一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法及应用与流程

1.本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法及应用。


背景技术：

2.雪衣藻(chlamydomo nasnivalis)属于绿藻门(chlorophata)，绿藻纲(chlorophyceae)，团藻目(volvocales)，常年生活在生长在高山、极地等终年积雪地带的一类，是一种特殊的单细胞低等植物类群。雪衣藻富含高质量蛋白质、亚麻酸、多糖、核苷酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质，表现出抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎等作用。
3.寡糖是一类含有2～10个糖苷键聚合而成的化合物，在天然植物中广泛存在，因其具有提高机体免疫力、调节肠道的微生态环境、相对分子量较低、水溶性好、易吸潮、生物活性高等优势，还具有纯天然、无污染等特点，使寡糖类物质广泛运用于食品、医疗、保健品等行业。绿色阶段的雪衣藻胞体内糖类成分含量高，可以通过生物发酵技术从雪衣藻中分离获取得到雪衣藻寡糖。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖及其制备方法，其具有皮肤菌群调控、皮肤屏障修复、舒缓皮肤炎症的作用，可被广泛应用于化妆品产品。
5.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
6.第一方面，本发明提供一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法，所述雪衣藻寡糖通过生物发酵技术从极地藻类雪衣藻中获取，具体步骤如下：
7.s1菌种活化及培养：将保存的枯草芽孢杆菌自斜面取出，转入三角瓶进行种子摇瓶培养(lb培养基)；
8.s2发酵：当菌悬液od
600
值在3-5时取菌悬液按照体积分数10-20％的接种量接种于含15-30wt％雪衣藻粉、2-3wt％葡萄糖的发酵培养基中。30℃静止培养，当发酵液od
600
在120-140时中止发酵，将发酵液于8000-10000r/min离心10-15min，分别收集菌体与发酵上清液；
9.s3菌体破壁：将发酵菌体进行均质破壁，得到菌体破壁提取液；
10.s4提取精制：将所述步骤s2发酵上清液与所述步骤s3菌体破壁提取液混合，蒸发后得到干燥产物，使用石油醚溶解干燥产物，过滤，将滤渣用70～90％乙醇溶解，过滤蒸发得到雪衣藻寡糖。
11.优选的，所述步骤s1中的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.26359，保藏日期为2022年12月30日。
12.优选的，所述步骤s1中种子摇瓶培养的接种量为1-2％，于37
±
2℃，220-240rpm下培养15-20h。
13.优选的，所述步骤s3中均质破壁的压力为80-100mpa。
14.优选的，所述步骤s4中雪衣藻寡糖的纯度为52-68％。
15.第二方面，本发明提供一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖，其采用如上所述的雪衣藻寡糖的制备方法制得。
16.本发明的雪衣藻寡糖具有调节皮肤菌群平衡、修复皮肤屏障功、舒缓皮肤炎症的作用，所述具有调节菌群作用为抑制有害菌的生长与增殖和促进益生菌的生长与增殖；所述有害菌除金黄色葡萄球菌外还包括但不限于痤疮丙酸杆菌和马拉色菌等；所述益生菌除表面葡萄球菌外还包括但不限于双歧杆菌等。
17.所述皮肤屏障修复的作用具体为促进皮肤表皮相关细胞的增殖和迁移。
18.所述舒缓皮肤炎症的作用具体为舒缓化学刺激物如表面活性剂等引发的皮肤炎症；抑制炎症促进因子tnf-α、il-1β、il-8mrna的表达，促进炎症抑制因子il-13的表达；通过促进细胞自噬的途径来缓解皮肤炎症。
19.第三方面，本发明提供一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖在具有皮肤微生态调节、皮肤屏障修复、舒缓皮肤炎症的功能性化妆品方面的应用。
20.优选的，所述功能性化妆品包括但不限于洁面乳、爽肤水、化妆水、乳液、面膜、面霜和精华液等。
21.本发明的有益效果是：
22.本发明所述雪衣藻寡糖，通过生物发酵技术获取，来源绿色，人体安全性高。
23.本发明所述雪衣藻寡糖，能够显著抑制皮肤有害菌的增殖，促进益生菌的生长与增殖，能够调节皮肤微生态，有利于皮肤稳态的建立和调控。
24.本发明所述雪衣藻寡糖，能够修复和巩固皮肤屏障、舒缓皮肤炎症，有效地改善皮肤状态和维护皮肤健康。
附图说明
25.图1为雪衣藻寡糖对特征菌种的调控作用；
26.图2为雪衣藻寡糖作用于斑马鱼断尾相对修复率；
27.图3为雪衣藻寡糖对斑马鱼炎症模型的舒缓作用；
28.图4为雪衣藻寡糖对炎症因子mrna表达水平的作用；
29.图5为雪衣藻寡糖对细胞自噬相关通路关键蛋白的作用。
30.具体实施方法
31.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
32.实施例1
33.菌种活化及培养：将保存的枯草芽孢杆菌cgmcc no.26359自斜面取出，转入三角瓶进行种子摇瓶培养(lb培养基)，接种量1％，35℃、220rpm培养15h。。
34.发酵：当菌悬液od
600
值在3时取菌悬液按照体积分数10％的接种量接种于含15wt％雪衣藻粉、2wt％葡萄糖的发酵培养基中。28℃静止培养，当发酵液od
600
在120时中止发酵，将发酵液于8000r/min离心10min，分别收集菌体与发酵上清液。
35.菌体破壁：将发酵菌体在80mpa的压力下进行均质破壁，得到菌体破壁提取液。
36.提取精制：将发酵上清液与菌体破壁提取液混合后蒸发后得到干燥产物，使用石油醚溶解干燥产物，过滤后将滤渣用70％乙醇溶解后过滤蒸发得到雪衣藻寡糖，其纯度在52％。
37.实施例2
38.菌种活化及培养：将保存的枯草芽孢杆菌cgmcc no.26359自斜面取出，转入三角瓶进行种子摇瓶培养(lb培养基)，接种量1.5％，37℃、230rpm培养17.5h。。
39.发酵：当菌悬液od
600
值在4时取菌悬液按照体积分数15％的接种量接种于含22wt％雪衣藻粉、2.5wt％葡萄糖的发酵培养基中。30℃静止培养，当发酵液od
600
在130时中止发酵，将发酵液于9000r/min离心12min，分别收集菌体与发酵上清液。
40.菌体破壁：将发酵菌体在90mpa的压力下进行均质破壁，得到菌体破壁提取液。
41.提取精制：将发酵上清液与菌体破壁提取液混合后蒸发后得到干燥产物，使用石油醚溶解干燥产物，过滤后将滤渣用80％乙醇溶解后过滤蒸发得到雪衣藻寡糖，其纯度在61％。
42.实施例3
43.菌种活化及培养：将保存的枯草芽孢杆菌cgmcc no.26359自斜面取出，转入三角瓶进行种子摇瓶培养(lb培养基)，接种量2％，39℃、240rpm培养20h。。
44.发酵：当菌悬液od
600
值在5时取菌悬液按照体积分数20％的接种量接种于含30wt％雪衣藻粉、3wt％葡萄糖的发酵培养基中。32℃静止培养，当发酵液od
600
在140时中止发酵，将发酵液于10000r/min离心15min，分别收集菌体与发酵上清液。
45.菌体破壁：将发酵菌体在100mpa的压力下进行均质破壁，得到菌体破壁提取液。
46.提取精制：将发酵上清液与菌体破壁提取液混合后蒸发后得到干燥产物，使用石油醚溶解干燥产物，过滤后将滤渣用90％乙醇溶解后过滤蒸发得到雪衣藻寡糖，其纯度在68％。
47.实施例4
48.对实施例2中得到的雪衣藻寡糖进行调控皮肤微生态功效测试
49.一、体外抑菌实验
50.菌株活化：预先将特征菌种(表皮葡萄球菌，乳酸杆菌，金黄色葡萄球菌，痤疮丙酸杆菌，马拉色菌，念珠菌)分别接入相对应的营养琼脂培养基进行活化，置于37℃恒温培养箱中培养24h，然后分别挑取1环已活化好的菌种放入9ml无菌水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液，浓度约为107cfu/ml，备用。
51.测量抑菌圈：将定性滤纸加工成9mm的圆形滤纸片，放入干燥的平皿中，121℃干热灭菌20min后，浸入不同浓度的雪衣藻寡糖水溶液中(1，2，10，20mg/ml)，使其充分吸收，备用；将已灭菌的营养琼脂培养基熔化后倒入平皿中，待冷却凝固后，用取液器分别加入0.4ml菌悬液，然后用无菌涂布器涂布均匀，用无菌镊子夹取浸泡处理过的滤纸片贴在上述含菌平皿中，每一浓度的滤纸片间隔一定距离，并以浸泡过无菌水的滤纸片作为对照；每个平皿贴5片，每一种菌种做3个重复；然后将各平皿倒置于37℃恒温培养箱中48h；取出，测量抑菌圈的直径。
52.二、体外促生长实验
53.菌株活化：将益生菌菌株表面葡萄球菌接入mrs固体培养基中，于37℃培养16h后，挑取单菌落接入mrs液体培养基中于37℃培养18h活化，连续传代2次得到实验用菌液；6000rpm离心菌体8min，0.9％生理盐水洗涤菌体两次后得到菌体用于后续实验。
54.菌株生长情况测定：以菌体吸光度值的变化，考察不同浓度雪衣藻寡糖对益生菌体外增殖的效果，分别接种定量浓缩菌液(终浓度约为5
×
106cfu/ml)于分装好的、mrs液体培养基及mrs改良培养基中，37℃厌氧培养12h后取样测定吸光度值；吸光度测定波长为600nm，无菌培养基做空白对照；每组做三次平行实验。
55.三、实验结果
56.如图1所示，雪衣藻寡糖能够显著抑制有害菌金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌，对真菌马拉色菌及念珠菌也有一定的抑制作用，对有益菌双歧杆菌的促进效果显著，对表皮葡萄球菌也有一定的促进作用。
57.结果表明，雪衣藻寡糖能够通过抑制有害菌、促生有益菌来调控皮肤菌群，平衡皮肤微生态。
58.实施例5
59.对实施例2中得到的雪衣藻寡糖进行进行皮肤屏障修复功效测试
60.一、斑马鱼断尾修复
61.准备：2dpf的野生型斑马鱼幼鱼。
62.断尾：在显微镜下，使用手术刀切除幼鱼尾鳍部分，不可切到幼鱼脊柱。使用imageview拍照记录。
63.给药：将断尾后幼鱼加入2ml含不同浓度样品的水溶液中常规培养。24h后使用同样参数在显微镜下用imageview拍照记录。
64.计算相对修复率：
[0065][0066]
二、实验结果
[0067]
根据图2，在斑马鱼断尾修复实验中，雪衣藻寡糖能够显著促进修复作用，呈现出剂量-效应关系。
[0068]
以上结果表明，雪衣藻寡糖对皮肤屏障具有修复维护的作用。
[0069]
实施例6
[0070]
对实施例2得到的雪衣藻寡糖进行炎症舒缓功效测试
[0071]
一、斑马鱼皮肤炎症模型
[0072]
选取2dpf转基因中性粒细胞绿色荧光品系斑马鱼于六孔板中，每孔20尾，设置空白对照组、模型组、高、中、低浓度雪衣藻寡糖组，加入60μg/ml的sls，建立斑马鱼皮肤浸润炎症舒缓模型，与空白对照组相比，模型对照组斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量明显增多，提示斑马鱼舒缓模型建立成功。高、中、低浓度雪衣藻寡糖处理24h后，在荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒细胞数量的统计学分析结果评价雪衣藻寡糖的炎症舒缓功效。
[0073]
二、利用qpcr技术检测细胞炎症模型中的炎症因子tnf-α、il-1β、il-8、il-13mrna的表达水平
[0074]
细胞培养：选取hacat细胞(购自中国细胞资源库)。选用dmem培养基，培养基的配
制中需加入10％的血清+1％的双抗。选用细胞培养瓶进行培养，每瓶加入5～6ml培养基，每2-3天传代一次。待细胞生长至培养瓶底面80％-90％时，使用0.25％的胰酶消化，吹匀细胞，并稀释至106个/ml。后将细胞悬液转移至60mm培养皿中，每皿加入3ml细胞悬液，混匀后静置。待细胞全部沉底后，置于37℃，5％co2培养箱培养，培养24h后加药。
[0075]
实验分组：共分为六组，实验设置空白对照组、模型组与四组样品组，样品组中雪衣藻寡糖浓度分别为1，2，10，20mg/ml。模型组与样品组中都添加sls作为炎症诱导剂。
[0076]
rna提取：采用trizol法进行rna提取。首先，取出加药24h的培养皿，移除培养基，后使用4℃预冷的pbs洗涤两次。每皿加入1ml trizol，吹下贴壁细胞，后移入无酶1.5ml离心管中，静置3min。再加入380μl的三氯甲烷，涡旋混匀，静置3min。使用冷冻离心机，设置程序4℃/12000g/15min，完成后小心转移上层液体(》500μl)至新的无酶1.5ml离心管中。按照转移液体的体积，1:1加入异丙醇，颠倒混匀，后放入-20℃冰箱静置10～15min。再离心，4℃/12000g/10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇(depc配制)，洗涤沉淀，后离心，4℃/12000g/5min，尽可能移干液体。最后晾干沉淀rna，待rna略干之后，加入20μl的depc水溶解rna。最后进行电泳以及od
260
/od
280
检测，确定rna是否可以用于后续实验。
[0077]
逆转录：使用逆转录试剂盒(购自武汉赛维尔)，进行cdna第一条链的合成。反应体系20μl，程序设置如下：
[0078]
温度时间25℃5min42℃30min85℃5sec
[0079]
qpcr检测：使用qpcr检测试剂盒(购自武汉赛维尔)，加入引物，进行mrna定量检测。反应体系20μl，程序设置如下：
[0080][0081]
根据获得的ct值，以β-actain为内参，使用2-δδct法进行计算。
[0082]
三、利用western blot蛋白印迹法检测与细胞自噬相关通路ampk/mtor的关键蛋白
[0083]
细胞培养、实验分组同上。
[0084]
western blotting检测：48h后，收集hacat细胞，pbs洗2次(1000r
·
min-1,5min)后,分别应用细胞裂解液试剂盒裂解细胞。蛋白定量后分别取50μg的蛋白加入上样缓冲液,95℃变性10min。8％聚丙烯酰胺-sds凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维素膜上,5％脱脂奶粉封闭后依次加入相应的一抗和二抗,室温孵育2h,tbst缓冲液洗涤5次,每次10min。加入化
学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影、定影及摄像，使用image j的软件分析条带灰度值。
[0085]
三、实验结果
[0086]
根据图3，在斑马鱼皮肤炎症模型中，与空白组相比，模型组的中性粒细胞迁移数目显著增高，而加入雪衣藻寡糖的组别其中性粒细胞迁移数目都呈现出下降趋势，雪衣藻寡糖浓度越高，下降效应越明显，显示出雪衣藻寡糖对sls诱发的斑马鱼皮肤炎症有着明显的缓解作用。
[0087]
根据图4，与模型组相比较，雪衣藻寡糖促炎因子il-1β、il-8、tnf-α基因的mrna转录水平有明显的抑制作用，对炎症抑制因子il-13基因的mrna转录水平有一定的促进作用。
[0088]
根据图5，雪衣藻寡糖对与细胞自噬相关的apmk/mtor通路的lc3-b、p-ampk因子有促进作用，对p-mtor因子有抑制作用，前者能够促进细胞自噬的产生，后者则相反。
[0089]
以上结果表明雪衣藻寡糖能够通过作用于炎症因子的转录以及促进细胞自噬来舒缓皮肤炎症。

技术特征：
1.一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法，其特征在于，所述雪衣藻寡糖通过生物发酵技术从极地藻类雪衣藻中获取，具体步骤如下：s1菌种活化及培养：将保存的枯草芽孢杆菌自斜面取出，转入三角瓶进行种子摇瓶培养(lb培养基)；s2发酵：当菌悬液od
600
值在3-5时取菌悬液按照体积分数10-20％的接种量接种于含15-30wt％雪衣藻粉、2-3wt％葡萄糖的发酵培养基中。30
±
2℃静止培养，当发酵液od
600
在120-140时中止发酵，将发酵液于8000-10000r/min离心10-15min，分别收集菌体与发酵上清液；s3菌体破壁：将发酵菌体进行均质破壁，得到菌体破壁提取液；s4提取精制：将所述步骤s2发酵上清液与所述步骤s3菌体破壁提取液混合，蒸发后得到干燥产物，使用石油醚溶解干燥产物，过滤，将滤渣用70-90％乙醇溶解，过滤蒸发得到雪衣藻寡糖；所述步骤s1中的枯草芽孢杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.26359，保藏日期为2022年12月30日。2.根据权利要求1所述的一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中种子摇瓶培养的接种量为1-2％，于37
±
2℃，220-240rpm下培养15-20h。3.根据权利要求1所述的一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中均质破壁的压力为80-100mpa。4.根据权利要求1所述的一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中雪衣藻寡糖的纯度为52-68％。5.一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖，其特征在于，所述雪衣藻寡糖采用权利要求1-4任一所述雪衣藻寡糖的制备方法制得。6.一种根据权利要求1-5所述的调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的应用，其特征在于，所述雪衣藻寡糖在具有皮肤微生态调节、皮肤屏障修复、舒缓皮肤炎症的功能性化妆品方面的应用。7.根据权利要求6所述的一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的应用，其特征在于，所述功能性化妆品包括洁面乳、爽肤水、化妆水、乳液、面膜、面霜和精华液。

技术总结
本发明属于化妆品技术领域，提供了一种调控皮肤微生态的雪衣藻寡糖的制备方法及应用。实施例结果表明，所述雪衣藻寡糖能够促生皮肤表面的有益菌表皮葡萄球菌、双歧杆菌，抑制皮肤表面的有害菌金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、马拉色菌等，具有调控皮肤菌群平衡的功能，还可以修护和增强皮肤屏障，舒缓皮肤炎症。本发明还公开了雪衣藻寡糖用于制备具有皮肤微生态调节/皮肤屏障修复/舒缓皮肤炎症的功能性化妆品的用途，扩大雪衣藻寡糖的应用范围，提高了其商业利用价值。提高了其商业利用价值。提高了其商业利用价值。


技术研发人员：张阳 池水兴 陈凡 王卫国 徐文平 吴紫璠
受保护的技术使用者：前研化妆品科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/10/11