β-羟基丁酸或其盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途

1.本发明属于医药领域，具体涉及β-羟基丁酸或其盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。


背景技术：

2.肝纤维化(hepatic fibrosis，hf)是由遗传相关疾病、慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎、胆汁淤积和药物性肝损伤等多种慢性肝病引起的过度修复反应产生多种细胞外基质(extracellular matrix，ecm)的异常沉积的结果。肝纤维化的发生发展机制和肝星状细胞(hepatic stellate cells，hsc)、肝巨噬细胞、内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ers)和自噬等有关。肝脏的纤维化是一个动态发展过程，在没有干预的情况下会继续发展成为肝硬化，甚至发展为肝细胞癌。因此，延缓或者逆转肝纤维化的发生、发展具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供β-羟基丁酸或其盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。
4.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
5.β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。
6.优选地，所述药物以β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐为活性成分，用药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。
7.更优选地，所述载体为固体、液体或半固体形态。
8.更优选地，所述剂型包括注射剂、片剂、胶囊和滴剂。
9.有益效果：
10.本发明通过多种实验证明β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐可以显著抑制肝纤维化，效果优异。这表明，β-羟基丁酸或其盐具有开发制备成治疗肝纤维化的药物的前景。
附图说明
11.图1：bhb抑制tgf-β诱导的lx-2活化。qrt-pcr分析纤维化基因mrna(1a)；western blot分析α-sma和col1a1蛋白表达水平(1b)。
12.图2：bhb抑制小鼠原代肝星状细胞活化。qrt-pcr分析纤维化基因mrna表达水平(2a)；免疫荧光染色分析α-sma阳性表达水平(2b)。
13.图3：bhb改善bdl诱导的小鼠炎症性肝损伤及肝纤维化。小鼠血清中alt以及ast含量测定(3a、3b)；肝脏h&e染色及天狼星红染色(3c)；小鼠肝脏中纤维化相关基因acta2、col1a1、col3a1、ctgf和tgfb1的转录水平变化(3d)。
14.图4：bhb改善ccl4诱导的小鼠慢性肝损伤及纤维化发生。小鼠血清中alt以及ast含量测定(4a、4b)；肝脏h&e染色及天狼星红染色(4c)；小鼠肝脏中纤维化相关基因acta2、
col1a1、col3a1、ctgf和tgfb1的转录水平变化(4d)。
15.图5：bhb钠盐改善bdl诱导的小鼠炎症性肝损伤及肝纤维化。小鼠血清中alt以及ast含量测定(5a、5b)；肝脏h&e染色及天狼星红染色(5c)。
16.图6：bhb钠盐改善ccl4诱导的小鼠慢性肝损伤及纤维化发生。小鼠血清中alt以及ast含量测定(6a、6b)；肝脏h&e染色及天狼星红染色(6c)。
具体实施方式
17.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
18.实施例1：β-羟基丁酸治疗肝纤维化
19.一、实验材料
20.1、实验动物
21.c57bl/6雄性小鼠，6-8周龄，分笼词养，恒温(23～25℃)，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
22.2、仪器与设备
23.fresco17高速冷冻离心机(美国thermofisher scientific)；jxfstprp-24组织研磨仪(上海净信公司)；生物安全柜(美国thermofisher scientific)；ccl-170b-8细胞培养箱(美国thermofisher scientific公司)；fv3000激光共聚焦显微镜(日本olympus公司)；synergy 2多功能酶标仪(美国biotek公司)；thermomixer comfort金属浴加热器(德国eppendorf公司)；orbital shaker ts-10脱色摇床(海门市kylin-bell lab instraments有限公司)；xi cell型垂直电泳槽(美国bio-rad公司)；powerpac basic电泳仪(美国bio-rad公司)；tanon-520天能凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；quantstudio3实时荧光定量pcr仪(美国thermofisher scientific)。
24.3、实验试剂与药品
25.四氯化碳(ccl4)(上海麦克林生化科技)；玉米油(corn oil)(上海源叶生物科技有限公司)；β-羟基丁酸(bhb)(德国sigma-aldrich公司)；β-羟基丁酸钠盐(bhb钠盐)(美国santa cruz公司)；rpmi.1640培养液(含双抗)(南京凯基生物科技有限公司)；percoll(美国sigma-aldrich公司)；dnase i(美国invitrogen公司)；nycodenz(美国sigma-aldrich公司)；tgf-β(美国medchemexpress公司)；triton
tm x-100(美国sigma-aldrich公司)；fitc标记山羊抗兔igg(上海翌圣生物科技股份有限公司)；抗荧光淬灭封片液(强)(上海碧云天生物科技有限公司)；dapi染色液(上海碧云天生物科技有限公司)；ripa强裂解液(上海碧云天生物科技有限公司)；30％(w/v)丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(上海生工生物工程)；1m ph＝6.8tris-hcl buffer solution及1.5m ph＝8.8tris-hcl buffer solution(上海碧云天生物科技有限公司)；蛋白上样marker(美国thermofisher scientific公司)；rnaisolater total rnaextraction reagent(上海翌圣生物科技有限公司)；qpcr sybr green master mix(抗体法,low rox)(上海翌圣生物科技有限公司)；rt-gdna digestion supermix(上海翌圣生物科技有限公司)；谷丙转氨酶(gpt/alt)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；谷草转氨酶(got/ast)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
26.二、实验方法
27.1、肝星状细胞的活化诱导及分组(细胞模型)
28.1.1人肝星状细胞系lx2活化诱导及分组
29.分为对照组组、模型组、模型给药组。lx2使用不含胎牛血清的rpmi.1640含双抗培养基饥饿4小时。模型组饥饿后更换含1％fbs的rpmi.1640含双抗培养基并按照10ng/ml的浓度向培养基中添加tgf-β进行维持性生长和活化诱导。模型给药组更换为(10ng/ml tgf-β+0.05mm/0.5mm/5mm bhb的含药培养基)，对照组则仅采用1％rpmi.1640培养基培养。培养24h后开展后续实验。
30.1.2小鼠原代肝星状细胞的活化诱导及分组
31.肝原代星状细胞培养7天后可自发活化，期间每24小时进行一次换液。活化后，分为模型对照组及0.05mm、0.5mm、5mm bhb模型给药组。
32.小鼠肝原代星状细胞提取：采用戊巴比妥钠麻醉小鼠，将小鼠固定于操作台上，剪开腹部，暴露肝脏，用生理盐水蘸湿的棉棒小心地将肝脏拨起暴露出肝门静脉和下腔静脉。将蠕动泵管路前端针头置入肝门静脉并用动脉夹进行固定，打开蠕动泵，灌注速度为3ml/min，如果置管成功，肝脏应迅速变白，一旦确认插管成功，当立即剪断下腔静脉释放系统(门静脉-肝脏-下腔静脉)压力，使灌流液从下腔静脉流出。灌流结束后完整摘除肝脏放入提前预冷的不完全dmem高糖含双抗培养基中，转移至超净台中操作。用镊子将胆囊摘除，将肝脏撕开使细胞充分流出，所得细胞悬浊液过70μm细胞滤网至预先加入体积比为1％的dnase的50ml离心管中，37℃水浴中晃动20min使其充分消化反应。采用差速离心，去除肝脏实质细胞，收集非实质细胞沉淀。沉淀中加入2mlnycodenz溶液，吹打重悬，将细胞重悬液转移至15ml离心管中，在nycodenz溶液上缓慢叠加1mlpbs，1350rcf20℃水平离心16min。分层处可见明显白色环状细胞层，小心吸取至预先准备好的含有10倍以上含10％胎牛血清的dmem高糖含双抗培养基中。700rcf室温离心5min，得到肝原代星状细胞。
33.2、小鼠肝纤维化模型的建立和分组(动物模型)
34.2.1小鼠胆管结扎(bdl)模型的建立及分组
35.分为假手术组(sham)、假手术给药组(oil+bhb)、bdl模型组(bdl)以及模型给药组(bdl+bhb)4组。用戊巴比妥钠麻醉小鼠，将小鼠固定在手术台上，剪开腹部表皮，游离胆总管，用5-0缝合线结扎，缝合腹腔。术后第三天开始腹腔注射bhb(100mg/kg)，隔天给药，14天后处死。
36.2.2小鼠ccl4模型建立及分组
37.分为空白对照组(oil)、空白给药组(oil+bhb)、模型组(ccl4)以及模型给药组(ccl4+bhb)4组。按照20％ccl4/玉米油，2ml/kg腹腔注射，对照组注射等剂量玉米油，每周两次，实验周期为4周，bhb(100mg/kg)每48h进行一次腹腔注射，期间记录小鼠状态及体重变化。
38.3、纤维化基因表达水平检测
39.3.1动物组织纤维化基因表达水平检测
40.(1)总rna的提取：将储存在-80℃超低温冰箱的组织在液氮中研磨成均质粉末状。取20mg研磨粉末加入1ml trizol裂解液,于组织研磨仪中60hz脉冲匀浆60s。向组织匀浆中加入200μl氯仿，上下剧烈震荡20s，将组织匀浆转移到冰上静置5min。12000g4℃离心10min，小心吸取400μl上层水相至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下温和颠倒
混匀，4℃静置10min。12000g 4℃离心10min，小心弃去上清，加入1ml depc水配制的75％乙醇，用手轻弹管底使白色沉淀悬浮以充分洗涤，4℃静置5min。12000g 4℃离心5min，弃去上清。将离心管敞口倒扣在平板纸上吸取多余的乙醇，干燥3-5min，加入适量的depc水以溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打溶解沉淀。
41.(2)cdna合成(rna逆转录)：逆转录：将残留基因组dna去除，在rnase free离心管中配制混合液，组分为rnase free ddh2o，5xgdna digester mix，模板rna，用移液器轻轻吹打，42℃孵育2min。
42.配置逆转录反应体系，将第一步的反应液和4xhifair iii supermix plus混匀，设置逆转录程序如下：
43.温度时间25℃5min55℃15min85℃5min
44.(3)qrt-pcr定量：用于qrt-pcr所需的体系(10μl)为:引物:cdna(1
×
):荧光素酶＝1:4:5，分别加入至pcr白板对应的孔中，结束后贴好膜刮平，瞬离1min即可放入实时荧光定量pcr仪中设定程序进行实验。qrt-pcr程序如下：
[0045][0046]
引物序列：
[0047][0048]
3.2星状细胞纤维化基因表达水平检测
[0049]
(1)总rna的提取：取出细胞，弃去培养液，pbs洗一遍，加入适量total rnaextraction reagent，覆盖并反复吹打裂解细胞，在室温下放置5min使核蛋白体完全解离。取出细胞，弃去培养液，pbs洗一遍，加入适量total rnaextraction reagent，覆盖并反复吹打裂解细胞，在室温下放置5min使核蛋白体完全解离。
[0050]
其余实验步骤同3.1动物组织纤维化基因表达水平检测。
[0051]
引物序列：
[0052]
①
原代肝星状细胞同3.1；
[0053]
②
lx2
[0054][0055]
4、肝星状细胞col1a1、α-sma蛋白表达水平检测
[0056]
(1)细胞总蛋白提取：弃去培养基。贴壁加入1mlpbs缓冲溶液洗涤，用移液枪吸洗涤液，每孔加入100μl 1
×
loadingbuffer缓冲液，用细胞刮刀将细胞充分刮下，移至1.5ml离心管中。
[0057]
(2)蛋白免疫印迹实验：
①
将干净的玻璃厚板与薄板固定于配胶支架上，按照所需目标蛋白分子量配制不同浓度的分离胶，用移液枪均匀加入到两板之间并迅速加入ddh2o封液压平。待分离胶凝固后，将上层的ddh2o倒去并用平板纸吸干多余的水。将配好的浓缩胶加入到分离胶上层，迅速插入点样孔梳。待浓缩胶凝固后，取出放置于4℃冰箱储存以备用；
②
取出配好的胶小心的将点样孔梳拔出，装置在电泳槽中并加入1
×
电泳缓冲液。样品解冻，涡旋离心后使用。将样品按上样体积依次加入梳孔中且在每块板的左右两侧分别加入3μl、1μl蛋白marker；接通电源后，将电压设置为80v，约30min后蛋白样品压平成一条直线。将电压切换至120v后继续电泳，直至蛋白样品跑至胶板的最底部时停止电泳；
③
预先配制好1
×
湿转液，配制比例为ddh2o:甲醇:10
×
湿转液＝7:2:1。电泳完成后，关闭电源，在方形槽中预先加入适量1
×
湿转液，将转膜夹中的滤纸和海绵浸润，铺好，将有白色夹的一面朝上。将薄板撬开分离，厚板连同胶一起浸入1
×
湿转液中小心地将胶铲下，切除浓缩胶部分后正面铺在转膜夹上，用专用铲将胶铺平，排除气泡，依次铺上pvdf膜、滤纸，每次需用滚筒排除气泡。夹好转膜夹后置于转膜槽中，倒入1
×
湿转液，并在槽中放入冰袋，盖好槽盖。将转膜槽移至装好冷水的盆中，在盆中加入冰袋用于制冷。接通电源，将电压调到最大300v，设置恒定电流350ma，90min，转膜完成；
④
用1
×
tbst溶液配制成5％脱脂高蛋白牛奶，现用现配。转膜结束后取出pvdf膜，放置于5％脱脂奶粉中，置于摇床上封闭2h；
⑤
根据不同抗体稀释比例用1
×
tbst溶液稀释一抗以备用。根据所需蛋白的分子量将对应的条带切下，每个条带加入2ml已稀释好的一抗，用压膜机将每个条带压好。将压好的条带放入转筒中并
于4℃冰箱中旋转孵育过夜；回收一抗(一般可重复使用3-5次)，将条带放于1
×
tbst溶液中，置于摇床上洗涤10min，重复洗涤3次。1
×
tbst稀释二抗。压膜完成后将条带放于室温孵育1h；
⑥
将条带取出放于1
×
tbst溶液中，置于摇床上洗涤10min，重复洗涤3次即可用于显影。将tanon显影液中的a液b液按1:1比例配制，将条带从1
×
tbst溶液取出放入显影仪中，每个条带均匀加上500μl显影液，曝光拍摄，保存照片，用image j分析软件分析。
[0058]
5、免疫荧光实验
[0059]
提取小鼠肝原代星状细胞铺于35mm共聚焦小皿，铺板的细胞密度控制在50％左右，2小时后换液处理，此后每24小时进行换液等待自发活化，干预组每天更换含有0.05、0.5、5mm bhb的培养基。7天后开始共聚焦样品制备。弃去培养基，pbs清洗一遍，加入500μl 4％多聚甲醛溶液室温固定25min。弃去多聚甲醛，加入pbs缓冲溶液放置于脱色摇床上慢速清洗5min，重复清洗3遍。称取300mg bsa于10ml pbs缓冲液中并加入20μl tritonx-100，配置成含triton的bsa溶液，每皿加入1ml bsa溶液，室温封闭2小时。弃去bsa溶液，加入pbs缓冲溶液置于脱色摇床上清洗5min，重复清洗3遍。用含triton的bsa溶液稀释α-sma抗体(稀释比例为1:200)，每皿加入500μl稀释后的α-sma抗体，置于4℃冰箱孵育过夜。弃去一抗，加入pbs缓冲溶液放置于脱色摇床上清洗5min，重复清洗3遍。称取3mg bsa于10ml pbs配制成3％的bsa溶液，用于稀释fitc标记的山羊抗兔igg(稀释比例为1:200)，每皿加入500μl稀释后的二抗，放于37℃孵箱避光孵育1小时。弃去二抗，加入pbs缓冲溶液置于脱色摇床上清洗5min，重复清洗3遍。每皿加入500μl dapi染色液，于37℃孵箱避光孵育10min。回收dapi染色液，加入pbs缓冲溶液置于脱色摇床上清洗5min，重复清洗3遍。用pbs缓冲溶液按1:9比例稀释抗荧光淬灭封片液，每皿中加入500μl，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
[0060]
6、谷丙转氨酶、谷草转氨酶活力测定
[0061]
动物造模结束后，按照10ml/kg剂量腹腔注射10mg/ml的戊巴比妥钠麻醉小鼠，通过心尖取血的方式收集小鼠全血于洁净的1.5ml离心管中，室温静置2h，4000rpm离心15min，所得上清即为小鼠血清。将小鼠血清分装，每管50μl，储存于-80℃备用。
[0062]
按照试剂盒说明书进行操作，具体操作如下：测定时，将一管血清取出置于4℃化冻，基质液置于37℃预温。测定孔加入20μl基质液以及5μl血清，对照孔则只加入20μl基质液，37℃反应30min。反应结束后，测定孔加入2，4-二硝基苯肼20μl，对照孔加入2,4-二硝基苯肼20μl以及5μl血清样本，37℃反应20min。对照孔和测定孔各加入200μl 0.4mol/l氢氧化钠溶液，轻轻水平摇动96孔板混匀，室温放置15min，波长510nm，酶标仪测定各孔od值，以绝对od值(测定孔od值减去对照孔od值)，查标准曲线，求得相应的alt/ast活力单位。
[0063]
7、统计学分析
[0064]
数据采用平均值
±
sem表示。两个样本统计学差异通过独立样本t检验进行分析，多个样本统计学差异采用单因素方差分析(one-wayanova)。
[0065]
差异有统计学显著值*p《0.05，**p《0.01。
[0066]
三、实验结果
[0067]
图1中，1a为qrt-pcr实验表征lx2活化时纤维化基因的表达水平，实验结果表明，0.5mm bhb即可显著降低lx2活化导致的纤维化相关基因acta2、col1a1、col3a1、ctgf和fn转录，且呈现一定的浓度依赖性；1b为蛋白免疫印迹实验来表征lx2活化时α-sma以及col1a1的蛋白表达水平，结果表明tgf-β可以升高lx-2的α-sma和col1a1蛋白表达水平，bhb
处理后，α-sma和col1a1蛋白水平显著降低(图3b)。该实验结果提示bhb能够对抗tgf-β诱导的lx-2细胞活化。
[0068]
图2中，2a为qrt-pcr实验表征小鼠原代肝星状细胞自发活化时纤维化基因的表达水平。实验结果发现，与空白组相比，bhb(0.5mm、5mm)组的acta2、col1a1、col3a1、ctgf、fn基因的mrna相对表达水平均显著降低。2b为免疫免疫荧光染色技术对小鼠原代肝星状细胞中α-sma表达水平进行定性分析，α-sma阳性反应产物为绿色荧光。实验结果仍显示，与对照组相比，bhb可以显著抑制α-sma的表达。
[0069]
图3中，3a和3b为小鼠bdl模型血清中ast及alt水平。实验结果表明，模型组血清alt水平为对照组10倍以上，ast水平也显著升高，表明造模成功；给药组与模型组相比，血清ast和alt水平显著降低；3c为对小鼠肝脏组织切片进行苏木精&伊红染色(hematoxylin&eosin staining，h&e)和天狼星红染色(sirius red staining)，结果显示，bhb显著改善了bdl造成的肝脏炎性浸润和胶原异常过度沉积；3d为利用qrt-pcr技术检测acta2、col1a1、col3a1、ctgf、tgfb1纤维化基因的mrna表达水平，实验结果表明，bdl组小鼠肝组织中acta2、col1a1、col3a1、ctgf、tgfb1基因的mrna表达水平显著升高，bhb可以显著抑制纤维化基因mrna表达水平。
[0070]
图4中，4a和4b为ccl4致小鼠慢性肝纤维化模型血清中ast及alt水平，实验结果表明，模型组血清alt水平为对照组10倍以上，ast水平也显著升高，表明造模成功，给药组与模型组相比，血清ast和alt水平显著降低；4c为对小鼠肝脏组织切片进行h&e和天狼星红染色，结果显示，bhb显著改善了ccl4造成的肝脏炎性浸润和胶原异常过度沉积；4d为利用qrt-pcr技术检测acta2、col1a1、col3a1、ctgf、tgfb1纤维化基因的mrna表达水平实验结果表明，bdl组小鼠肝组织中acta2、col1a1、col3a1、ctgf、tgfb1基因的mrna表达水平显著升高，bhb可以显著抑制纤维化基因mrna表达水平。
[0071]
实施例2：β-羟基丁酸钠治疗肝纤维化
[0072]
实验材料和实验方法参见实施例1，β-羟基丁酸用同等剂量的β-羟基丁酸钠代替。
[0073]
图5中，5a和5b为小鼠bdl模型血清中ast及alt水平。实验结果表明，模型组血清alt水平为对照组10倍以上，ast水平也显著升高，表明造模成功；给药组与模型组相比，血清ast和alt水平显著降低；5c为对小鼠肝脏组织切片进行h&e和天狼星红染色，结果显示，bhb钠盐显著改善了bdl造成的肝脏炎性浸润和胶原异常过度沉积。
[0074]
图6中，6a和6b为ccl4致小鼠慢性肝纤维化模型血清中ast及alt水平，实验结果表明，模型组血清ast和alt水平为对照组10倍以上，表明造模成功，给药组与模型组相比，血清ast和alt水平显著降低；6c为对小鼠肝脏组织切片进行h&e和天狼星红染色，结果显示，bhb钠盐显著改善了ccl4造成的肝脏炎性浸润和胶原异常过度沉积
[0075]
上述实验证明β-羟基丁酸及其药学上可接受的盐可以显著抑制肝纤维化，效果优异。
[0076]
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

技术特征：
1.β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物以β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐为活性成分，用药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述载体为固体、液体或半固体形态。4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述剂型包括注射剂、片剂、胶囊和滴剂。

技术总结
本发明公开了β-羟基丁酸或其盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途，请求保护β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐用于制备治疗肝纤维化的药物的用途。本发明通过多种实验证明β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐可以显著抑制肝纤维化，效果优异。这表明，β-羟基丁酸或其药学上可以接受的盐具有开发制备成治疗肝纤维化的药物的前景。肝纤维化的药物的前景。肝纤维化的药物的前景。


技术研发人员：刘群 齐炼文 周新悦 潘安
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/10/11