一种抗菌透明敷贴

1.本发明属于抗菌药物设计和合成技术领域，具体涉及一种抗菌透明敷贴及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细菌性伤口感染是世界范围内的一个主要挑战。例如，目前全世界有超过4亿人被诊断为糖尿病。糖尿病足的发生率约为6.3％，男性的发病率比女性高。糖尿病足的临床表现包括伤口感染、组织损伤和细菌引起的炎症，导致水肿、疼痛和脓性渗出物。这种持续的炎症状态产生一系列的组织反应，使伤口不易愈合。事实上，大约20％的中度或重度糖尿病足感染会导致某种程度的截肢，这可能会威胁到生命，也会造成巨大的社会经济负担。现在没有有效的治疗糖尿病足的方法，导致全球糖尿病的医疗费用在2017年达到了7270亿美元。因此，迫切需要开发有效、安全和容易适用的方法来防治皮肤感染。
3.bodipy类光敏剂耐酸碱，有良好的光稳定性，摩尔消光系数高。通过在bodipy的母环中引入碘原子，提高系间穿越效率，允许单线激发向三线激发态转变，提高单线态氧的产生。在bodipy化合物中引入了叔胺基，使其在水溶液中易被质子化，形成阳离子季铵，而增强与带负电荷表面的细菌结合。此外，这些化合物不容易聚集，具有良好的可溶性，同时最大吸收波长为538nm，接近于太阳光的最大发射波长，无需施加额外光源照射，即可发挥抗菌活性，特别适合用于透明抗菌贴片。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服将光敏剂引入到传统创可贴中无法透光的不足，提供一种透明抗菌敷贴的制备方法。该透明敷贴能有效杀灭包括革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌在内的大多数微生物。基于良好的抗菌活性，该透明敷贴具有显著促进伤口愈合的效果。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种抗菌透明敷贴的制备方法包括以下步骤：
7.(1)光敏剂的制备。
8.(2)将光敏剂纯品用dmso配成母液，然后用生理盐水稀释与c10-30丙烯酸酯交联聚合物混合，随后负载在透明pu膜上，即得到透明抗菌敷贴。
9.所述光敏剂其化学结构式为：
10.其中x为
11.所述光敏剂的制备方法是以化合物4-羧基苯甲醛、2,4-二甲基吡咯、2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(ddq)、三乙胺(et3n)、三氟化硼乙醚(bf3·
et2o)和三氟乙酸(cf3cooh)为起始原料，合成化合物a然后以化合物然后以化合物a、i2和hio3为起始原料，合成碘代氟硼二吡咯衍生物b再以碘代氟硼二吡咯衍生物b、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺与4-甲基-1-哌嗪乙胺、n-(2-氨基乙基)哌啶、n,n-二甲基乙二胺中的任一种反应，合成含叔氨基的氟硼二吡咯衍生物类光敏剂。
12.所得氨基取代的氟硼二吡咯衍生物可作为抗菌光敏剂应用于光动力治疗中。
13.进一步地，将上述氟硼二吡咯衍生物应用于抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中。
14.进一步地，将上述氟硼二吡咯衍生物应用于杀灭抗生素耐药性细菌中。
15.进一步地，将上述氟硼二吡咯衍生物用于制备透明抗菌敷贴用于促进糖尿病耐药细菌伤口感染的愈合药物中。
16.本发明的有益效果在于：
17.(1)该类氟硼二吡咯衍生物含叔氨基，在水溶液中容易质子化，有利于化合物与细菌细胞结合，不用引入固定的阳离子基团，对哺乳动物细胞毒性较低；
18.(2)化合物的最大吸收在538nm左右，与太阳光的最大吸收波长接近，很适合做成透明抗菌敷贴。
19.(3)该氟硼二吡咯衍生物经过简单的化学修饰，其最大吸收和发射位于绿光区，组织穿透能力弱，光动力治疗时只在皮肤表面进行治疗，并不会对深层组织造成毒性，是较为理想的光敏剂；
20.(4)目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易纯化；
21.(5)合成方法简单，只需要几个步骤就可以完成，反应条件温和，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产；
22.(6)广谱的抗菌性能、对耐药细菌也有着很好的杀灭效果，对细菌高效、环境友好，对于减少药物在环境中的积累以及减弱病原微生物的耐药性有着积极作用，克服了普通活性杀菌剂高残留、高污染、易产生抗性等缺陷。
附图说明
23.图1是光敏剂氟硼二吡咯衍生物的制备路线图。
24.图2是光敏剂氟硼二吡咯衍生物对发光大肠杆菌和发光金黄色葡萄球菌的抗菌效果图。
25.图3是光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound3溶血安全性效果图。
26.图4是光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound3制备透明敷贴的效果图。
27.图5是光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound3制备的透明敷贴对糖尿病小鼠耐药细菌伤口感染实验示意图及促进伤口愈合效果。
28.图6为光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound 1的氢谱。
29.图7为光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound 2的氢谱。
30.图8为光敏剂氟硼二吡咯衍生物compound3的氢谱。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例，对本发明进行详细阐述，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
32.实施例1：光敏剂氟硼二吡咯衍生物的制备
33.氟硼二吡咯衍生物的合成路线见图1。
34.(1)将4-羧基苯甲醛、2,4-二甲基吡咯按摩尔比1:2加入无水四氢呋喃中，再加入1～2滴三氟乙酸，于室温下避光反应过夜，然后加入1当量(以4-羧基苯甲醛的摩尔量计)的2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，继续反应4小时后，将三乙胺和三氟化硼乙醚按当量为1:1(以4-羧基苯甲醛的摩尔量计)在冰浴条件下加入反应体系中，避光反应过夜后结束反应，用硅藻土过滤除去黑色固体，然后用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤粗产品，再以二氯
甲烷和甲醇为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到橙色化合物a0.81g，产率33％。结构表征：1h nmr(500mhz,cdcl3):δ＝8.24(d,j＝8.7hz,2h,arh),7.45(d,j＝8.7hz,2h,arh),6.00(s,2h,pyrrole-h),2.57(s,6h,ch3),1.37(s,6h,ch3)。
35.(2)将化合物a、i2、hio3按摩尔比为1:2.5:2加入无水乙醇中，氮气保护下60℃反应1～2小时；反应结束后减压蒸去溶剂，随后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到红色固体化合物b，其结构式为：0.32g，产率95％；结构表征：1h nmr(500mhz,cdcl3):δ＝8.27(d,j＝8.0hz,2h,arh),7.42(d,j＝8.0hz,2h,arh),2.66(s,6h,ch3),1.38(s,6h,ch3)。
36.(3)将化合物b、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺在冰浴下避光反应1h后，加入4-甲基-1-哌嗪乙胺氮气保护下继续避光反应20h。反应结束后，将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋干，以甲醇-二氯甲烷为展开剂，硅胶色谱纯化后得到粉色固体化合物1，其结构式为结构表征：1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ＝8.05(d,j＝7.6hz,2h),7.38(d,j＝7.6hz,2h),3.71(s,2h),2.91(dd,j＝48.4,18.5hz,10h),2.66(d,j
＝9.5hz,6h),2.48(s,3h),1.40(d,j＝21.2hz,6h)；
37.将化合物b、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺在冰浴下避光反应1h后，加入1-(2-氨乙基)哌啶氮气保护下继续避光反应20h。反应结束后，将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋干，以甲醇-二氯甲烷为展开剂，硅胶色谱纯化后得到粉色固体化合物2，其结构式为结构表征：1hnmr(500mhz,cdcl3)：δ＝8.03(d,j＝8.6hz,2h),7.62(s,1h),7.36(d,j＝8.6hz,2h),3.65(dd,j＝11.7,5.6hz,2h),2.73(t,j＝5.8hz,2h),2.65(s,6h),2.60(s,3h),1.75-1.65(m,4h),1.53(s,2h),1.38(s,7h)；
38.将化合物b、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、三乙胺在冰浴下避光反应1h后，加入n,n-二甲基乙二胺氮气保护下继续避光反应20h。反应结束后，将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋干，以甲醇-二氯甲烷为展开剂，硅胶色谱纯化后得到粉色固体化合物3，其结构式为结构表征：1hnmr(500mhz,cdcl3):δ＝8.01(d,j＝8.3hz,2h),7.36(d,j＝8.3hz,2h),3.62(dt,j＝8.0,5.1hz,2h),2.65(d,j＝1.3hz,8h),2.36(s,6h),1.37(d,j＝1.4hz,6h)；
39.实施例2：光敏剂氟硼二吡咯衍生物的抗菌性能
40.实验菌株分别选用革兰氏阳性的发光金黄葡萄球菌、革兰氏阴性的发光大肠杆菌、革兰氏阳性的金黄葡萄球菌(s.aurues,atcc 6358)、革兰氏阴性的大肠杆菌(e.coli,atcc 8739)与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc 33591)，具体步骤如下：
41.(1)将氟硼二吡咯衍生物溶解在dmso中作为储备液(10mmol/l)，用pbs溶液将储备液3倍梯度稀释成不同浓度加入96孔黑板中，每个浓度加三个孔作为平行组，每孔加20μl，另设加相同体积pbs的一组为对照组。
42.(2)实验组分为两组，分别为光照组和无光组，无光组实验全程避光。
43.(3)吸取180μl菌液(106cfu/ml)到各孔中，孵育30min,波长520nm、功率4mw/cm2的光源照射4min(总光剂量为1j/cm2)，用酶标仪测量发光值。
44.(4)试验重复3次，按下式计算细菌存活率：s
l
＝(le/lc)
×
100％；式中：s1—细菌存活率(％)；le-被试样品发光强度；lc-对照样品发光强度。
45.(5)使用两倍稀释法来确定化合物的mic，将化合物溶液与lb培养基进行浓度梯度稀释。取100μl含有化合物的lb培养基，加入100μl细菌溶液(最终浓度为106cfu/ml)。每组设置了三个平行的孔，孵育后进行光照。混合物在37℃下培养20小时，观察细菌的生长情况(以液体的透明度和底部没有絮状或块状的白色沉淀物为准)。没有观察到细菌生长的相应浓度为mic。
46.(6)结果显示了氟硼二吡咯系列衍生物对发光大肠杆菌和发光金黄色葡萄球菌在光照或无光条件下的半数抑制浓度(ic50)，如图2所示。无光条件下三种氟硼二吡咯系列衍生物对发光大肠杆菌的ic50为微摩尔数量级，对发光金黄色葡萄球菌的ic50为纳摩尔数量级，表1显示了氟硼二吡咯系列衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mic。其中，compound3表现出最佳的综合抗菌效果。
47.表1光敏剂氟硼二吡咯系列衍生物的抗菌效果比较
[0048][0049]
实施例3：光敏剂氟硼二吡咯衍生物(compound 3)的溶血安全性
[0050]
将450μl的pbs、450μl质量浓度为2％的红细胞悬液和100μl化合物的pbs溶液(终浓度分别为0.1、1、10、25、50和100μm)混合。在37℃培养箱中培养30分钟后，使用led平板光源，照射4分钟(剂量为1j/cm2)。同时，设计了黑暗对照组、阳性对照组(含550μl超纯水和450μl2％红细胞悬液)和阴性对照组(含550μlpbs溶液和450μl2％红细胞悬液)。将红细胞以800rpm离心10分钟，直到红细胞完全沉淀，并测量上清液在570nm处的紫外吸收。溶血率z可以通过以下公式计算。
[0051]
z(％)＝(d
t-d
nc
)/(d
pc-d
nc
)
×
100％。
[0052]
这里，d
t
、d
nc
和dpc表示样品、阴性对照和阳性对照在570nm处的吸收值。
[0053]
实施例4：光敏剂氟硼二吡咯衍生物(compound 3)构建透明抗菌敷贴
[0054]
选择c10-30烷基丙烯酸酯交叉聚合物作为抗菌剂载体。这种聚合物是一种成膜剂，可以在各种化妆品中找到，没有不良反应或刺激性危害。我们将compound 3溶解在dmso中并用生理盐水稀释。然后将混合物至终浓度为25μm，然后将混合物加载在粘接的透明聚氨酯薄膜(3.5cm
×
3cm)上，在含有胶水的一侧构建透明贴片。
[0055]
实施例5：光敏剂氟硼二吡咯衍生物(compound 3)促进糖尿病小鼠耐药菌伤口感染实验
[0056]
实验菌株选用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc 33591)。成年雄性icr小鼠
(4周龄，18
±
2g)按照动物保护和使用委员会(iacuc)的建议进行饲养和处理。将实验动物分为两组，每组6只，在21℃室温下维持12h的明暗循环。高脂饮食(12492m，购自北京博爱港生物科技有限公司)4周后，小鼠体重约为35g。每只小鼠注射120mg/kg stz(0.1m柠檬酸盐-柠檬酸三钠缓冲液，ph为4.5，作为佐剂)诱导高血糖。分别于第3、7、14天用血糖仪监测小鼠空腹血糖(fbg)水平。期间，每天更换垫料，观察记录小鼠的生活情况，保证充足的食物和水。将空腹血糖水平稳定高于≥11.2mm，且出现暴饮、暴食、暴尿、体重下降等症状的小鼠视为糖尿病小鼠，选择用于后续实验。实验的大体示意图如图所示，具体步骤如下：
[0057]
(1)在糖尿病小鼠身上建立伤口，并用mrsa细菌感染伤口。用异氟醚麻醉小鼠后，剃除背表面，并用无菌剪刀在深度约2.0mm处切除一块方形皮肤(10mm
×
10mm)。伤口没有明显出血。将对数相生长的mrsa溶液(50μl)均匀接种于小鼠创面，静置3分钟，使其被创面组织吸收。
[0058]
(2)将伤口感染的糖尿病小鼠随机分为3组，每组5只，两组给予2倍mic(25μm)浓度的贴片，一组给予贴片和led光照射(520nm,4mw/cm2,8min，总光剂量2j/cm2)，另一组不照射。第三组给予生理盐水光照治疗。伤口感染24h后，光照组用含compound 3的贴片覆盖创面，前3天每天光照1次。在整个观察期间，所有小鼠自由活动，给予足够的水和食物，并暴露在房间内的自然环境光下。每天测量并记录小鼠伤口面积和体重，每组取其平均值，连续观察12天，并且每周监测小鼠的血糖。
[0059]
(3)与使用生理盐水的对照组相比，治疗组的伤口愈合率明显加快(图5(b))。实验结果证实了compound 3的杀菌效果。
[0060]
(4)而且在520nmled光照下，伤口愈合更加明显(图5(b))。无compound3处理的伤口出现化脓，但实验组没有。
[0061]
(5)compound 3对伤口的治疗过程并没有影响小鼠体重的正常增长，如(图5(d))所示，表明compound3没有明显的生物毒性。
[0062]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种抗菌透明敷贴，其特征在于：抗菌透明敷贴负载有抗菌光敏剂，所述的光敏剂的化学结构式为：其中x为其中x为中的任一种。2.一种制备如权利要求1所述的抗菌透明敷贴的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在室温条件下，以4-羧基苯甲醛、2,4-二甲基吡咯、2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、三乙胺、三氟化硼乙醚和三氟乙酸为起始原料，合成羧基bodipy母核；然后以羧基bodipy母核、i2和hio3为起始原料，合成碘代羧基氟硼二吡咯衍生物；(2)将碘代羧基氟硼二吡咯衍生物溶解于溶液a中，发生活化反应，加入氨基小分子，搅拌，旋干，除杂，得到所述的光敏剂；所述的溶液a为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和三乙胺的混合溶液；(3)将光敏剂溶于二甲基亚砜中，稀释后与c10-30丙烯酸酯交联聚合物混合均匀，负载在透明聚氨酯膜上，得到所述的透明抗菌敷贴。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中4-羧基苯甲醛、2,4-二甲基吡咯、2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、三乙胺、三氟化硼乙醚的摩尔比为1:2:1:1:1；羧基bodipy母核、i2和hio3的摩尔比为1:2.5:2。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的氨基小分子为4-甲基-1-哌嗪乙胺、1-(2-氨乙基)哌啶、n,n-二甲基乙二胺中的任一种；碘代羧基氟硼二吡咯衍生物与氨基小分子的摩尔比为1:10。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)的敷贴中光敏剂的浓度为25μm。6.一种如权利要求1所述的抗菌透明敷贴在制备皮肤细菌感染药物中的应用。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述的抗菌透明敷贴贴在皮肤上，用520nm led平板光源进行光照。

技术总结
本发明公开了一种抗菌透明敷贴及其制备方法和应用，属于抗菌药物设计和合成技术领域。先以对羧基苯甲醛、2,4-二甲基吡咯等为原料制备单羧基取代的氟硼二吡咯母核；然后在其2,6位引入两个重原子碘，增加其三线态和单线态氧量子产率；进一步与1-(2-氨乙基)哌啶、4-甲基-1-哌嗪乙胺和N,N-二甲基乙二胺分别进行缩合反应，最后将化合物制成水溶液与C10-30丙烯酸酯交联聚合物负载在透明PU膜上，制得抗菌透明敷贴。本发明的光敏剂合成成本低，副反应少，产率较高，易提纯，透明PU膜易得，有利于工业化生产，可用于制备医用抗菌敷贴。可用于制备医用抗菌敷贴。


技术研发人员：王国栋 刘见永 黄明东 邓丽娜 袁彩 江龙光 徐芃
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/11