一种重组蛋白A及其应用的制作方法

一种重组蛋白a及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组蛋白a及其应用。


背景技术：

2.20世纪中期，jensen发现有一种蛋白可以与人和兔血清抗体广泛结合，该蛋白于1964年首次被称为金黄色葡萄球菌蛋白a（staphylococcus aureus protein a，spa），以下简称“蛋白a”。 蛋白a是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42kda，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区域，可与人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白发生特异性结合，因此被广泛用作免疫学试剂、抗体的分离纯化、治疗抗体相关性疾病的血液净化吸附剂等，市场需求量很大。
3.蛋白a的获取一开始是从金黄色葡萄球菌中直接提取天然蛋白a，天然的蛋白a包含5个高度同源的结构域e、d、a、b、c和未知功能的非fc结合域。5个结构域均包括由两个环连接的三个螺旋结构（helix
ꢀⅰ
、helix
ꢀⅱ
和helix
ꢀⅲ
），其中helix
ꢀⅰ
和helix
ꢀⅱ
（除ｃ端部分氨基酸）可与igg的fc片段特异性结合，而helix
ꢀⅲ
和helix
ꢀⅱ
的c端部分氨基酸可与igg的fab片段结合。蛋白ａ可通过疏水相互作用特异性结合igg的fc片段，主要涉及两个结合位点：helix ｉ结构中苯丙氨酸和酪氨酸组成的二肽所形成的疏水内核与igg的ch2-ch3区域之间；helix
ꢀⅱ
与igg的ch3区域之间。此外，5个结构域都可通过helix
ꢀⅱ
的c端部分残基和helix
ꢀⅲ
与vh3区域相互作用，从而结合igg的fab片段。相较于d、e结构域，a、b和c结构域与fab片段相互作用较弱。
4.fab片段（antigen-binding fragment）是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由完整的轻链（可变区和恒定区）和部分重链结构（可变区和一个恒定区片段）组成，轻链与重链通过一个二硫键连接，体积较小，分子量为47-48 kda。fab片段与完整的igg相比，它缺少fc段，虽然能与抗原选择性结合但不会发生沉淀反应；由于自身免疫原性低，不能被活体的免疫细胞识别，因此能显著降低超敏性反应发生的概率，提高产品的安全性。fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原性低、可基因工程操作等特点，使fab成为了医药研究领域的重要成员之一，fab类药物在临床诊断和治疗上发挥巨大的作用。例如：已经上市的赛妥珠单抗酯（一种fab片段），可以有效地针对类风湿性关节炎；作为fab片段的美妥昔单抗i也已经用于治疗肺癌等。
5.天然蛋白a结构稳定，能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区，但与fab区或轻链结合很弱。获取天然蛋白a的方法也比较复杂，金黄色葡萄球菌还属于致病菌，大规模生产危险性较大。因此，近些年人们开始研究通过基因工程的方法来生产重组蛋白a，简化蛋白a的生产流程，提高生产安全性。目前市面上大部分的商用重组蛋白a主要是针对b结构域进行优化的，这种方法优化的蛋白a虽然耐碱性和载量显著优于天然蛋白a，但是与fab片段结合被降低。
6.vhh是已知最小的自然产生的抗原结合域，通常由噬菌体展示法获得其序列。通过适当的筛选，可以确保选择到最佳的vhh片段。小分子的vhh具有较好的组织穿透能力，在癌
症治疗中能够很好的到达靶点位置，从而进行有效治疗。
7.vhh、fab抗体片段均可用于癌症的研究与治疗，这两个片段的纯化过程也至关重要。但现有技术中大部分商业蛋白a及其偶联制备的介质对vhh、fab片段进行纯化的能力较弱，因此开发对vhh和fab高结合活性的蛋白a有较大意义。


技术实现要素：

8.基于此，本发明提供了一种重组蛋白a及其应用。本发明提供的重组蛋白a能与fab和vhh结合，且重组蛋白a偶联的亲和层析介质可以实现对igg抗体、f(ab’)2片段以及vhh的纯化。
9.为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种重组蛋白a，所述重组蛋白a的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.madnkfnkeqqnafyeilhlpnlneeqrngfiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkaqhdeaqqnafyqvlnmpnlnadqrngfiqslkddpsqsanvlgeaqklndsqapkadaqqnnfnkdqqsafyeilnmpnlneaqrngfiqslkddpsqstnvlgeakklnesqapkadnkfnkeqqnafyeilhlpnlneeqrngfiqslkddpsqsanllaeakklndaqapk（seq id no.1）；优选地，编码所述氨基酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.atggcagacaacaaattcaacaaagaacagcagaacgctttttacgaaatcctgcacctgccgaacctgaacgaagaacagcgcaacggcttcatccagtccctgaaagacgacccgtctcagtctgcgaacctgctggctgaagcgaaaaagctgaacgacgcgcaggccccgaaagctcagcacgacgaagctcagcagaacgctttctaccaggttctgaacatgccgaacctgaacgctgaccagcgtaacggttttatccagtccctgaaagacgacccgtctcagtctgcgaacgttctgggtgaagcacagaaactgaacgactcccaggctccgaaagctgacgctcagcagaacaactttaacaaagaccagcagtccgcattctacgaaatcctgaacatgccgaacctgaacgaagcgcagcgtaacggtttcattcagtctctgaaagacgatccgtctcagtccaccaacgttctgggtgaagcaaaaaaactgaacgaatctcaggcgccgaaagcggacaacaaattcaacaaagaacagcagaacgctttttacgaaatcctgcacctgccgaacctgaacgaagaacagcgtaacggtttcatccagtctctgaaagacgacccgtctcagtctgcgaacctgctggcggaagcgaaaaaactgaacgacgcgcaggcgccgaaataatga（seq id no.2）。
12.本发明还提供了一种重组表达载体，包含所述的编码重组蛋白a的核苷酸序列。
13.优选地，所述重组表达载体是将权利要求2所述的核苷酸序列克隆到pet28a质粒中的ndei/xhoi酶切位点间得到的。
14.本发明还提供了一种重组工程菌，包含所述的重组表达载体。
15.本发明还提供了一种所述的重组蛋白a在vhh、fab片段纯化中的应用。
16.本发明还提供了一种亲和层析介质，所述亲和层析介质以所述的重组蛋白a为配体。
17.本发明主要通过将基因工程改造的蛋白a基因连入表达载体来构建重组质粒，再将重组质粒导入原核宿主细胞中进行表达，经ni亲和层析纯化、透析可获得纯度大于95％的目的蛋白。
18.与现有技术相比，本发明具有如下优势：本发明所述重组蛋白a实现了对vhh片段及fab片段的高效率纯化，有助于提高这2个片段的纯化效率。
附图说明
19.图1为目标pcr产物电泳结果图；图2为酶切产物电泳结果图；图3为阳性克隆鉴定结果图；图4为本发明构建的质粒图谱；图5为表达验证sds-page电泳结果图；图6为重组蛋白a纯化sds-page图；图7为透析结束后电泳结果图；图8为应用纯化igg单抗的sds-page结果图；图9为应用纯化f(ab’)2的sds-page结果图；图10为应用纯化vhh的sds-page结果图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
21.实施例1 重组质粒的构建及验证1.试验样品：引物，pet28a载体质粒，高保真pcr聚合酶，重组酶，胶回收试剂盒，dntp，限制性内切酶。
22.2.试验方法：2.1根据目标片段，设计引物（分成两段进行设计），具体引物信息如下表1所述。
23.表1 两个片段设计的具体引物信息
2.2利用pcr技术克隆目标序列：b22644403an片段的获得：共进行两轮pcr，第一轮，首引物（即上游引物）为b22644403an_1
ꢀ‑
8（即8条引物的混合物），无尾引物、无模板，配制50μl的反应体系，具体如下表2所示。pcr反应程序如下：95℃ 3min；95℃ 25s，60℃ 20s，72℃ 40s，上述过程25个循环；72℃ 1min；10℃保存；获得第一轮pcr产物。
24.表2 pcr反应体系
然后进行第二轮pcr反应，首引物为b22644403an_1，尾引物为b22644403an_8，模板是第一轮pcr产物，反应体系及反应程序均与第一轮相同，只替换引物及dna模板。
25.b22644403bn片段的获得：与b22644403an类似，同样需要两轮pcr，第一轮将引物替换成b22644403bn_1-8，其他均不变，第二轮的首引物为b22644403bn _1，尾引物为b22644403bn_8，模板为第一轮pcr产物，其他条件不变。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并将目标pcr片段胶回收。
26.2.3酶切线性载体：将pet28a质粒用xhoi / ndei酶切进行线性化处理。酶切反应体系：载体6μl（1.5μg），10
×
buffer 10μl，xhoi 2μl，ndei 2μl，ddh2o 30μl将上述体系置于37℃水浴2h，然后65℃，15min灭活限制性内切酶。同样用琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物，并将酶切产物胶回收。
27.2.4重组反应体系：按照下述体系配制反应体系：胶回收目的pcr产物b22644403an片段与b22644403bn片段各4μl，pet28a线性化载体3.5μl，重组酶（gibson无缝连接试剂盒）2.5μl；然后将反应体系置于50℃水浴25min，然后取出放置2-3min使温度降低，得到重组质粒；进行转化及菌液涂布实验。
28.2.5 转化及菌液涂布实验：取出一支低温（-80℃）保存的感受态细胞（50μl/支），加入5μl制得的重组质粒，冰浴30min，再于42℃热激90s，冰浴5min；将离心管中液体全部吸出至amp平板，均匀涂抹；温育过夜。
29.2.6菌落筛选试验：挑取过夜平板中的单菌落，用t7（taatacgactcactataggg）（seq id no.19）和t7t引物（gctagttattgctcagcgg）（seq id no.20），以菌液为dna模板，进行菌落pcr（pcr过程同上），将所得pcr产物以1.2%琼脂糖电泳鉴定阳性克隆；然后选择4个阳性菌。
30.2.7扩增阳性菌液：将筛选出的4个阳性菌，以t7（taatacgactcactataggg）和t7t引物（gctagttattgctcagcgg），阳性菌为dna模板，进行阳性菌落pcr（具体pcr体系及扩增过程与扩增目标序列过程相似，仅替换引物及dna模板），得到阳性菌液；阳性菌液用t7/ t7t测序，选择测序正确的克隆阳性菌液，转至接100ml lb液体培养基，37℃ 220rpm 培养16h。收集菌体，抽提低内毒素质粒（凯杰endofree plasmid maxi kit），测序验证即得。
31.3.试验结果：目标pcr产物电泳结果如图1，由图1可知，扩增片段为目标片段，酶切产物电泳结果如图2所示，由图2可知，酶切正确，阳性克隆鉴定结果如图3所示，由图3可知，
1~8泳道表明扩增得到大小约为1000bp特异性dna分子片段与b22644403菌检片段大小一致，表明b22644403an片段与b22644403bn片段成功插入pet28a质粒中。最终获得的重组表达载体结构如图4所示，图4中，载体的结构按顺时针方向，分别为t7 terminator、f1 ori、kanr、ori、bom、rop、laci、laci promoter、t7 promoter、lac operator、6
×
his、thrombin site、t7 tag（gene 10 leader）、6
×
his。
32.实施例2 重组蛋白a的表达及纯化1.试验材料：感受态细胞bl21，水浴锅，摇床，离心机，电泳仪，蛋白纯化系统，高速冷冻离心机；2.试验方法：2.1质粒转化：（1）取出低温（-80℃）保存的bl21（de3）感受态细胞一支，向其中加入5μl实施例1最终制得的重组质粒，冰浴15min后42℃热激90s，再冰浴5min；得到转化菌液；（2）将转化菌液全部吸出，涂布于kan抗性平板上，37℃，培养18h，获取单菌落。
33.2.2表达验证（1）挑取转化后的单菌落（即2.1最终制得的单菌落）接种于含kan抗性的2
×
yt培养基中；（2）37℃培养至od
600
=0.6左右后，加入iptg进行诱导表达，诱导结束后得到全菌溶液；（3）将全菌溶液进行sds-page电泳检测。
34.2.3蛋白表达（1）菌种活化：挑取转化后的单菌落接种于含kan抗性的2
×
yt培养基中，于37℃，培养18h；（2）菌体培养：将活化后的菌液转接至含kan抗性的2
×
yt培养基中，于37℃，培养至od
600
=0.6时，于37℃，220rpm，1mm iptg的条件下诱导表达，培养16h；（3）将诱导表达结束后的菌液分装后于4℃，7000rpm离心5min，收集菌体；（4）按1g菌体：10ml裂解液（1%triton x-100，1
×
pbs）的比例重悬菌体进行超声破碎，于1000rpm转速下离心20min，获得待纯化的上清液。
35.2.4蛋白纯化：ni亲和层析柱纯化（1）装柱：5ml ni-ted填料混匀后，用移液枪吸取填料悬浮液加入层析柱中，将泵，连接管路，层析柱三者连接好，做好柱子标签；（2）用1
×
pbs溶液平衡层析柱，平衡后上样，上样量为100ml；（3）上样结束后，先用1
×
pbs溶液平衡，再用ph为7.5的20mm pbs+1m nacl缓冲液洗杂；（4）洗杂结束后，用1
×
pbs溶液平衡后，用250mm咪唑洗脱，检测波长：280nm，分管收集蛋白峰，使用nano-300仪器测量蛋白浓度后，上样进行电泳检测；（5）透析：根据电泳结果合并蛋白后吸至透析袋中，扎紧透析袋，做好标记，分别置于含1
×
pbs（便于活性检测）以及10mm的edta-na2的缓冲液中进行透析；（6）透析结束后，上样进行电泳检测。
36.3.实验结果：sds-page（2.2表达验证）电泳检测结果见图5，图5中，marker由下至
上分别为10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、85kda、100kda、120kda、150kda、200kda，由图5可知，预估目的蛋白分子量为28kda，测量蛋白浓度后的电泳检测结果如图6所示，由此可知，显示有蛋白表达，即通过ni亲和层析柱纯化获得目的蛋白，透析后电泳结果如图7所示，由图7可预估该蛋白的表达量为97mg/l。
37.实施例3 elisa验证1.检测仪器及试剂：酶标仪：versamax；包被缓冲液（100mm nahco
3-na2co3）、0.05%pbst、1
×
pbs缓冲液、酪蛋白封闭液（50mm tris 150mm nacl 0.1%酪蛋白）、tmb显色液、tmb显色终止液；f（ab’）2（human igg1-kappa-ides酶切）、vhh。
38.2.试验方法：2.1包被：根据实验所需量包被酶标板，分别将蛋白f（ab’）2（human igg1-kappa-ides酶切）和vhh浓度稀释为2μg/ml，得到f（ab’）2/ vhh稀释样品，向酶标板各孔中加入100μl的f（ab’）2/ vhh稀释样品，轻轻振荡酶标板使抗体覆盖酶标板孔底，4℃孵育过夜。2.2封闭：将过夜孵育后的酶标板用0.05%pbst缓冲液洗涤后，加入100μl酪蛋白封闭液，37℃孵育2h，孵育结束后将酶标板用0.05%pbst缓冲液洗涤。
39.2.3蛋白生物素标记：取1μl配制好的生物素酯溶液（0.02%）加至含1mg重组蛋白a（即实施例2获得的纯化的重组蛋白）的溶液中室温反应1小时。
40.2.4加一抗：将生物素标记后的重组蛋白a作为一抗，用0.05%pbst稀释至10μg/ml，以10μg/ml为起始浓度，1/2梯度稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h后，将酶标板用0.05%pbst缓冲液洗涤。
41.2.5加二抗：每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的亲和素（sa-hrp），25℃反应30min后用0.05%pbst缓冲液洗涤。
42.2.6底物显色：于上述各反应孔中加入50μl的tmb显色液，室温避光显色5min后，加入tmb显色终止液终止反应，酶标仪450nm处读取光密度值。
43.3.实验结果：具体试验结果如下表3所示。
44.表3 重组蛋白a-elisa活性验证备注：f(ab’)2/vhh(2μg/ml)+1:2 serial diluted of rprotein a-biotin+ sa-hrp (1:2000)+tmb。
45.由表中数据可知，包被f(ab’)2（human igg1-kappa-ides酶切），通过检测出的od
450
说明重组蛋白a可以结合f（ab’）2。包被vhh，通过检测出的od
450
说明重组蛋白a可以结
合vhh。
46.实施例4 填料纯化应用4.1重组蛋白a偶联亲和介质纯化igg抗体实验验证：以重组蛋白a为配体的亲和层析介质是否可以纯化igg抗体1.实验仪器及材料：电泳仪、蛋白纯化系统、human igg1-kappa抗体细胞培养上清2.实验方法：装柱：将重组蛋白a与固相琼脂糖填料（1ml填料偶联10mg重组蛋白a）偶联制备亲和介质，将其填装为1ml预装柱；然后用1
×
pbs溶液平衡层析柱；平衡后上样human igg1-kappa抗体细胞培养上清50ml；上样结束后，用1
×
pbs溶液平衡；待蛋白基线平稳后，用100mm甘氨酸-hcl，ph2.5的缓冲液进行洗脱，检测波长：280nm，分管收集蛋白峰，使用nano-300仪器测量蛋白浓度后，上样进行电泳检测。
47.3.实验结果：具体试验结果见图8，由此可知，重组蛋白a偶联的亲和介质可以从细胞上清中纯化igg抗体，预估该亲和层析介质对igg抗体的动态载量约为49.5mg/ml。
48.4.2 重组蛋白a偶联亲和介质对f(ab’)2抗体片段的纯化实验验证：以重组蛋白a为配体的亲和层析介质是否可以纯化f(ab’)2抗体片段1.实验仪器及材料：电泳仪、蛋白纯化系统、f(ab’)2（human igg1-kappa-ides酶切）2.实验方法：装柱：将重组蛋白a与固相琼脂糖填料偶联制备亲和介质，将其填装为1ml预装柱；用1
×
pbs溶液平衡层析柱；平衡后上样f(ab’)2（human igg1-kappa-ides酶切，1mg/ml）50ml；上样结束后，用1
×
pbs溶液平衡；待蛋白基线平稳后，用100mm甘氨酸-hcl，ph2.5的缓冲液进行洗脱，检测波长：280nm，分管收集蛋白峰，使用nano-300仪器测量蛋白浓度后，上样进行电泳检测。
49.3.实验结果：具体试验结果见图9，重组蛋白a偶联的亲和介质可以结合f(ab’)2抗体片段，预估该亲和层析介质对f(ab’)2的动态载量约为39mg/ml。
50.4.3 重组蛋白a偶联亲和介质对vhh的纯化1.实验仪器及材料：电泳仪、蛋白纯化系统、vhh。
51.2.实验方法：装柱：将重组蛋白a与固相琼脂糖填料偶联制备亲和介质，将其填装为1ml预装柱；用1
×
pbs溶液平衡层析柱；平衡后上样vhh（1mg/ml）50ml；上样结束后，用1
×
pbs溶液平衡；待蛋白基线平稳后，用100mm甘氨酸-hcl，ph2.5的缓冲液进行洗脱，检测波长：280nm，分管收集蛋白峰，使用nano-300仪器测量蛋白浓度后，进行电泳检测。
52.3.实验结果：具体试验结果见图10，重组蛋白a偶联的亲和介质可以结合vhh，预估该亲和层析介质对vhh的动态载量约为2.1mg/ml。
53.最后，需要说明的是，上述实施例仅示例性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1. 一种重组蛋白a，其特征在于，所述重组蛋白a的氨基酸序列如seq id no.1所示。2. 如权利要求1所述的重组蛋白a，其特征在于，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码重组蛋白a的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将权利要求2所述的核苷酸序列克隆到pet28a质粒中的ndei/xhoi酶切位点间得到的。5.一种重组工程菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体。6.一种如权利要求1所述的重组蛋白a在vhh、fab片段纯化中的应用。7.一种亲和层析介质，其特征在于，所述亲和层析介质以权利要求1所述的重组蛋白a为配体。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组蛋白A及其应用。本发明提供的重组蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以与F(ab’)2和VHH结合，以本发明所述重组蛋白A为配体的亲和层析介质可以实现对IgG抗体、F（ab’）2片段以及VHH的纯化。将编码本发明所述重组蛋白A的核苷酸序列插入表达载体构建重组质粒，然后将重组质粒导入原核宿主细胞中进行表达，经Ni亲和层析纯化、透析可获得纯度大于95％的目的蛋白。本发明制得的重组蛋白A增强了与Fab片段特异性结合的作用，有效扩大了蛋白A的应用范围。用范围。用范围。


技术研发人员：郑飞剑 牛泽洁 周清瑞 何建佳 陈昊 张景辉
受保护的技术使用者：江苏百英生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.31
技术公布日：2023/10/11