伸10min，置于4℃下保存。
[0065]
将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压120v，时间25min，1
×
tae作为电泳缓冲液)。制备琼脂凝胶时，加入浓缩的无毒染料10000
×
aidred，使其在凝胶中的终浓度为1
×
(例如，制备100ml的凝胶，加入染料10ul)，轻轻摇匀，倒胶，并用dl2000 dna marker标记以确定是否为目标片段。最后在omega lumg显像仪器下选择波长302nm检测拍照。
[0066]
3、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计
[0067]
将pcr产物进行双向测序，得到coⅰ序列。使用bioedit对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在genebank中进行blast序列比对。根据5种小蠹的测序结果，数据库中已公开的4个不同国家(地区)来源长林小蠹，以及其他8种小蠹亚科物种的碱基序列数据(见表3)，共13种小蠹的数据进行对比分析，运用软件primer primer 6.0软件设计长林小蠹特异性ss-co i引物6对(见表4)，经筛选后确定引物1对(clssf2/clssr4)。
[0068]
clssf2:5
’‑
tgatacacgagcttacttcac-3’(序列1)
[0069]
clssr4:5
’‑
ttaaacctgtgaataggggg-3’(序列2)
[0070]
表3所用物种线粒体基因组genbank序列号信息
[0071]
物种genbank序列号hylurgus ligniperdahm002621hylurgus ligniperdaay040292hylurgus ligniperdamh093647hylurgus ligniperdaoq473387dryocoetes autographuskx035207hylastes attenuatuskx035212ips acuminatusmk988441ips calligraphusmw589547
orthotomicus lariciskx035213pityogenes bidentatuskx035211pityophthorus pubescenskx035209polygraphus poligraphusok110248
[0072]
表4引物及筛选验证结果
[0073][0074][0075]
实施例2
[0076]
本实施例基于实施例1筛选确定的clssf2/clssr4引物对，构建得到了长林小蠹的快速分子检测体系，并对该快速分子检测体系的特异性和灵敏度进行了验证。
[0077]
1、标准品的制备
[0078]
将长林小蠹的dna进行浓度和纯度测定后，配置成20ng/μl浓度的母液。并将dna母液按照(1:10)的比例依次稀释成20ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、2pg/μl、200fg/μl、20fg/μl的标准液，20fg/μl为阴性对照。所有标准液储存于4℃备用。
[0079]
2、ss-coⅰ种特异性引物的扩增
[0080]
pcr扩增反应使用2
×
taq plus pcr mastermix(北京睿博兴科生物技术有限公司)，反应体系参见表5。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃
延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸5min，置于4℃下保存。将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压120v，时间25min，1
×
tae作为电泳缓冲液)。制备琼脂凝胶时，加入浓缩的无毒染料10000
×
aidred，使其在凝胶中的终浓度为1
×
(例如，制备100ml的凝胶，加入染料10ul)，轻轻摇匀，倒胶，并用dl2000 dna marker标记以确定是否为目标片段。最后在omega lumg显像仪器下选择波长302nm检测拍照。
[0081]
表5pcr反应体系
[0082]
体系组分各组分用量(μl)各组分浓度mix122x上游引物clssf21100pmol/μl下游引物clssr41100pmol/μl基因组dna模板120ng/μlddh2o10 [0083]
3、长林小蠹ss-coⅰ引物的种特异性及灵敏度检验
[0084]
以国内常见的5种小蠹科内小蠹的dna为模板，以长林小蠹dna为阳性对照，以剩余其他4种小蠹dna和无菌水为阴性对照，检验长林小蠹ss-coⅰ引物clssf2/clssr4的特异性。以不同浓度的长林小蠹dna标准品为模板进行扩增，检验该引物的灵敏度。
[0085]
(1)长林小蠹ss-co i引物的种特异性检验
[0086]
利用co i通用引物进行pcr扩增，小蠹均扩增约693bp的产物(见图1)，而利用本发明设计的长林小蠹特异性ss-co i引物clssf2/clssr4进行pcr，仅有长林小蠹成功扩增，产物为261bp，对其它4种小蠹科内小蠹均不具有扩增能力(见图7)，表明该对引物为长林小蠹的特异性引物。
[0087]
利用长林小蠹特异性ss-co i引物clssf2/clssr4对不同地理区系(山东日照、山东青岛、山东泰安、山东威海、山东烟台)的长林小蠹成虫进行pcr扩增，根据电泳结果显示，不同地理区系的长林小蠹所提取的dna均能稳定的扩增出特异性片段(见图8)。
[0088]
以长林小蠹成虫、蛹、幼虫、卵的dna为模板，利用特异性ss-coⅰ引物clssf2/clssr4进行pcr。根据电泳结果显示，成虫、蛹、幼虫、卵所提取的dna均能稳定的扩增出特异性片段(见图9)。
[0089]
(2)长林小蠹ss-coⅰ引物的灵敏度检验
[0090]
利用不同浓度梯度的长林小蠹dna标准品进行特异性引物灵敏度检验，pcr检验的最小检测限度为200fg/μl的基因组dna(见图10)。
[0091]
综上，本发明提供的clssf2/clssr4引物对及快速分子检测体系可用于对木质包装材料、疫木中长林小蠹的快速准确鉴定，防止昆虫被人为传播到其他地区，以期能有效控制长林小蠹的进一步传播和扩散。
[0092]
以上所述的实施例是示例性的，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，但凡所属本技术领域的技术人员对所描述的技术方案做简单修改或补充或采用类似的方式替代，只要未脱离本发明技术方案内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.长林小蠹特异性引物，其特征在于，所述长林小蠹特异性引物包含clssf2和clssr4，所述clssf2的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述clssr4的核苷酸序列如seq id no:2所示。2.用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1所述的长林小蠹特异性引物。3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包含样品基因提取试剂、2
×
taq plus pcr mastermix、无菌去离子水、阳性对照品中的至少一种。4.权利要求1所述特异性引物，或者权利要求2-3任意一项所述的试剂或试剂盒在检测长林小蠹中的应用。5.检测长林小蠹的方法，其特征在于，使用权利要求1所述特异性引物，或者权利要求2-3任意一项所述的试剂或试剂盒。6.根据权利要求5所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、提取待测样本的基因组dna；s2、以所述待测样本的基因组dna为模板，以所述clssf2和clssr4为引物，进行pcr扩增；s3、分析pcr扩增产物。7.根据权利要求6所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，步骤s2所述pcr扩增的反应体系以25μl计，包括12μl mix，1μl上游引物clssf2，1μl下游引物clssr4，1μl基因组dna模板和10μl ddh2o；优选的，在所述反应体系中，mix的浓度为2x，上游引物clssf2的浓度为100pmol/μl，下游引物clssr4的浓度为100pmol/μl，基因组dna模板的浓度为20ng/μl。8.根据权利要求7所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，步骤s2所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸5min。9.根据权利要求6-8任意一项所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，步骤s3所述分析pcr扩增产物的方法为：若所述pcr扩增得到261bp的条带，则判断所述待测样本的来源为长林小蠹。10.权利要求1所述特异性引物，或者权利要求2-3任意一项所述的试剂或试剂盒，或者权利要求5-9任意一项所述检测长林小蠹的方法在区分长林小蠹和其他小蠹科昆虫中的应用，其特征在于，所述其他小蠹科昆虫包括如下至少一种：纵坑切梢小蠹、横坑切梢小蠹、红脂大小蠹、华山松大小蠹。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。所述长林小蠹特异性引物包含CLSSF2和CLSSR4，所述CLSSF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CLSSR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明基于所述长林小蠹特异性引物，构建了长林小蠹的分子快速鉴定技术体系，利用分子生物学手段，能快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定。将本发明提供的长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒用于国内外苗木调运、货物运输等检疫工作中长林小蠹的快速检测，灵敏度高，特异性强，有助于提高检疫部门的工作效率。有助于提高检疫部门的工作效率。有助于提高检疫部门的工作效率。


技术研发人员：陶静 钱铖 骆有庆 任利利 宗世祥 王建琳
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/11