核酸组合物、酵母菌检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本技术涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸组合物、酵母菌检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.大曲是用来酿酒的一种原料，又称块曲或砖曲，以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物在上面生长而制成。
3.大曲是大曲酒酿造中的糖化发酵剂，含有多种微生物菌系和各种酿酒酶系。在制曲和酿酒过程中，这些微生物的生长与繁殖，形成了种类繁多的代谢产物，进而赋予各种大曲酒独特的风格与特色。因此，大曲是影响最终酒体品质的重要因素之一，成曲质量是奠定白酒品质的基础。
4.目前，在制曲过程中，成曲质量判定主要依靠感官，如大曲颜色、质地、手感等以及简单理化指标，诸如糖化力、液化力等。不同的制曲师傅对于成曲质量的判定标准不同。感官判定法虽然简便迅速，但总体而言是一种基于主观判断的方法。而诸如糖化力、液化力、发酵力等理化指标虽然避免了人为主观的影响，但是这些指标不但检测费时费力，其结果也不能完全客观的反映大曲品质的优劣。
5.因此，如何客观、快速判断大曲质量是优化大曲质量评价方法的难点。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，客观、快速检测大曲质量，本技术的第一目的在于提供一种核酸组合物，包括酵母菌的核酸扩增引物，酵母菌的核酸扩增引物包括如seq id no:1和seq id no:2所示序列的引物对。
7.本技术创造性地发现通过上述核酸组合物对大曲样本中的酵母菌进行定量分析，进而根据定量分析结果区分优曲和差曲，分析速度快且不需要依赖人力主观判断，从而实现快速、客观地检测大曲质量。
8.本技术的第二目的在于提供一种分离的核酸，所述分离的核酸含有上述核酸组合物的扩增片段；
9.在其中一个实施例中，所述分离的核酸为质粒。
10.本技术的第三目的在于提供上述核酸组合物和/或上述分离的核酸在制备酵母菌检测试剂盒中的应用。
11.在其中一个实施例中，试剂盒用于检测酵母菌的核酸含量；
12.可选的，试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：
13.实时荧光定量pcr和数字pcr。
14.在其中一个实施例中，试剂盒还包括dna提取试剂和pcr反应试剂中的至少一种。
15.在其中一个实施例中，试剂盒中分离的核酸的浓度为103copies/μl～10
12
copies/μl。
16.本技术的第四目的在于提供一种上述应用制备的试剂盒。
17.本技术的第五目的在于提供一种上述核酸组合物或者上述试剂盒在检测大曲质量中的应用。
18.本技术的第六目的在于提供一种检测大曲质量的方法，方法包括：
19.采用上述核酸组合物或者上述试剂盒检测待测大曲样本中的酵母菌；
20.根据酵母菌的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量。
21.在其中一个实施例中，大曲质量包括优曲和差曲；
22.可选地，大曲为清香型白酒大曲；
23.可选地，大曲为养曲阶段的大曲。
24.在其中一个实施例中，根据酵母菌的含量确定待测大曲样本的大曲质量具体包括：
25.若酵母菌的核酸含量在2.2
×
108copies/μl～3.7
×
108copies/μl范围内，则确定待测大曲样本为优曲；
26.若酵母菌的核酸含量在3.8
×
108copies/μl～2.0
×
109copies/μl范围内，则确定待测大曲样本为差曲。
27.本技术的第七目的在于提供一种大曲的制备方法，在养曲阶段，采用上述方法检测大曲的质量；
28.可选地，所述大曲为清香型白酒大曲。
29.本技术的第八目的在于提供根据上述制备方法制备的大曲；
30.可选地，所述大曲为清香型白酒大曲。
附图说明
31.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为本技术实施例1提供的后火曲养曲发酵阶段真菌标志物示意图；
33.图2为本技术实施例1提供的后火曲养曲发酵阶段细菌标志物示意图；
34.图3为本技术实施例2提供的感官优次曲中植物乳杆菌生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图3中a表示植物乳杆菌rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，图3中c表示植物乳杆菌在优次曲中生物量差异柱状图；
35.图4为本技术实施例2提供的感官优次曲中总酵母生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图4中a表示总酵母rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，c表示总酵母在优次曲中生物量差异柱状图；
36.图5为本技术实施例2提供的感官优次曲中扣囊复膜酵母生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图5中a表示扣囊复膜酵母rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，c表示扣囊复膜酵母在优次曲中生物量差异柱状图；
37.图6为本技术实施例2提供的感官优次曲中无根霉生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图6中a表示无根霉rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，c表示无根霉在优次曲
中生物量差异柱状图；
38.图7为本技术实施例2提供的感官优次曲中微小根毛霉生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图7中a表示微小根毛霉rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，c表示微小根毛霉在优次曲中生物量差异柱状图；
39.图8为本技术实施例2提供的感官优次曲中黄曲霉生物量在养曲中差异比较分析结果；其中，图8中a表示黄曲霉rt-qpcr的标准曲线，b表示熔解曲线，c表示黄曲霉在优次曲中生物量差异柱状图；
40.图9为本技术实施例3验证的感官优次曲中酵母生物量在养曲中差异比较分析结果。
具体实施方式
41.现将详细地提供本技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本技术进行多种修改和变化而不背离本技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
42.因此，旨在本技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本技术更广阔的方面。
43.为了至少解决上述技术问题的至少一个，本技术的第一方面提供了一种核酸组合物，包酵母菌的核酸扩增引物，酵母菌的核酸扩增引物包括如seq id no:1和seq id no:2所示序列的引物对。
44.具体地，酵母菌(saccharomyces)一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，可用于酿造生产，其能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。酵母菌在感官优良的大曲样本中绝对含量显著低于感官较差的大曲，并且在感官优良的大曲中，酵母菌的含量稳定；在感官较差的大曲中，酵母菌含量较高，不同曲块样本酵母菌含量差异也较大
45.本技术创造性地发现通过上述核酸组合物对酵母菌进行定量分析，可以根据定量分析结果区分优曲和差曲，分析速度快且不需要依赖人力主观判断，从而实现快速、客观地检测大曲质量。
46.本技术的第二方面提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸含有上述核酸组合物的扩增片段。本技术提供的分离的核酸能够作为标准品和上述核酸组合物联用实现酵母菌的定量检测。
47.一些实施方案中，所述分离的核酸为质粒。
48.本技术，术语质粒”是指是一种独立于染色体外独立复制的双链dna片段，包括复制起始位点、抗性基因和多克隆位点等，作为载体用来克隆和扩增上述核酸组合物的扩增片段。
49.具体地，质粒可以为t载体质粒。
50.一些具体实施方案中，分离的核酸为含有上述核酸组合物的扩增片段的t载体质
粒，能够作为酵母菌的标准品，进而用于酵母菌的定量分析。
51.因此，本技术的第三方面提供了上述核酸组合物和/或分离的核酸在制备酵母菌检测试剂盒中的应用，从而实现酵母菌的定量分析。
52.一些实施方案中，试剂盒用于检测酵母菌的核酸含量，以对酵母菌的核酸定量分析。
53.为了实现对酵母菌的定量检测，一些具体实施方案中，试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：
54.实时荧光定量pcr和数字pcr。
55.具体地，实时荧光定量pcr是指在pcr体系中加入荧光基团，使pcr产物和荧光相关，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
56.数字pcr即digital pcr(dpcr)是一种核酸分子绝对定量技术，该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光pcr扩增与计数式检测，相较于pcr技术，能够直接计数dna分子的个数，可实现样品的绝对定量分析。数字pcr过程主要包括样品的分散、pcr扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下，使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中，每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个dna模板分子，模板分子的分散符合泊松分布。pcr扩增结束后有荧光信号单元记为1，无荧光信号则记为0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出dna模板分子的起始浓度。该技术结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值(ct)，不受扩增效率的影响，具有很好的准确度和重现性，并且可以实现绝对定量分析。
57.一些实施方案中，试剂盒还包括dna提取试剂和pcr反应试剂中的至少一种。具体地，pcr反应试剂包括实时荧光定量pcr反应试剂和数字pcr反应试剂。
58.本技术的第四方面提供了一种上述应用制备的试剂盒，用于检测酵母菌，特别地，用于检测大曲样本中的酵母菌，从而判定大曲质量。
59.相应地，本技术的第五方面提供了一种上述核酸组合物或者上述试剂盒在检测大曲质量中的应用，从而提高检测大曲质量的客观性、准确性和速度。
60.因此，本技术的第六方面提供了一种检测大曲质量的方法，方法包括：
61.采用上述核酸组合物或者上述试剂盒检测待测大曲样本中的酵母菌，对待测大曲样本中的酵母菌的核酸含量进行定量分析，从而为传统大曲成曲质量在微生物水平建立科学的评价体系以及快速检的测方法。
62.一些实施方案中，方法还包括：根据酵母菌的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量。具体地，根据待测大曲样本中酵母菌的核酸含量的定量分析结果鉴定大曲质量，从而将待测大曲样本分为优曲和差曲。
63.一些具体实施方案中，待测大曲样本中的大曲为清香型大曲。
64.一些具体实施方案中，大曲为养曲阶段的大曲，从而通过上述酵母菌指标评价成曲质量。
65.一些实施方案中，根据酵母菌的含量确定待测大曲样本的大曲质量具体包括：
66.若酵母菌的核酸含量在2.2
×
108copies/μl～3.7
×
108copies/μl范围内，则确定
待测大曲样本为优曲；
67.若酵母菌的核酸含量在3.8
×
108copies/μl～2.0
×
109copies/μl范围内，则确定待测大曲样本为差曲。
68.相应地，本技术的第七方面提供了一种大曲的制备方法，在养曲阶段，采用上述方法检测大曲的质量，从而对养曲阶段的成曲质量进行评价。
69.一些具体实施方案中，大曲为清香型白酒大曲。
70.本技术的第八方面提供了根据上述制备方法制备的大曲，采用上述检测方法评价成曲质量，提高了优曲品质的稳定性。
71.一些具体实施方案中，大曲为清香型白酒大曲。
72.本技术通过上述酵母菌指标评价成曲质量，与人工评价拟合度达到70％以上。
73.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述。
74.实施例1清香型白酒大曲酿造过程中微生物标志物的筛选
75.1、仪器：nanodrop 2000微量紫外分光光度计、实时定量pcr系统、高速冷冻离心机、电子天平、制冰机、超纯水机、涡旋仪
76.2、微生物多样性分析：通过扩增子分析研究清香型大曲成曲微生物群落结构变化，进而筛选出微生物标志物。
77.1)样本取样：实验样品采取自山西省杏花村汾酒厂股份有限公司同一批次发酵低温大曲(后火曲)，对制曲8个阶段：卧曲(wq)(0天)、上霉(sm)(3day)、晾霉(lmⅰ、ⅱ)(5～8天)、潮火(ch)(13天)、大火(dh)(17天)、后火(hh)(20天)、养曲(yq)(24天)、贮曲(zq)(3个月)进行大曲取样。其中，晾霉阶段在生产上持续时间较长，并且被认为是一个关键节点，因此在此阶段进行了两次取样。其他阶段均取一次样本，时间为该阶段结束时。所取样本基于外观分为两组，一组为生产上被认为外观表现出色的样本，另一组为外观表现很差的样本。
78.使用fast soil kit试剂盒(mp biomedicals,santa ana,ca,united states)，依照说明书提取样本dna。提取的dna保存在-20℃，后续用于illumina miseq扩增子测序。用nanodrop 2000微量紫外分光光度仪测定dna的浓度和纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳评估dna质量。使用通用引物组338f和806r扩增细菌16s rrna基因的v3-v4高变区，用引物its1f和its2扩增真菌rrna内部转录间隔(its)区域。测序后，经去除引物和barcode序列后对每个样品的reads进行拼接得到原始序列，再经过原始序列质量过滤和嵌合体去除得到有效数据，并采用qiime2的classify-sklearn算法将得到的asvs与数据库比对从而得到每个asv的物种信息并对每个asv使用预先训练好的naive bayes分类器对比细菌16s rrna基因数据库greengenes(版本13.8)和真菌its数据库unite(版本7.1)进行物种注释。
79.具体步骤：
80.以稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，new england biolabs公司的high-fidelity pcr master mix with gc buffer，和高效高保真酶进行pcr，确保扩增效率和准确性。
81.引物对应区域：
82.16s v4区引物(515f和806r)：鉴定细菌多样性；
83.18s v4区引物(528f和706r)：鉴定真核微生物多样性；
84.its1区引物(its5-1f-f和its1-1f-r)：鉴定真菌多样性；
85.此外，扩增区域还包括：16s v3-v4/16s v4-v5/16sv5-v7；古菌16s v4-v5/古菌16s v8；18s v9和its2区。
86.2)pcr产物的混样和纯化
87.pcr产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
88.3)文库构建和上机测序
89.使用dnapcr-free sample preparation kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和q-pcr定量，文库合格后，使用novaseq6000进行上机测序。
90.数据处理部分：
91.(1)测序数据处理
92.根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用flash(v1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/flash/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(raw tags)；拼接得到的raw tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(clean tags)。参照qiime(v1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的tags质量控制流程，进行如下操作：a)tags截取：将raw tags从连续低质量值(默认质量阈值为《＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)tags长度过滤：tags经过截取后得到的tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于tags长度75％的tags。经过以上处理后得到的tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effective tags)。
93.(2)asv降噪和物种注释
94.利用uparse软件(uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部effective tags进行降噪分析，默认选择dada2，dada2算法的核心在于序列校正，二代测序的错误是随机发生的(即，任意两条序列的测序错误相对是随机发生的、一条序列的任意两个位置的测序错误也是随机发生的，不存在关联性)，符合泊松分布，通过机器学习算法将认为测序错误的序列去除。对asvs序列进行物种注释，用qiime2中的naive bayes方法与silva138(http://www.arb-silva.de/)的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用muscle(version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有asvs代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的alpha多样性分析和beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
95.(3)样本复杂度分析(alpha diversity)
96.使用qiime软件(version 1.9.1)计算observed-otus，chao1，shannon，simpson，ace，goods-coverage，pd_whole_tree指数，使用r软件(version 2.15.3)绘制稀释曲线，rank abundance曲线，物种累积曲线并使用r软件进行alpha多样性指数组间差异分析；
alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
97.alpha多样性指数具体描述如下：
98.计算菌群丰度(community richness)的指数有:
99.chao-the chao1 estimator(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.div ersity.alpha.chao1)；
100.ace-the ace estimator(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.divers ity.alpha.ace)；
101.计算菌群多样性(community diversity)的指数有:
102.shannon-the shannon index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon)；
103.simpson-the simpson index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson)；
104.测序深度指数有:
105.coverage-the good’s coverage(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage)；
106.系统发育多样性的指数有：
107.pd_whole_tree-pd_whole_tree index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.faith_pd.html？hi ghlight＝pd#skbio.diversity.alpha.faith_pd)
108.(4)多样本比较分析(beta diversity)
109.用qiime软件(version 1.9.1)计算unifrac距离、构建upgma样本聚类树。使用r软件(version 2.15.3)绘制pca，pcoa和nmds图。pca分析使用r软件的ade4包和ggplot2软件包，pcoa分析使用r软件的wgcna，stats和ggplot2软件包，nmds分析使用r软件的vegan软件包。使用r软件进行beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
110.lefse分析使用lefse软件，默认设置lda score的筛选值为4。metastats分析使用r软件在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)下，做组间的permutation test，得到p值，然后利用benjamini and hochberg false discovery rate方法对于p值进行修正，得到q值。anosim，mrpp和adonis分析分别使用r vegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。amova分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用r软件做组间t_test检验并作图。
111.5)成曲质量评价微生物标志物筛选(养曲结束)
112.东方伊萨酵母(issatchenkia_orientalis)、匍枝根霉(rhizopus_stolonifer)、葡萄牙棒孢酵母(clavispora_lusitaniae)、异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces_anomalus)、微小根毛霉(rhizomucor_pusillus)、酵母(kazachstania_bulderi)、横梗霉属(lichtheimia_sp)、黄曲霉(aspergillus_flavus)、阿氏丝孢酵母(trichosporon_
asahii)、橙黄色嗜热子囊属(thermoascus_aurantiacus)、无根霉(rhizopus_arrhizus)在优次曲中差异显著，可作为此阶段的标志真菌。
113.植物乳杆菌(lactobacillus_plantarum)在优次曲中差异显著，可作为此阶段的标志细菌。
114.实施例2后火曲发酵过程中微生物标志物快检技术的开发
115.1、各真菌标志物和细菌标志物的引物序列如下表1和表2所示：
116.表1
117.名称 引物(5
’‑3’
)p1总细菌cctacgggaggcagcag(seq id no:5)p2总细菌attaccgcggctgctgg(seq id no:6)tlac1乳酸菌acctgatggcaactaaagataggg(seq id no:7)tlac2乳酸菌agaacaccagtggcgaagg(seq id no:8)b1芽孢杆菌ttgacatcctctgacaaccct(seq id no:9)b2芽孢杆菌gaatgctggcaactaagatca(seq id no:10)y1总真菌gcggtaattccagctccaatag(seq id no:11)y2总真菌gccacaaggactcaaggttag(seq id no:12)sac1酵母ggtggtggtgcatggc(seq id no:1)sac2酵母tgtacaaagggcagggacg(seq id no:2)act1放线菌cgcggcctatcagcttgttg(seq id no:13)act2放线菌attaccgcggctgctgg(seq id no:14)m1霉菌ttgtgcgctatcggtctctggcc(seq id no:15)m2霉菌tgggaggtatatgtcttctaaagctaa(seq id no:16)
118.表2
119.120.[0121][0122]
2、qpcr反应体系
[0123]
real-time qpcr采用了bio-rad ssofast eva green mix预混液，均采用了20μl的反应体系，具体如下：
[0124]
1)对于黄曲霉rt-qpcr，采用的体系如下：
[0125][0126]
2)对于植物乳杆菌、总酵母、扣囊复膜酵母、无根霉、微小根毛霉进行rt-qpcr，采用的体系如下：
[0127][0128][0129]
3、qpcr反应程序
[0130]
1)植物乳杆菌qpcr，采用如表3的程序：
[0131]
表3
[0132][0133]
绘制熔解曲线，从62℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。2)扣囊复膜酵母qpcr，采用如下表4的程序：
[0134]
表4
[0135][0136]
绘制熔解曲线，从60℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。3)总酵母、无根霉、微小根毛霉qpcr，采用如下表5的程序：
[0137]
表5
[0138][0139]
绘制熔解曲线，从60℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。4)黄曲霉qpcr，采用如下表6的程序：
[0140]
表6
[0141][0142]
绘制熔解曲线，从62℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。
[0143]
4、建立快检方法
[0144]
rt-qpcr方法的建立：以含有目的片段的单拷贝微生物标志物质粒作为标准品，梯度稀释的标准品可建立定量标准曲线，以此计算大曲中微生物标志物的拷贝数范围。具体实验流程如下：
[0145]
1、标准样品质粒的制备：
[0146]
1)目标片段的扩增，上面给出了不同微生物目标片段的引物，进行pcr；
[0147]
2)胶回收；
[0148]
3)构建t载体：
[0149]
使用质粒为：19-t(takara bio，dalian)质粒载体
[0150]
连接体系：
[0151][0152]
连接条件：16℃连接30min。
[0153]
4)连t产物转化大肠杆菌感受态细胞
[0154]
5)质粒提取(天根试剂盒)
[0155]
为了检测样品中酵母菌总数，荧光信号检测的线性范围为103～10
12
copies/μl。以上述构建好的质粒作为标准样品，梯度稀释，共设置10个梯度，标准样品的定量采用紫外分光光度计法，具体计算公式如下：
[0156][0157]
其中：c
标
表示dna模板浓度(copies/μl)；
[0158]
a为0.05，表示换算系数，即1od
260
nm＝0.05μg/(μl双链dna)；
[0159]
n为稀释倍数；
[0160]
6.02
×
10
23
为阿佛加德罗常数；
[0161]
碱基对数需加上t载体骨架的碱基对数；
[0162]
在做qpcr的时候标准样品和待测样品一起上机检测，以标准样品为模板，反应体系及条件上文已给出，每个样品进行3次重复。待反应完成时，以阈值循环数ct(即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)作为横坐标，标准样品浓度作为纵坐标绘制标准曲线。在定量pcr的最后一步需绘制熔解曲线，考察引物对目标序列扩增的特异性。
[0163]
5、植物乳杆菌快检技术的开发
[0164]
标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9812，拟合程度符合定量要求。植物乳杆菌在不同感官后火曲养曲中生物量差异如图3中b所示，感官较差的曲与感官优的曲中植物乳杆菌的生物量差异极显著，优曲中其生物量为5.24
×
107copies/g大曲，而次曲中其生物量为2.33
×
108copies/g大曲，是优曲的4.44倍，且qpcr结果与测序结果一致。因此，植物乳杆菌可作为成曲质量优劣的微生物标志物。优曲中的植物乳杆菌生物量阈值在5
×
107copies/g大曲以下，次曲中其生物量阈值在1
×
108copies/g大曲以上。
[0165]
6、总酵母快检技术的开发
[0166]
熔解曲线结果显示产物特异。标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9988，拟合度符合定量要求。总酵母在不同感官后火曲养曲中生物量差异如图4中c所示，优曲中总酵母的生物量为9.82
×
109copies/g大曲，而次曲中总酵母的生物量阈值在1.68
×
10
10
copies/g大曲以上，次曲中总酵母的生物量是优曲的1.72倍，二者之间具有显著差异。
[0167]
7、扣囊复膜酵母快检技术的开发
[0168]
标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9719，拟合度符合定量要求。扣囊复膜酵母在不同感官后火曲养曲中生物量差异如图5中b所示，感官优的曲中其生物量为7.97
×
108copies/g大曲；而感官较差的曲中其生物量在1.36
×
109copies/g大曲以上，与优曲中扣囊复膜酵母的生物量相比显著上升。
[0169]
8、无根霉快检技术的开发
[0170]
熔解曲线结果显示产物特异。标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9905，拟合度符合定量要求。无根霉在不同感官后火曲养曲中的生物量差异如图6中c所示，感官较差的曲与感官优的曲中无根霉的生物量具有显著差异，次曲中无根霉的生物量为9.8
×
109copies/g大曲，优曲中无根霉生物量为1.28
×
10
10
copies/g大曲，是次曲的1.31倍。但是两者差异不足以作为养曲阶段指示发酵是否正常的微生物标志物。
[0171]
9、微小根毛霉快检技术的开发
[0172]
熔解曲线结果显示产物特异。标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9838，拟合度符合定量要求。微小根毛霉在不同感官后火曲养曲中的生物量差异如图7中c所示，感官优的曲其生物量在1.45
×
107copies/g大曲以上，而感官较差的曲其生物量为9.25
×
106copies/g大曲，二者之间具有显著差异。
[0173]
10、黄曲霉快检技术的开发
[0174]
熔解曲线结果显示产物特异。标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数r2为0.9936，拟合度符合定量要求。黄曲霉在不同感官后火曲养曲中的生物量差异如图8中c所示，感官优的曲其生物量为1.72
×
107copies/g大曲以上，而感官较差的曲其生物量为7.75
×
106copies/g大曲，二者间差异并不显著。
[0175]
实施例3基于微生物标志物成曲质量评价验证
[0176]
对大曲样本随机取样，样本量为40个，感官优曲为20个，感官差曲为20个，基于上述微生物标志物进行检测，除在上述分析中含量有差异显著的微生物在验证中并未表现出规律性，如植物乳杆菌、扣囊复膜酵母、无根霉和微小根毛霉；而酵母菌检测结果作为区分优次成曲的微生物标志物表现稳定。
[0177]
酵母菌在感官优良的大曲样本中绝对含量显著低于感官较差的大曲，并且在感官优良的大曲中，酵母菌的含量稳定，主要在3.0
×
108copies/μl dna左右浮动；在感官较差的大曲中，酵母菌含量较高，不同曲块样本酵母菌含量差异也较大。其中，酵母菌含量最高为1.8
×
109copies/μl dna，最低为1.5
×
108copies/μl dna。
[0178]
从图9箱式图中能够明显看出，优曲中的酵母菌含量更加集中和稳定，均值显著低于差曲；差曲中酵母含量分布较为分散。根据上述结果制定优差曲中酵母菌含量标准：2.2-3.7
×
108copies/μl dna为优曲，3.8
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108copies/μldna-2.0
×
109copies/μl dna为差曲。以上述标准评判，与感官优曲的拟合度为80％，与差曲的拟合度为70％。
[0179]
基于以上结果，本实施例筛选出酵母菌作为评价养曲阶段后火曲较为可靠的微生物指标，与人工评价拟合度达到70％以上。
[0180]
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0181]
以上实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能
因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.核酸组合物，其特征在于，包括酵母菌的核酸扩增引物，所述酵母菌的核酸扩增引物包括如seq id no:1和seq id no:2所示序列的引物对。2.分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸含有权利要求1所述的核酸组合物的扩增片段；可选地，所述分离的核酸为质粒。3.权利要求1所述的核酸组合物和/或权利要求2所述的分离的核酸在制备酵母菌检测试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测酵母菌的核酸含量；可选地，所述试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：实时荧光定量pcr和数字pcr。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中的组分满足以下特征(1)和(2)中的至少一个：(1)所述试剂盒还包括dna提取试剂和pcr反应试剂中的至少一种；(2)所述分离的核酸的浓度为103copies/μl～10
12
copies/μl。6.根据权利要求3～5任一项所述的应用制备的试剂盒。7.权利要求6所述的试剂盒在检测大曲质量或制备大曲中的应用。8.一种检测大曲质量的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求6所述的试剂盒检测待测大曲样本中的所述酵母菌；根据酵母菌的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量；可选地，所述大曲质量包括优曲和差曲；可选地，所述大曲为清香型大曲；可选地，所述大曲为养曲阶段的大曲。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据酵母菌的含量确定待测大曲样本的大曲质量具体包括：若酵母菌的核酸含量在2.2
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108copies/μl～3.7
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108copies/μl范围内，则确定所述待测大曲样本为优曲；若酵母菌的核酸含量在3.8
×
108copies/μl～2.0
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109copies/μl范围内，则确定所述待测大曲样本为差曲。10.一种大曲的制备方法，其特征在于，在养曲阶段，采用权利要求8或9所述的方法检测大曲的质量；可选地，所述大曲为清香型白酒大曲。

技术总结
本申请涉及一种核酸组合物、酵母菌检测试剂盒及其应用，核酸组合物，包括酵母菌的核酸扩增引物，酵母菌的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对。本申请的核酸组合物能够用于对大曲样本中的酵母菌进行定量分析，进而区分优曲和差曲，从而实现快速、客观地检测大曲质量。客观地检测大曲质量。客观地检测大曲质量。


技术研发人员：杨凯环 相里加雄 曹苗文 薄涛 李骐 薛梓宸 范三红 曹瑞红 李慧 宗恩祥
受保护的技术使用者：山西杏花村汾酒厂股份有限公司
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/10/11