一种可促进伤口愈合的甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶的制备方法

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种可促进伤口愈合的甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.皮肤作为保护我们人体的免疫系统的第一道防线，在维持和调节人体体温，防止水分散失，保护和自我修复等方面发挥着重要功能。作为人体免疫系统第一道防线的皮肤，其在我们日常生活中很容易因意外受伤而造成不同程度的急性全层伤口的形成，若这些伤口未进行及时有效地处理，极易引发形成较难愈合的伤口，严重情况甚至会威胁生命安全。因此，开发具有促进伤口愈合的生物功能材料对我们人类健康管理具有重大意义。近年来，在促进伤口愈合的生物功能材料方面的研究众多，同时促进伤口愈合的材料的种类多样。其中，水凝胶是研究最为广泛的一类生物材料。水凝胶作为伤口愈合敷料具有如下优势：具有三维网络结构、含水量高、可吸取组织渗出液、可阻挡微生物入侵、可创造低氧环境、生物相容性好等。
3.近年来，开发与利用具有一定生物功能活性的药食同源的天然小分子成为了当下研究的一个热点。在众多天然药食同源小分子中，在一定条件下以小分子本身为构筑单元可自组装成水凝胶的天然小分子受到了广泛的关注。此类水凝胶具有制备方法简单、生物活性强、机械力学性能可调、可注射等优势，在药物包埋与递送、伤口愈合以及组织工程等医学领域具有较大的应用前景。甘草酸(glycyrrhizic acid，gl)作为甘草中重要的一类活性分子，其具有广泛的生理活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒和抗癌等。近年来，也有相关的研究报道了甘草酸可自组装形成纳米纤维网络状结构的水凝胶并在伤口愈合方面具有积极的愈合效果。然而，尽管纯甘草酸水凝胶具有较大的用于伤口敷料的优势，但仍存在一些致命的缺陷以至于限制了其进一步在生物医学领域的应用，如贮藏稳定性差、机械强度低、较高自组装浓度易诱发细胞毒性等。因此，如何提高纯甘草酸水凝胶的相关特性仍然是一个挑战。
4.明胶是胶原部分水解的产物，其具有独特的细胞粘附域和基质金属蛋白酶反应序列，为细胞的增殖与扩散提供了条件。目前常用的明胶主要来源于哺乳动物，其往往存在人畜共患病风险、免疫排斥反应、宗教信仰限制等负面问题。而来自鱼源加工废弃物(鱼皮、鱼骨、鱼鳞等)的鱼明胶(fish gelatin,fgel)具有成本低、生物相容性高、更低的免疫原性以及宗教限制更少等优势。同样，单一组分的鱼明胶水凝胶力学强度较差，一些研究表明将鱼明胶的物理交联网络引入到复合水凝胶中可显著增强鱼明胶水凝胶的力学强度和生物相容性。近年来，构建具有双网络结构的水凝胶被认为是提升水凝胶力学强度最为有效的方法之一。因此，受双网络结构水凝胶构建方法的启发，如何利用gl和fgel构建一种具有优异力学强度和生物功能特性的水凝胶是本发明欲要解决的问题。
5.基于以上考虑，本发明以gl和fgel为主要原料，旨在提供一种力学性能优异、生物
相容性好以及可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶及其制备方法与应用。


技术实现要素：

6.本发明旨在克服目前构建水凝胶伤口敷料方面存着的缺点与不足，引入物理网络，简化制备过程，构建双网络结构，提高水凝胶的力学强度、环境稳定性以及生物功能活性，提供了一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶及其制备方法。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.以gl和fgel为原料，采用一锅法制备具有双网络结构的复合水凝胶。
9.优选的，将gl和fgel分别进行溶解、离心、透析、真空冷冻干燥以进一步纯化制得。
10.优选的，配置不同比例的甘油/水溶液，体积比分别为1:1,1:3和1:5。
11.优选的，所述的fgel溶解在上述甘油/水溶液中,置于恒温水浴锅加热至60℃，使用磁力搅拌200rpm搅拌2.0h,最终浓度为50～200mg/ml。
12.优选的，一定量的gl加入上述fgel溶液中，置于恒温水浴锅加热至80℃，使用磁力搅拌200rpm搅拌0.5h，最终添加量为5～25mg/ml。
13.优选的，将上述gl/fgel混合液置于超声清洗机中超声，工作频率40khz，去泡5min。
14.优选的，将上述已超声去泡的gl/fgel混合液平铺于水凝胶模具中，首先室温25℃静置1～2h，以诱导gl自组装形成纳米纤维网络，接着将其转移至4℃冰箱静置12～24h，以促进fgel三股螺旋结构的形成。
15.本发明提供了一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶及其制备方法，采用上述技术方案中所述的制备方法即可得到。
16.本发明具有以下优势：
17.本发明提出的一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法,采用生物相容性良好的fgel和生物功能活性高的gl为原料，gl自组装形成的纳米纤维网络结构能很好地引入fgel网络，共同促进双网络水凝胶的形成。通过优化gl和fgel的添加比例，实现gl纳米纤维网络和fgel网络的巧妙复合，从而得到具有优异性能的双网络水凝胶。该方法制备简单，将gl、fgel以及甘油混合后进行反应，通过“一锅法”即可制得具有双网络结构的水凝胶。
18.本发明提出的gl/fgel双网络复合水凝胶，由于组成材料均来源于天然生物，具有良好的生物相容性、生物功能活性和生物可降解性，对伤口愈合具有良好的促进作用。并且，所得到的水凝胶具有优异的力学强度、抗冻保湿、粘附性强、高透明度等优势，是一种机具应用潜力的高强度水凝胶伤口敷料。本发明制备方法简单、成本低廉、绿色安全、功能活性显著、符合社会经济可持续发展的目标。本发明所得水凝胶用于伤口治疗，对于伤口愈合具有明显的促进效果。该甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶力学性能优异、生物相容性好、制备方法简单、反应条件温和、易于规模化生产、绿色环保，有望在医用水凝胶领域有潜在应用前景。
附图说明
19.图1为gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法及用于伤口愈合示意图；
20.图2为gl/fgel高透明度双网络复合水凝胶延展、拉伸以及黏附皮肤实物图；
21.图3为gl自组装纤维网络透射电子显微镜图；
22.图4为gl/fgel双网络复合水凝胶冷冻扫描电子显微镜图；
23.图5为gl/fgel双网络复合水凝胶力学拉伸性能图；
24.图6为gl/fgel双网络复合水凝胶抗冻性能图；
25.图7为gl/fgel双网络复合水凝胶保湿性能评价图；
26.图8为gl/fgel双网络复合水凝胶体外生物相容性评价图(图a为水凝胶血液相容性评价；图b为水凝胶细胞毒性评价；图c为水凝胶体外促血管生成能力评价)；
27.图9为经gl/fgel双网络复合水凝胶治疗后的伤口愈合效果图(图a为水凝胶处理的伤口愈合进程图；图b为水凝胶处理的伤口在不同时间的愈合率)。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.本实施例提供一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
31.称取1.5g fgel溶于10ml体积比为1:1的甘油/水溶于中，置于恒温水浴锅加热至60℃，使用磁力搅拌200rpm搅拌2h；接着加入25.0mg gl粉末，置于恒温水浴锅加热至80℃，使用磁力搅拌200rpm继续搅拌0.5h。最后，将上述gl/fgel混合液置于置于超声清洗机中超声，工作频率40khz，去泡5min以去除泡沫，并在常温25℃静置1h后放于4℃条件下放置12h得到gl/fgel双网络复合水凝胶，记为fgel/gl 1。
32.参见图1与图2，图1为gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法及用于伤口愈合示意图；图2为gl/fgel高透明度双网络复合水凝胶延展、拉伸以及黏附皮肤实物图
33.实施例2
34.本实施例提供一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
35.同实施例1，不同之处在于加入75mg gl粉末，记为fgel/gl 3。
36.实施例3
37.本实施例提供一种可促进伤口愈合的gl/fgel双网络复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
38.同实施例1，不同之处在于加入125mg gl粉末，记为fgel/gl 5。
39.对比例1
40.一种gl水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
41.同实施例1，不同之处在于不添加fgel粉末，记为gl。
42.对比例2
43.一种fgel水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
44.同实施例1，不同之处在于不添加gl，记为fgel/gl 0。
45.对比例3
46.一种fgel水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
47.同实施例1，不同之处在于甘油水溶液置换为纯水溶剂，不添加gl，记为fgel-w。
48.试验例1
49.对比例1所得到的gl水凝胶进行透射电子显微镜观察，得到gl自组装纤维网络透射电子显微镜图如图3所示。
50.试验例2
51.对实施例2所得到的gl/fgel双网络复合水凝胶的凝胶截面进行冷冻扫描电子显微镜观察，得到其冷冻扫描电子显微镜图如图4所示。
52.试验例3
53.对实施例1，2，3以及对比例2所得到的水凝胶力学强度进行评价，得到其力学拉伸性能图如图5所示。
54.对实施例2、对比例2以及对比例3中得到的水凝胶的抗冷冻性能进行评价，得到其抗冻性能图如图6所示。
55.对实施例1，2，3，对比例2及对比例3中得到的水凝胶的保湿性能进行评价，得到其保湿性能评价图如图7所示。
56.试验例4
57.对实施例2和对比例2所得到的水凝胶的凝胶截面进行生物相容性评价。具体涉及血液相容性、细胞毒性、体外促血管生成等评价，得到体外生物相容性评价图如图8所示。
58.试验例5
59.对实施例2和对比例2所得到的水凝胶以及商用的tegaderm
tm
伤口敷料进行小鼠急性全层伤口愈合评价。在小鼠伤口愈合期间(4天，8天，12天和16天)进行观察和评价，得到其伤口愈合效果图如图9所示。
60.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种可促进伤口愈合的甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以鱼明胶和甘草酸为主要原料，将鱼明胶溶于甘油/水溶液中，并60℃加热，使用磁力搅拌200rpm连续搅拌2.0h，得到鱼明胶溶液；将甘草酸溶于上述鱼明胶溶液中，并80℃加热，使用磁力搅拌200rpm连续搅拌0.5h；将上述得到的混合溶液利用超声清洗机进行超声，工作频率40khz，去泡5min。随后倒入水凝胶材料成型模具中，首先25℃静置2h，再在4℃冷藏条件下静置12h得到甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，配置不同比例的甘油/水溶液，体积分别比为1:1,1:3和1:5。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的鱼明胶溶液的最终浓度分别为50～200mg/ml。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，向所述的鱼明胶溶液中加入甘草酸粉末，最终浓度为5～25mg/ml。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，利用超声清洗机进行超声，工作频率40khz，去泡5min，所述的经超声去泡后的甘草酸/鱼明胶混合液室温放置1～2h,接着4℃冰箱冷藏静置12～24h，得到甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶的具有优异的力学强度、生物相容性以及良好的伤口促愈合效果。

技术总结
本发明提供了一种可促进伤口愈合的甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶的制备方法。该发明采用甘草酸和鱼明胶为主要原料，利用甘草酸能在一定条件下自组装成纳米纤维的特性以及与鱼明胶混合，在分级冷却过程中，各自形成物理网络，从而形成具有优异性能的双网络水凝胶。本发明所得水凝胶具有高力学强度、抗冻保湿、高透明度、高黏附、高生物相容性等特性。并且所得水凝胶用于伤口治疗，对于伤口愈合具有明显的促进效果。该甘草酸/鱼明胶双网络复合水凝胶力学性能优异、生物相容性好、制备方法简单、反应条件温和、易于规模化生产、绿色环保，有望在医用水凝胶领域有潜在应用前景。有望在医用水凝胶领域有潜在应用前景。有望在医用水凝胶领域有潜在应用前景。


技术研发人员：吕晨艳 孙继帅 赵广华 张拓 臧佳辰
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/10/11