一种lncRNAUPK1A-AS1的抗体及其制备方法与应用

一种lncrna upk1a-as1的抗体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种lncrna upk1a-as1的抗体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc，简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率呈逐年增长趋势。肝癌起病隐匿，70％以上的患者就诊时已是晚期，索拉非尼和仑伐替尼靶向治疗是晚期肝癌的一线治疗手段，但治疗效果欠佳，免疫检查点抑制剂单药治疗在肝癌中的总体有效率仅15％～20％。
3.因此，需要提供一种治疗效果好的新的抗肝癌药物。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种免疫原，用于免疫动物制备得到的抗体，能够特异性识别lncrna upk1a-as1编码的多肽，还能够用于预防治疗肝癌。
5.本发明还提供一种生物材料。
6.本发明还提供一种多克隆抗体的制备方法。
7.本发明还提供一种多克隆抗体。
8.本发明还提供上述多克隆抗体在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。
9.本发明还提供一种用于预防或治疗肝癌的药物。
10.本发明还提供上述多克隆抗体在制备检测lncrna upk1a-as1编码的多肽的试剂盒中的应用。
11.本发明还提供一种试剂盒。
12.根据本发明的第一方面实施例的一种免疫原，包括：氨基酸序列如seq id no.1的多肽和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽。
13.根据本发明实施例的免疫原，至少具有如下有益效果：
14.既往研究认为lncrna缺乏编码蛋白的能力，本发明首次发现lncrna upk1a-as1能编码多肽，氨基酸序列如seq id no.1和/或seq id no.2所示的多肽能够促进肝癌细胞的增殖，且作为免疫原用于免疫动物能够制备得到可特异性识别lncrna upk1a-as1编码的多肽的抗体，该抗体还可以用于治疗肝癌。
15.根据本发明的一些实施例，所述免疫原用于制备抗lncrna upk1a-as1编码蛋白的抗体。所述抗体选自多克隆抗体或单克隆抗体。
16.根据本发明的一些实施例，所述免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与氨基酸序列如seq id no.1和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽偶联。载体蛋白与多肽偶联作为免疫原有利于刺激辅助性t细胞，进一步诱导b细胞免疫反应。
17.根据本发明的一些实施例，所述血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、
霍乱毒素b亚单位、大肠杆菌不稳定毒素b亚单位、白喉类毒素、破伤风类毒素中的至少一种。所述载体蛋白具体可以为血蓝蛋白。
18.根据本发明的一些实施例，所述免疫原可以经过原核表达或真核表达纯化，也可以根据其多肽序列由生物公司通过化学合成制备。
19.根据本发明的第二方面实施例的一种生物材料，包括1)至4)中的至少一种，
20.1)编码本发明第一方面实施例中所述的免疫原的核酸分子；
21.2)包含1)中所述核酸分子的表达盒；
22.3)包含1)中所述核酸分子或2)中所述表达盒的重组载体；
23.4)包含1)中所述核酸分子或2)中所述表达盒或3)中所述重组载体的重组细胞。
24.根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述免疫原的dna。该dna不但可包括启动编码所述免疫原的核酸分子转录的启动子，还可包括终止转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
25.根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述免疫原的核酸分子得到的重组载体。
26.根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。所述重组生物细胞不包含生殖材料。
27.根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入1)所述核酸分子、2)所述表达盒或3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。
28.根据本发明的第三方面实施例的一种lncrna upk1a-as1的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
29.以上述第一方面所示的实施例中的免疫原对动物进行免疫，得到多克隆抗体。
30.根据本发明的一些实施例，所述动物包括但不限于鼠、牛、兔、马、羊或猪。所述动物具体可以为大耳白兔。
31.根据本发明的一些实施例，所述免疫的部位包括但不限于背部皮下、腹部皮下、腋窝皮下、四肢皮下。
32.根据本发明的一些实施例，所述制备方法中，免疫的次数为5～6次。
33.根据本发明的一些实施例，第一次免疫为初次免疫，采用弗式完全佐剂。其余免疫均为加强免疫，采用弗式不完全佐剂。
34.根据本发明的一些实施例，初次免疫与第一次加强免疫间隔10～14天。具体可以为12天。
35.根据本发明的一些实施例，每次加强免疫间间隔12～16天。具体可以为14天。
36.根据本发明的一些实施例，用于初次免疫的所述免疫原的剂量为0.6mg/只～0.8mg/只。用于加强免疫的所述免疫原的剂量为0.25mg/只～0.45mg/只。
37.根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括对采集的动物血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。
38.根据本发明的一些实施例，所述多克隆抗体包括igg抗体。
39.根据本发明的第四方面实施例的一种lncrna upk1a-as1的多克隆抗体，由上述第二方面所示的实施例中的制备方法制备得到。
40.根据本发明实施例的多克隆抗体，至少具有如下有益效果：
41.实施例的多克隆抗体能够特异性识别lncrna upk1a-as1编码的多肽；还可以用于预防、治疗肝癌，能够显著抑制肿瘤的增殖，减少肿瘤体积和重量，且没有相关的药物治疗的副作用。
42.根据本发明的第五方面实施例的上述多克隆抗体在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。
43.根据本发明的第六方面实施例的一种用于预防或治疗肝癌的药物，包括上述多克隆抗体。由于药物采用了上述实施例的多克隆抗体的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
44.根据本发明的一些实施例，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的至少一种。
45.根据本发明的第七方面实施例的上述多克隆抗体在制备检测lncrna upk1a-as1编码多肽的试剂盒中的应用。
46.根据本发明的一些实施例，所述多肽包括氨基酸序列如seq id no.1的肽段和/或seq id no.2所示的肽段。
47.根据本发明的第八方面实施例的一种试剂盒，包括上述多克隆抗体。由于试剂盒采用了上述实施例的多克隆抗体的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。所述试剂盒可用于定量和/或定性检测lncrna upk1a-as1编码的多肽。
48.根据本发明的一些实施例，所述试剂盒的应用方法选自免疫斑点测定法、酶联免疫吸附测定法、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光法或免疫电镜法。
49.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
50.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
51.图1是lncrna upk1a-as1的多聚核糖体谱数据分析结果；
52.图2是lncrna upk1a-as1的orfs分析结果；
53.图3是lncrna upk1a-as1的6个预测orf的表达情况检测结果；其中，a为orfs-flag载体构建模式图，b、c分别为不同orfs表达情况的western blot及免疫荧光检测结果；c中比例尺代表50μm；
54.图4是对lncrna upk1a-as1的orf1和orf2编码能力的验证结果；其中，a为orfs-gfp-mut载体构建模式图，b、c分别为orf1和orf2编码能力的western blot及免疫荧光检测结果；c中比例尺代表100μm；
55.图5为orf1及orf2对肝癌细胞增殖的影响检测结果；其中，a为orf1及orf2对肝癌细胞增殖的影响；b为edu阳性率的统计结果；*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.01；a中比例尺代表50μm；
56.图6为lup1的线性b细胞表位的预测结果；
57.图7为lup1的跨膜结构域预测结果
58.图8为lup1的信号肽预测结果；
59.图9为lup1的亲水性、免疫原性及表位暴露性分析结果；
60.图10为lup2的线性b细胞表位的预测结果；
61.图11为lup2的跨膜结构域预测结果
62.图12为lup2的信号肽预测结果；
63.图13为lup2的亲水性、免疫原性及表位暴露性分析结果；
64.图14为经第五次免疫lup1识别位点多肽后的兔血清的elisa检测结果；
65.图15为经第五次免疫lup1识别位点多肽后的兔血清的western blot检测结果；
66.图16为经第五次免疫lup2识别位点多肽后的兔血清的elisa检测结果；
67.图17为经第五次免疫lup2识别位点多肽后的兔血清的western blot检测结果；
68.图18是orf1和orf2的保守性分析结果；
69.图19是anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对不同肝癌细胞中orf1及orf2表达情况的western blot检测结果；
70.图20是anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对不同敲除lncrna upk1a-as1的肝癌细胞中orf1及orf2表达情况的western blot(a)和免疫荧光(b)检测结果；b中比例尺代表20μm；
71.图21是anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对内源性orf1和orf2的表达情况的银染(a)和质谱(b)检测结果；
72.图22为anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对肝癌小鼠的治疗作用；其中，a为实验流程图和各组小鼠瘤体体积变化照片，b为各组小鼠瘤体体积变化图，c为第21天各组小鼠瘤体重量统计结果；*表示p《0.05，**表示p《0.01；
73.图23为anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对肝癌小鼠的体重影响结果；其中，a为各组裸鼠的大体图，b为各组裸鼠的体重变化情况，c为各组裸鼠实验前后的体重变化；ns表示没有显著性差异。
具体实施方式
74.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
75.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
76.在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
77.若无特殊说明，本发明中“室温”表示允许25℃
±
5℃。
78.下述实施例中，免疫荧光检测目的蛋白表达的方法如下：
79.①
细胞铺板：将待测细胞消化并重悬后，将细胞按15％细胞密度接种于35mm共聚焦皿中，将共聚焦皿置于培养箱中在37℃、5％co2条件下培养24h后，取出共聚焦皿，在显微镜下观察细胞是否贴壁(若细胞贴壁不良，则可使用多聚赖氨酸或明胶先包被皿底)。
80.②
清除培养基：从培养箱取出细胞，加入适量的冰冷的磷酸盐缓冲液浸洗5min，以清洗共聚焦皿内的细胞，并清除多余的培养基，共重复3次(若细胞贴壁不牢，可以减少磷酸盐缓冲液清洗次数)。
81.③
多聚甲醛固定：将4％多聚甲醛溶液于4℃预冷30min，然后向经步骤
②
处理后的细胞中加入适量的预冷多聚甲醛溶液，在室温下固定细胞30min后，用磷酸盐缓冲液浸洗3次，每次持续5min(浸洗过程中摇床慢摇，以防止细胞脱落)。
82.④
细胞通透：用细胞通透液(0.2％tritonx-100溶液：由10μl纯tritonx-100和5ml磷酸盐缓冲液混合得到)处理经步骤
③
处理后的细胞10min(通透时间不宜过长，否则容易导致细胞碎片增加，通透总时间不超过15min)。
83.⑤
封闭：吸去细胞通透液，用磷酸盐缓冲液浸洗细胞3次，每次3min；用吸水纸吸干磷酸盐缓冲液后，用封闭液(含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)于室温下封闭2h。
84.⑥
孵一抗：用吸水纸吸掉封闭液，向共聚焦皿中加入适量稀释后的一抗(由含3％bsa的磷酸盐缓冲液稀释得到)，于4℃摇床孵育过夜。
85.⑦
孵二抗：用磷酸盐缓冲液浸洗经步骤
⑥
处理后的细胞3次，每次5min。用吸水纸吸干共聚焦皿上残留的磷酸盐缓冲液，加入适量稀释后的荧光标记的二抗(由含3％bsa的磷酸盐缓冲液稀释得到)，于37℃避光处理；
86.⑧
复染核：用磷酸盐缓冲液浸洗经步骤
⑦
处理后的细胞3次，每次5min。滴加dapi染3～5min，以染核。再用磷酸盐缓冲液浸洗3次，每次5min。用吸水纸共聚焦皿上残留的液体。添加抗荧光淬灭剂(甘油)封片，浸满细胞。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，并采集图像。
87.western blot检测目的蛋白表达的方法如下：
88.①
总蛋白提取：将处理后的用pbs洗涤后加入蛋白裂解液，刮下细胞，收集细胞裂解液置于冰上充分裂解30min，中间振荡3次；随后将细胞裂解液在4℃、12000rpm条件下离心15min，取上清。
89.②
总蛋白浓度测定和蛋白变性：采用bca法检测步骤
①
得到的上清中的总蛋白浓度，向上清中加入1/4体积的5
×
loading buffer，沸水中煮10min，得到待测样品以使蛋白变性，冷却后于-80℃保存。
90.③
电泳、转膜及显影：配制10％～12.5％的电泳胶，将待测样品进行电泳后，根据分子量切胶，并将胶上的蛋白转移到pdvf膜上，一抗4℃孵育过夜；二抗孵育后，用ecl系统显影。
91.如无特殊说明，各肝癌细胞(包括huh7细胞、sk-hep-1细胞、mhcc-97h细胞)的培养基均为含10％血清的dmem培养基培养；培养条件为含5％co2，37℃的恒温箱；待细胞密度达到85％左右进行常规传代和后续实验，每1-2天进行换液。
92.lncrna upk1a-as1的分析
93.(1)多聚核糖体谱数据分析显示，lncrna upk1a-as1被核糖体结合，提示其可能编
码蛋白质或者多肽。如图1所示。
94.(2)通过在线软件orf1 finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析lncrna upk1a-as1序列，发现lncrna upk1a-as1序列上存在6个以atg为起始密码子，且编码氨基酸序列的氨基酸数量大于40的开放阅读框(orfs)，分别命名为orf1、orf2、orf3、orf4、orf5和orf6。如图2所示。
95.(3)根据不同orf序列，设计相应目的片段引物，并在反向引物上加flag序列，以使每个orf的3’端带有flag标签(orfs-flag载体构建模式图如图3中a图所示)。各orf的引物序列如表1中所示。以肝癌细胞株dna或cdna为模板，应用高保真酶扩增目的片段，用限制性内切酶对扩增的目的片段与pcdna3.1(+)质粒进行酶切，然后用连接酶将酶切后的目的片段与pcdna3.1(+)质粒连接，并转化至大肠杆菌，挑单克隆，摇菌，测序，保存测序正确的质粒，分别命名为orf1-flag载体、orf2-flag载体、orf3-flag载体、orf4-flag载体、orf5-flag载体、orf6-flag载体。将测序正确的质粒进行细胞转染(受体细胞为sk-hep-1细胞)，以仅含有flag序列的pcdna3.1(+)质粒(记为：flag载体)作为对照，通过western blot及免疫荧光检测orfs的表达情况。检测情况如图3中b和c图所示。结果表明只有orf1及orf2具有编码能力。
96.表1
[0097][0098][0099]
(4)根据不同orf序列，设计相应目的片段引物。各orf的引物序列如表2中所示。以肝癌细胞株dna或cdna为模板，应用高保真酶扩增目的片段，用限制性内切酶对扩增的目的片段与pegfp-n1质粒分别进行酶切，然后用连接酶将酶切后的目的片段与pegfp-n1质粒连接，转化至大肠杆菌，挑单克隆，摇菌，测序，保存测序正确的质粒。利用点突变试剂盒，将载体中gfp起始密码子atg突变成att，分别获得orf1-gfp-mut载体、orf2-gfp-mut载体；将orfs及载体中gfp起始密码子atg突变成att，分别获得orf1-mut-gfp-mut载体、orf2-mut-gfp-mut载体。orfs-gfp-mut载体构建模式图如图4中a图所示。将上述载体进行细胞转染(受体细胞为mhcc-97h细胞)，以gfp起始密码子未突变的pegfp-n1载体(记为：gfp-wt载体)、未插入orf序列的gfp起始密码子突变的pegfp-n1载体(记为：gfp-mut载体)作为对照，通过western blot及免疫荧光检测orfs的表达情况。检测情况如图4中b和c图所示。结果表明细胞能够表达orf1-mut-gfp、orf2-mut-gfp，而起始密码子突变的orf1-mut-gfp-mut、orf2-mut-gfp-mut序列失去编码多肽的能力。
[0100]
表2
[0101][0102]
综上可知，lncrna upk1a-as1中的orf1(mdrrqqsaaptpklattkkekpqkmai qapaktsslpetpisgytrywsavthmvsanrarpdswterwvrkvcsgpaalasgistsk flphlesplpsq)和orf2(mrvsrvqerrdsparqptptpqlpvssgikgdatwkgwssgl aqrrclvhlpsldgaviprggehghghknykwarqggshlqsqhcgrprredclspgv)能够编码多肽，分别命名为lup1、lup2。
[0103]
lup1、lup2对肝癌细胞增殖的影响
[0104]
以分别转染有gfp-wt载体、orf1-gfp-mut载体、orf2-gfp-mut载体、orf1-mut-gfp-mut载体、orf2-mut-gfp-mut载体的mhcc-97h细胞作为处理对象，按5
×
103个细胞/孔接种于96孔板，做相应处理后，取100μl的50μm edu培养基(用dmem培养基按1000:1的比例稀释edu溶液得到)加入96孔板中孵育2h，弃培基，pbs清洗细胞1～2次，加入100μl4％多聚甲醛溶液固定细胞30min，弃固定液；加入50μl的2mg/ml甘氨酸溶液，摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液，pbs清洗细胞1次；加入100μl渗透剂孵育10min，弃渗透剂，pbs清洗细胞1次；加入100μl的1
×
hoechst染色液染细胞核。显微镜下取5个视野，计算edu阳性率。
[0105]
其中，相应处理具体为：细胞接种24h后，分别进行常氧处理和乏氧处理12h。常氧处理为肝癌细胞置于含95％空气、5％co2的密闭细胞孵箱内，并置于37℃的恒温箱内培养。乏氧处理为肝癌细胞置于含1％o2、5％co2、94％n2的密闭细胞孵箱内，并置于37℃的恒温箱内培养。
[0106]
检测结果如图5所示。lup1、lup2能够有效促进肝癌细胞的增殖。
[0107]
抗lncrna upk1a-as1的多克隆抗体的制备
[0108]
综合线性表达、亲水性、免疫原性个表位暴露性数据(如图6至图13所示)，选择多肽路线进行抗体制备，lup1识别位点为：nrdrpdswterwvrkvc(编号：wg-03528，seq id no.1)；lup2抗体识别位点：rvsrgqerrdsparqpt(编号：wg-03529，seq id no.2)。曾尝试用orf1和orf2的全长多肽进行抗体制备，但是难以纯化得到相关多肽用于后续免疫。
[0109]
委托武汉爱博泰克生物科技有限公司分别合成上述识别位点的多肽，溶解于pbs缓冲液中。上述多肽通过巯基与血蓝蛋白(klh)偶联后，分别用于免疫两只实验级大耳白兔，进行转交免疫，牺牲兔子后，最终获得亲和纯化后的抗体(anti-lup1抗体及anti-lup2抗体)。
[0110]
亲和纯化可以为以lup1识别位点多肽作为抗原亲和纯化获得纯化后的anti-lup1抗体，以lup2识别位点多肽作为抗原亲和纯化获得纯化后的anti-lup2抗体。也可以采用本领域公知的其他亲和纯化方法对多克隆抗体进行纯化。
[0111]
对实验级大耳白兔的免疫流程如表3所示。
[0112]
表3
[0113][0114][0115]
经免疫动物采血后得到的抗血清的elisa和western blot检测结果如图14至图17所示。其中，g-03528为lup1，wg-03529为lup2。
[0116]
结果表明，e8135五兔血清、e8136五兔血清的抗体浓度均达到1mg/ml以上，且效价较高。
[0117]
anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对lup1和lup2的结合作用
[0118]
(1)通过分析多肽lup1和多肽lup2在灵长类物种间(人、大猩猩(gorilla gorilla)和北白颊长臂猿(nomascus leucogenys))的保守性，发现lup1及lup2在灵长类动物中保守性好。结果如图18所示。
[0119]
(2)以分别转染有orf1-flag载体、orf2-flag载体、flag载体的huh7细胞、sk-hep-1细胞、mhcc-97h细胞作为检测对象，通过western blot(一抗为anti-lup1抗体或anti-lup2抗体，二抗为anti-rabbit igg hrp-linkedantibod)检测不同肝癌细胞中orf1及orf2的表达情况；以β-actin作为内参。其中，未标记cocl2的处理组在37℃的含95％空气、5％co2的恒温箱内培养24h；cocl2处理组为150μm cocl2处理24h，以模仿乏氧微环境，培养环境为37℃且含95％空气、5％co2的恒温箱内。
[0120]
结果如图19所示。
[0121]
anti-lup1抗体对orf1具有很好的识别作用；anti-lup2抗体对orf2也具有很好的识别作用；anti-lup1抗体和anti-lup2抗体能够分别用于检测orf1(lup1)和orf2(lup2)的表达情况。
[0122]
(3)以特异性干扰upk1a-as1表达前后的sk-hep-1细胞和mhcc-97h细胞(分别稳定转染特异性干扰upk1a-as1的小干扰rna的慢病毒si-as1-2(序列5
’‑
gtgagcagag gccaggagaga-3’)和慢病毒si-as1-3(序列5
’‑
atggccataaacattacaaat-3’))作为检测对象，分别通过western blot(一抗为上述经亲和纯化制备得到的anti-lup1抗体或anti-lup2抗体，二抗为anti-rabbit igg hrp-linked antibody)和免疫荧光(一抗为上述经亲和纯化制备得到的anti-lup1抗体或anti-lup2抗体，二抗为anti-rabbit igg hrp-linke d antibody)检测不同肝癌细胞中orf1及orf2的表达情况；以β-actin作为内参。
[0123]
结果如图20所示。
[0124]
降低内源性upk1a-as1的表达后，lup1及lup2的表达也下调，这进一步说明制备得到的anti-lup1抗体和anti-lup2抗体的特异性强。
[0125]
(4)将肝癌细胞消化重悬后，将细胞按80％细胞密度接种于10cm培养皿中(细胞培
养液为含5％bsa的dmem细胞培养液)，次日收获细胞，用pbs洗细胞2遍，加入适量含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的western及ip细胞裂解液(碧云天，p0013)，于冰上裂解细胞30min，每10min缓慢重悬细胞裂解液，随后14000g离心5min，取上清，加入相应一抗(anti-lup1抗体、anti-lup2抗体或igg)，4℃旋转摇床孵育过夜后，加入适量proteina/gagarose，孵育1h～4h，用预冷的pbs洗脱未与抗体及磁珠结合的蛋白质后，继续用2
×
loading buffer洗脱与抗体及磁珠结合的蛋白质，进行后续银染，于无菌条件下切取目的条带(相应多克隆抗体识别位置的条带)送公司进行质谱分析。
[0126]
银染结果和质谱检测结果分别如图21所示。
[0127]
肝癌细胞内源性表达orf1及orf2，anti-lup1抗体及anti-lup2抗体分别能识别内源性表达的orf1及orf2。
[0128]
anti-lup1抗体和anti-lup2抗体对肝癌小鼠的治疗作用
[0129]
balb/c裸鼠由南方医科大学实验动物中心提供，饲养于南方医科大学南方医院spf级动物房内，鼠笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；实验前观察裸鼠有无临床症状，备用。
[0130]
培养mhcc-97h人肝癌细胞至对数生长期，用胰酶消化细胞后，800rpm离心3min，用pbs洗涤细胞3次，调整细胞数为1
×
108个细胞/ml，将100μl肝癌细胞悬液注射于balb/c裸鼠(4-6周龄，雄性)背部。待荷瘤小鼠的肿瘤长至约100mm3～150mm3，逐只测量小鼠体重及肿瘤体积，淘汰体重及肿瘤体积离群者后，将荷瘤小鼠随机分为三组(每组6只)，分别为igg处理组(pbs+igg)、anti-lup1抗体处理组(anti-lup1)和anti-lup2抗体处理组(anti-lup1)。根据小鼠体重，igg处理组隔日通过腹腔注射给药100μg/只igg抗体，anti-lup1抗体处理组和anti-lup2抗体处理组隔日分别通过腹腔注射给药100μg/只anti-lup1抗体和anti-lup2抗体，用于溶解抗体的溶液为含50％甘油的pbs(ph7.3)。每天用游标卡尺测量肿瘤体积，并称量小鼠体重，并每天观察并记录小鼠的精神状况、皮肤状态、采食量等基本情况。使用two-wayanova方法对结果进行统计分析。具体实验流程如图22中a图所示。
[0131]
实验结果如图22和图23所示。
[0132]
通过给予anti-lup1抗体和anti-lup2抗体治疗能够显著抑制肿瘤增殖，且使得肿瘤的重量和体积明显减少(p《0.5)，而对小鼠体重无明显影响，且药物处理期间未观察到任何副作用。
[0133]
上面结合实施例对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

技术特征：
1.一种免疫原，其特征在于，包括：氨基酸序列如seq id no.1的多肽和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽。2.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，所述免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与氨基酸序列如seq id no.1的多肽和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽偶联；优选地，所述载体蛋白包括血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、霍乱毒素b亚单位、大肠杆菌不稳定毒素b亚单位、白喉类毒素、破伤风类毒素中的至少一种。3.一种生物材料，其特征在于，包括1)至4)中的至少一种，1)编码权利要求1或2所述的免疫原的核酸分子；2)包含1)中所述核酸分子的表达盒；3)包含1)中所述核酸分子或2)中所述表达盒的重组载体；4)包含1)中所述核酸分子或2)中所述表达盒或3)中所述重组载体的重组生物细胞。4.一种多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以权利要求1或2所述的免疫原对动物进行免疫，得到多克隆抗体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，免疫的次数为5～6次。6.一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由权利要求4或5任一项所述的制备方法制备得到。7.权利要求6所述的多克隆抗体在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。8.一种用于预防或治疗肝癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求6所述的多克隆抗体。9.权利要求6所述的多克隆抗体在制备检测lncrnaupk1a-as1编码的多肽的试剂盒中的应用。10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的多克隆抗体。

技术总结
本发明公开了一种lncRNAUPK1A-AS1的抗体及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。该免疫原包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的多肽。该免疫原用于免疫动物制备得到的抗体，能够特异性识别lncRNAUPK1A-AS1编码的多肽，还能够用于预防、治疗肝癌。治疗肝癌。


技术研发人员：张冬艳 吴德华 邹雪晶 宋旸 张雅璇
受保护的技术使用者：南方医科大学南方医院
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/10/11