一种PCBP1基因编码蛋白异常相分离抑制剂

一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂。


背景技术：

2.多聚结合蛋白1[poly(rc)-binding protein 1,pcbp1]是rna结合蛋白家族的成员之一，它在人体正常组织中广泛表达，并在基因表达调控、病毒复制、铁离子转运等过程中发挥重要功能。该蛋白同时也是一种潜在的肿瘤抑制因子，参与多种肿瘤发生、发展、转移等过程，且在不同的肿瘤中，pcbp1的结合靶标、作用机制等各不相同。研究（肿瘤学杂志.2015，21(11)：908-912）发现pcbp1在结直肠癌组织中低表达，且其表达失调与结直肠癌的发生、发展及预后有密切关系，在人群中，pcbp1基因的突变达到10%。
[0003]
相分离(phase separation)是新近发现的一种细胞内同类物质的高效聚集方式，同类分子能够快速聚集为“小液滴”形态结构，从而在“混乱”的细胞内部形成一定秩序；蛋白相分离在自然界广泛存在，是生物体响应外界刺激、自我保护的重要机制之一，参与调控多种病理生理学过程。相分离异常往往导致相关物质的异常聚集、沉积、变性；蛋白质的异常沉积变性与疾病更加直接相关。蛋白相分离或与肿瘤亦密切相关；boulay等人（cell，2017，171(1):163-178）发现：尤文肉瘤致病蛋白（ews-fli1）异常相分离造成其异常聚集，进而激活致癌基因的表达。目前，有关pcbp1基因编码蛋白异常相分离的研究还少有报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，能够对pcbp1基因点突变而引起的蛋白异常相分离现象具有抑制作用，为pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂的研究提供潜在的价值。
[0005]
本发明提供以下技术方案：一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，所述抑制剂为如式ⅰ所示的化合物：；式中，r为四元至六元含氮脂杂环或-hn-r1；r1为苯环取代物。
[0006]
进一步地，所述四元至六元含氮脂杂环为五元含氮脂杂环或六元含氮脂杂环；所述五元含氮脂杂环为；所述六元含氮脂杂环为
；式中，x为碳原子、氧原子或氮原子。
[0007]
进一步地，所述苯环取代物为卤代苯或烷基苯。
[0008]
优选地，所述r为：、、、、或。
[0009]
其中式i化合物的制备方法为：。
[0010]
本发明提供了一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂的用途，所述用途为用于抑制pcbp1基因编码蛋白异常相分离现象。
[0011]
本发明具有如下有益效果：本发明以4-苯基硫基-邻苯二甲酸和甘氨酸为起始原料反应生成化合物2，并进一步对化合物2的结构进行修饰，得到一系列化合物，其中部分化合物对人结直肠癌细胞具有抗癌细胞增殖作用，为结直肠癌治疗药物的研究提供了新的方向。
[0012]
本发明通过体外生化实验研究pcbp1蛋白的分布情况发现，pcbp1的102位氨基酸发生突变后，会促使该蛋白分布发生改变，从核质中分布变为仅在细胞质中分布，出现异常相分离的现象；本发明抗癌细胞增殖作用较好的化合物对pcbp1基因点突变而引起的蛋白异常相分离现象具有抑制作用，能够使蛋白在核质中均有分布，为pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂的研究提供了一定实验依据。
附图说明
[0013]
图1为大肠杆菌中pcbp1基因编码蛋白分布情况；图2为3t3细胞中pcbp1基因编码蛋白分布情况。
实施方式
[0014]
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0015]
4-苯氧基邻苯二甲酸cas号37951-15-8；甘氨酸cas号56-40-6；四氢吡咯cas号123-75-1；碳酸钾cas号584-08-7；氯化亚砜cas号7719-09-7；六氢吡啶cas号110-89-4；吗啉cas号110-91-8；对氯苯胺cas号106-47-8；氢氧化钠cas号1310-73-2；对甲基苯胺cas号106-49-0；对乙基苯胺cas号589-16-2；所有化学试剂均为市售。
[0016]
实施例1 化合物2的制备
[0017]
将10.00g 4-苯基硫基-邻苯二甲酸和2.91g甘氨酸加入到研钵中，彻底研磨混合均匀，将混合物油浴加热至210-220℃，并用刮刀搅拌熔融体15 min，然后将其在真空中冷却至环境温度，制得11.00g化合物2，收率95.6%；esi-ms(m/z)：298[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.08（s，1h），7.84（d，1h），7.52-7.73（m，7h），4.31（s，2h）。
[0018]
实施例2 化合物a的制备
[0019]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后加入5ml氯化亚砜溶液，升温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入2.39g四氢吡咯和2.32g碳酸钾，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到0.77g化合物a，收率65.4%；esi-ms(m/z)：351[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.83（d，1h），7.52-7.73（m，7h），4.28（s，2h），2.78-2.99（m，4h），1.83-1.90（m，4h）。
[0020]
实施例3 化合物b的制备参照实施例2的方法制备化合物b。
[0021][0022]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后滴加5ml氯化亚砜溶液，升温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入2.87g六氢吡啶和2.32g碳酸钾，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到0.55g化合物b，收率44.8%；esi-ms(m/z)：365[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.84（d，1h），7.52-7.73（m，7h），4.31（s，2h），2.80-3.09（m，4h），1.56-1.74（m，6h）。
[0023]
实施例4 化合物c的制备参照实施例2的方法制备化合物c。
[0024][0025]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后滴加5ml氯化亚砜溶液，升温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入2.93g吗啉和2.32g碳酸钾，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到0.46g化合物c，收率37.6%；esi-ms(m/z)：367[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.85（d，1h），7.54-7.78（m，7h），4.32（s，2h），3.24-3.47（m，8h）。
[0026]
实施例5 化合物d的制备参照实施例2的方法制备化合物d。
[0027][0028]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后滴加5ml氯化亚砜溶液，升温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入4.29g对氯苯胺和0.68g氢氧化钠，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到1.00g化合物d，收率70.7%；esi-ms(m/z)：421[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.86（d，1h），7.53-7.79（m，9h），6.58（d，2h）,6.28（s，1h）,4.32（s，2h），3.98（s，2h）。
[0029]
实施例6 化合物e的制备参照实施例2的方法制备化合物e。
[0030][0031]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后滴加5ml氯化亚砜溶液，升温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入3.60g对甲基苯胺和0.68g氢氧化钠，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到0.88g化合物e，收率65.3%；esi-ms(m/z)：401[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.83（d，1h），7.54-7.77（m，7h），7.09（d，2h），6.47（d，2h）,6.27（s，1h）,4.35（s，2h），3.95（s，2h），2.32（s，3h）。
[0032]
实施例7 化合物f的制备参照实施例2的方法制备化合物f。
[0033][0034]
将1.00g化合物2加入到15ml无水四氢呋喃溶液中，然后滴加5ml氯化亚砜溶液，升
温至30℃反应，tlc检测反应完全，停止反应，向反应液中依次加入4.08g对乙基苯胺和0.68g氢氧化钠，加热回流，tlc检测反应完全，停止反应，过滤，滤液减压浓缩得粗品，粗品经柱层析分离得到0.65g化合物f，收率46.6%；esi-ms(m/z)：415[m+h]
+
，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.84（d，1h），7.54-7.77（m，7h），7.10（d，2h），6.52（d，2h）,6.28（s，1h）,4.36（s，2h），3.85（s，2h），2.31-2.33（m，2h），1.18（t，3h）。
[0035]
实验1 人结直肠癌细胞抗增殖实验人结直肠癌细胞（hct116和rko细胞）在补充有115单位/ml青霉素g，115μg/ml链霉素，和10％胎牛血清的dmem培养基中培养。将细胞接种在含有50μl生长液的96孔板(5
×
103个细胞/孔)中24小时，除去培养基，向每个孔中加入100μl含不同浓度(3.00e-05和3.00e-06)的各个化合物的新鲜培养基，并在37℃下孵育5天，同时，使用相同体积的dmso-d6作为载体对照。计算经各个化合物处理的肿瘤细胞数与载体处理的细胞数的比率，即为存活率。结果见表1。
[0036]
表1化合物2、a-f对人结直肠癌细胞存活率的影响
[0037]
由表1结果可知，在对人结直肠癌细胞（hct116和rko细胞）进行抗增殖实验中，部分化合物比未修饰的化合物2的抗癌细胞增殖作用要强。在对人结直肠癌hct116细胞抗增殖实验中，在3.00e-05浓度下，化合物b、c、f相对于未修饰的化合物2存活率均有所降低，其中化合物f降低了10％以上；在3.00e-06浓度下，化合物a、b、c、f相对于未修饰的化合物2存活率均有所降低，其中化合物f降低了20％以上；化合物f对人结直肠癌hct116细胞抗增殖作用最好。在对人结直肠癌rko细胞抗增殖实验中，在3.00e-05浓度下，化合物a、d相对于未修饰的化合物2存活率均有所降低，其中化合物a降低了10％以上；在3.00e-06浓度下，化合物a、c、d相对于未修饰的化合物2存活率均有所降低，其中化合物a降低了20％以上；化合物
a对人结直肠癌rko细胞抗增殖作用最好。
[0038]
实验2 pcbp1基因编码蛋白分布情况在大肠杆菌中表达不同浓度的pcbp1或者pcbp1_pl100_102q蛋白（pcbp1基因点突变为pcbp1基因102位l突变为q，即亮氨酸突变为谷氨酰胺），并荧光观察此时蛋白的分布情况。结果见图1，pcbp1基因发生点突变后，会导致其编码的蛋白在细胞中发生异常相分离现象，在pcbp1_pl100_102q过表达的大肠杆菌中，该蛋白呈现异常相分离状态。
[0039]
其中pbcp1基因序列为：atggatgccggtgtgactgaaagtggactaaatgtgactctcaccattcggcttcttatgcacggaaaggaagtaggaagcatcattgggaagaaaggggagtcggttaagaggatccgcgaggagagtggcgcgcggatcaacatctcggaggggaattgtccggagagaatcatcactctgaccggccccaccaatgccatctttaaggctttcgctatgatcatcgacaagctggaggaagatatcaacagctccatgaccaacagtaccgcggccagcaggcccccggtcaccctgaggctggtggtgccggccacccagtgcggctccctgattgggaaaggcgggtgtaagatcaaagagatccgcgagagtacgggggcgcaggtccaggtggcgggggatatgctgcccaactccaccgagcgggccatcaccatcgctggcgtgccgcagtctgtcaccgagtgtgtcaagcagatttgcctggtcatgctggagacgctctcccagtctccgcaagggagagtcatgaccattccgtaccagcccatgccggccagctccccagtcatctgcgcgggcggccaagatcggtgcagcgacgctgcgggctacccccatgccacccatgacctggagggaccacctctagatgcctactcgattcaaggacaacacaccatttctccgctcgatctggccaagctgaaccaggtggcaagacaacagtctcactttgccatgatgcacggcgggaccggattcgccggaattgactccagctctccagaggtgaaaggctattgggcaagtttggatgcatctactcaaacc。
[0040]
pcbp1_pl100_102q（pcbp1基因点突变为pcbp1基因102位l突变为q，即亮氨酸突变为谷氨酰胺）基因序列为：atggatgccggtgtgactgaaagtggactaaatgtgactctcaccattcggcttcttatgcacggaaaggaagtaggaagcatcattgggaagaaaggggagtcggttaagaggatccgcgaggagagtggcgcgcggatcaacatctcggaggggaattgtccggagagaatcatcactctgaccggccccaccaatgccatctttaaggctttcgctatgatcatcgacaagctggaggaagatatcaacagctccatgaccaacagtaccgcggccagcaggcccccggtcacccagaggcaggtggtgccggccacccagtgcggctccctgattgggaaaggcgggtgtaagatcaaagagatccgcgagagtacgggggcgcaggtccaggtggcgggggatatgctgcccaactccaccgagcgggccatcaccatcgctggcgtgccgcagtctgtcaccgagtgtgtcaagcagatttgcctggtcatgctggagacgctctcccagtctccgcaagggagagtcatgaccattccgtaccagcccatgccggccagctccccagtcatctgcgcgggcggccaagatcggtgcagcgacgctgcgggctacccccatgccacccatgacctggagggaccacctctagatgcctactcgattcaaggacaacacaccatttctccgctcgatctggccaagctgaaccag。
[0041]
实验3 pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制实验在3t3细胞过表达pcbp1或者pcbp1_pl100_102q，对pcbp1和pcbp1_pl100_102q蛋白进行gfp标记，并使用dapi染色以标记细胞核，观察此时蛋白的分布情况。如图2a所示，对比使用gfp标记的pcbp1和pcbp1_pl100_102q的蛋白分布情况可知，在3t3细胞中过表达pcbp1，该蛋白在核质中均有分布；而过表达pcbp1_pl100_102q时，该蛋白仅在细胞质中分布，说明pcbp1基因点突变，会导致其编码的蛋白从核质中分布变为仅在细胞质中分布，出现蛋白异常相分离现象。
[0042]
在3t3细胞过表达pcbp1_pl100_102q，对pcbp1_pl100_102q蛋白进行gfp标记，将细胞在含10％胎牛血清的dmem培养基中培养，分别向培养基中加入100μl含3.00e-06浓度
的化合物f或化合物a，并在37℃下孵育2天，观察此时蛋白的分布情况。如图2b（经化合物f处理）、图2c（经化合物a处理）所示，化合物f、化合物a均对pcbp1基因点突变而引起的蛋白异常相分离现象具有抑制作用，能够使蛋白在核质中均有分布。
[0043]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0044]
尽管已经示出和描述了本技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为如式ⅰ所示的化合物：；式中，r为四元至六元含氮脂杂环或-hn-r1；r1为苯环取代物。2.根据权利要求1所述一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述四元至六元含氮脂杂环为五元含氮脂杂环或六元含氮脂杂环。3.根据权利要求2所述一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述五元含氮脂杂环为。4.根据权利要求2所述一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述六元含氮脂杂环为；式中，x为碳原子、氧原子或氮原子。5.根据权利要求1所述一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述苯环取代物为卤代苯或烷基苯。6.根据权利要求1所述一种pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，其特征在于，所述r为：、、、、或。7.根据权利要求1-6任一项所述的pcbp1基因编码蛋白异常相分离抑制剂的用途，其特征在于，所述用途为用于抑制pcbp1基因编码蛋白异常相分离现象。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种PCBP1基因编码蛋白异常相分离抑制剂。本发明提供的PCBP1基因编码蛋白异常相分离抑制剂，对PCBP1基因点突变而引起的蛋白异常相分离现象具有抑制作用，还对人结直肠癌细胞具有抗癌细胞增殖作用，为PCBP1基因编码蛋白异常相分离抑制剂及结直肠癌治疗药物的研究提供潜在的价值。潜在的价值。潜在的价值。


技术研发人员：贾广帅 梅琰 程艳丽
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/10/11