一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于前列腺癌干性分型的检测试剂盒。


背景技术：

2.前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈显著上升趋势。尽管手术、放疗和化疗等治疗取得了进步，但前列腺癌的治疗仍面临挑战，特别是去势抵抗性前列腺癌(crpc)，可选治疗措施有限且经常面临耐药和毒副作用。
3.随着精准医学的发展，分子分型技术越来越受到重视。肿瘤分子分型可用于指导肿瘤患者的精准诊断和治疗。现有的前列腺癌分子分型方法是针对特定的临床应用而设计的。例如，pam50方法用于指导雄激素剥夺治疗；decipher方法用于指导放射治疗和手术治疗。目前仍缺乏有效、系统的前列腺癌分子分型方法，能够从不同临床角度表征患者，例如诊断、预后、复发、转移和进展风险以及不同治疗方法的疗效等。目前，广泛采用的生物标志物鉴定方法是使用高通量技术对候选标志基因进行初步筛选，然后利用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction)进行验证。这种方法稳定可靠、技术成熟。
4.已有的研究显示，肿瘤内存在一小部分具有自我更新和分化潜力的恶性细胞，称之为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞在复发、转移、耐药、预后等方面发挥了关键作用。对于其他肿瘤而言，干性特征已经被证明可以用于指导肿瘤精准免疫治疗。但是对于前列腺癌而言，基于肿瘤干性特征的,可以综合评估肿瘤预后、复发风险、耐药等多种临床表型的分子分型方法仍然缺乏。因此，为了构建可用于指导前列腺癌临床精准治疗的分子分型方法，本领域的技术人员致力于寻找用于对前列腺癌进行干性分型的方法，开发出一种能用于前列腺癌干性分型的检测试剂盒。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，所述的这种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒要解决现有技术中的前列腺癌的分型方法可靠性不足的技术问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，包括9个基因：pdlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr、top2a的上、下游引物序列。
7.进一步地，还包括作为内参的管家基因的引物。
8.进一步地，所述管家基因为β-actin。
9.进一步地，还包括：总rna抽提试剂、和/或pcr反转录试剂、和/或pcr定量试剂。
10.进一步地，所述总rna抽提试剂包括trizol试剂。
11.本发明还提供了一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，包括检测dlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr、top2a的上、下游引物序列。
12.进一步地，所述检测试剂盒还包括作为内参照的管家基因的引物。
13.进一步地，所述管家基因为β-actin。
14.进一步地，还包括：总rna抽提试剂、和/或pcr反转录试剂、和/或pcr定量试剂。
15.本发明还提供了一种用于筛选前列腺癌干性分型基因或基因组合的方法，包括以下步骤：
16.步骤一、基于前列腺癌单细胞rna-seq数据和bulk rna-seq数据，利用机器学习算法筛选出与干性水平成正相关且在前列腺癌中显著高表达的基因，称为干性相关基因；对干性相关基因进行基因集合富集分析，进一步鉴定与前列腺癌预后显著相关的基因集合，称为干性相关基因集合；基于上述干性相关基因集合，使用无监督层次聚类对前列腺癌样本进行分型，可分为三个干性亚型：低干性、中干性和高干性亚型；
17.步骤二、进行加权基因共表达网络分析以鉴定高干性亚型的核心基因，与上述干性相关基因取交集获得干性分型候选基因；在4个经典前列腺癌bulk rna-seq数据集中使用76种机器学习算法评估上述干性分型候选基因对干性亚型的预测性能，4个数据集中平均auc》0.9的基因确定为干性分型基因。
18.步骤三、筛选出前列腺癌干性分型基因，合成所述前列腺癌干性分型基因的引物并制成检测试剂盒，所述前列腺癌干性分型基因包括：pdlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr、top2a；
19.步骤四、采集前列腺癌肿瘤组织，利用步骤一制成的检测试剂盒定量检查肿瘤组织中所述前列腺癌干性分型基因的表达水平，其中检验过程中基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃；
20.步骤五、以553例tcga-prad样本作为训练集，采用非监督层次聚类算法评估待测样本的干性亚型。
21.本发明建立前列腺癌分子分型检测试剂盒，提高对前列腺癌患者进展、预后、复发、耐药等风险的评估，更加精确地指导临床治疗，有效提高治疗效果；采用多个基因分子组合，提高检测的灵敏度和特异性，降低单一分子预测试剂盒带来的检测误差。
22.肿瘤的干性(stemness)特征已经显示与肿瘤的恶性程度、耐药等临床表型紧密相关。大量有关前列腺癌高通量组学数据积累为构建可靠的分子分型模型奠定了基础。本发明使用机器学习方法，通过整合前列腺癌的单细胞转录组数据、块转录组数据、甲基化数据和外显子测序数据等，从中挖掘能表征肿瘤干性特征的基因标志物。研究显示这些标志物的表达水平与前列腺癌的多种临床表型相关联，从而验证干性分子分型的临床应用价值。
23.本发明基于一种分型方法，可以可靠预测多种临床表型，如肿瘤进展风险、转移风险、复发风险、多种治疗的敏感性。通过一次检测可以提供对前列腺癌病人提供全面评估，具有明显的临床应用价值。
附图说明
24.图1显示了前列腺癌样本基于9个前列腺癌干性分型基因可分为3个亚型：低干性(ls)，中干性(ms)，高干性(hs)。前列腺癌样本基于9个前列腺癌干性分型基因被分为3个亚型：低干性(ls)，中干性(ms)和高干性(hs)。mrnasi：干性指数，可反应样本的干性水平，mrnasi越大，样本干性水平越高。
25.图2显示了不同干性亚型对于不同药物的敏感性有显著区别。三种干性亚型对
bicalutamide(a)、paclitaxel(b)、etoposide(c)、gemcitabine(d)、mitoxantrone(e)、platin(f)、sunitinib(g)、olaparib(h)、abiraterone(i)、docetaxel(j)、sorafenib(k)、imatinib(l)、cabozantinib(m)、afatinib(n)、erlotinib(o)、talazoparib(p)、bi-2536(q)、tacedinaline(r)、sb-431542(s)和azd5438_1401(t)等药物的敏感性存在显著差异。
26.图3显示了9个干性分型基因的筛选流程。
具体实施方式
27.以下参考说明书附图介绍本发明的优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
28.实施例1
29.9个干性分型基因的筛选：使用集成机器学习算法，基于多个pca bulk rna-seq数据集筛选干性分型基因。
30.筛选过程如下：(1)首先分别在8个pca bulk rna-seq数据集上进行加权基因共表达网络分析(wgcna)，并将每个数据集获得的hs hub基因合并为干性hub基因(hub.sig)。这些基因与之前鉴定的干性标记基因(stem.sig)进行交集运算，得到干性核心基因(core.sig)。(2)通过单因素cox分析，从core.sig中筛选出pca的预后基因。(3)随后进行蛋白质互作网络分析(ppi)，只保留存在蛋白质相互作用的基因(ppi.sig)。(4)接下来，搜集能够构建单基因预测模型的76种机器学习算法，基于ppi.sig逐个基因构建单基因预测器，这些预测器使用5倍交叉验证和10次迭代来进行优化。每个基因都可以构建76个单基因预测器并用于预测hs亚型，使用auc评估其性能。(5)随后，对相同基因构建的76个单基因预测器的auc取平均值，并基于平均auc》0.9选择预测器的候选基因。(6)分别在四个数据集(tcga-prad，gse210349，prostate_dkfz_201813和gse70770数据集)中重复此过程，并获得从上述4个数据集中鉴定的候选基因的交集(a∩b∩c∩d)。最终，选定9个交集基因作为干性分型基因。流程图如图3所示：
31.本实施例中试剂盒，包括总rna(核糖核酸)抽提试剂(厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：15596018)、pcr逆转录试剂(厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：4374967)、pcr定量试剂(厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：11736059)。试剂盒还包括，应用primer5.0软件设计的下述9个前列腺癌分型基因的上、下游引物序列，选择β-actin管家基因作为内参照，所有引物均由上海生工生物有限公司合成。
32.表1前列腺癌干性分型基因和内参基因(β-actin)的上游和下游引物序列
[0033][0034]
具体实施步骤如下：
[0035]
1、rna提取：(1)准备所需的试剂和设备，如trizol试剂、氯仿、异丙醇、75％乙醇、depc水、电转器、离心机、分光光度仪等，所有试剂均有赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供。所有试剂和设备均无rna酶以避免rna降解。(2)取出冻存的新鲜肿瘤组织样本，迅速切成约100mg的小块，放入5ml的ep管中。加入1ml的trizol试剂，用电转器在冰上研磨组织，直至呈匀浆状。转移至1.5ml的ep管中，再补加500μl的trizol试剂。置于冰上裂解5分钟。(3)每管加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，使溶液充分混合。置于冰上静置10min，使核蛋白复合物完全解离。(4)在4℃下以12000rpm离心15min，可见明显分为三层：上层无色透明水相为rna层，中间很薄的乳白色为dna层，下层红色为蛋白层，底部可见组织块沉淀。(5)小心缓慢吸取上层水相(约400μl)，转移到新的1.5ml的ep管中。避免吸到dna层或有机相。每管加入400μl的异丙醇，上下颠倒混匀。置于室温静置10min，使rna沉淀。(6)在4℃下以12000rpm离心10min，可见白色沉淀为rna。弃去上清液，每管加入1ml的75％乙醇，上下颠倒混匀。用枪头吹打沉淀，使其分散在乙醇中。(7)在4℃下以7500rpm离心5min，弃去上清液。重复用75％乙醇洗涤一次。(8)离心后，弃去上清液，放入离心机再次瞬离，用10μl的移液器吸去残留液体。开盖晾干rna沉淀约10min。不要过度干燥，否则会影响rna的溶解。(9)每管根据沉淀大小加入适量depc水(一般30～50μl)，吹打溶解rna。置于55℃水浴箱中加热10min，促进rna的完全溶解。(10)用分光光度仪测定rna的浓度和纯度。rna的浓度可以用od260值乘以40来计算(μg/ml)，纯度可以用od260/od280值来评估(1.8～2.0为合格)。提取好的rna放在-80℃冰箱保存。
[0036]
2、rna逆转录为cdna：
[0037]
采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供的生物逆转录试剂盒，实现rna的基因组dna去除和逆转录。以1μg的总rna为模板，按照42℃、2min的条件，进行基因组dna去除的反应。反应体系如下，
[0038]
组分名称加入量(μl)gdna clean reagent15
×
gdna clean buffer2total rnaxrnase free dh2o7-xtotal10
[0039]
随后进行rna逆转录反应，按照7℃、15min和85℃、5s的条件，进行反应。反应体系如下，
[0040]
组分名称加入量(μl)上一步反应溶液10evo m-ml v rtase emzyme mix1rt primer mix15
×
rtase reaction buffer mix i4rnase free dh2o4total20
[0041]
上述反应结束后便得到cdna产物，记录cdna的编号和提取日期，储存于-80℃冰箱以备后用。
[0042]
3、荧光定量pcr试验：
[0043]
使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供的pcr定量试剂盒进行荧光定量pcr检测，具体步骤如下：
[0044]
(1)引物设计：首先从ncbi数据库genbank中查找上述9个干性分型基因的引物序列。然后，使用primer 5.0软件设计目标基因的上游和下游引物序列(表1)并使用dnaman软件检测设计的引物是否合理。
[0045]
(2)反应体系构建：以已经逆转录成功的cdna为模板构建反应体系，反应体系如下，
[0046]
组分名称加入量(μl)2
×
sybr green pro taq hs premix10模板cdna1primer f0.4primer r0.4rox reference dye0.4ddh2o7.8total20
[0047]
(3)pcr扩增反应：在荧光定量pcr仪上进行pcr扩增和熔解曲线分析。pcr扩增的条件如下：
[0048][0049]
[0050]
溶解曲线从tm到95℃，每5s连续记录荧光值，以β-actin管家基因作为内参照(所有引物均由上海生工生物有限公司合成)。最后，使用δδct法进行定量分析。δδct法的公式如下：
[0051]
δδct＝(ct
target-ct
reference
)
sample-(ct
target-ct
reference
)
control
[0052]
相对表达量＝2-δδct
[0053]
其中，ct是循环阈值，target是目的基因，reference是内参基因，sample是待测样本，control是对照样本。
[0054]
4、干性分型：采用无监督层次聚类算法评估待测样本的干性亚型。无监督层次聚类分析是一种常见的无监督机器学习方法，它通过将相似的样本聚集在一起，将数据集划分为不同的群组或簇，以发现数据中的内在结构和模式，由r软件中的hclust算法实现。hclust算法基于距离度量的原理，通过计算样本之间的相似性或差异性，自动将数据进行层次化聚类。该算法首先将每个样本看作一个单独的簇，然后迭代地将最相似的簇合并，直到所有样本都合并为一个簇或达到预设的聚类数目。在合并过程中，可以使用不同的距离度量方法和聚合策略来衡量簇之间的相似性。使用hclust算法的详细分型步骤如下：
[0055]
(1)准备数据：以553例tcga-prad样本作为训练集，pcr检测样本作为测试集，通过验证集和测试集内的平均表达量转换标准化基因特征值。
[0056]
(2)计算距离矩阵：hclust算法基于距离度量的原理，使用最长距离(maximum)作为距离度量方法，计算样本之间的相似性或差异性。
[0057]
(3)构建初始簇：初始情况下，将每个样本视为一个单独的簇。
[0058]
(4)计算簇之间的距离：根据距离矩阵，使用ward's方法聚合策略(ward.d2)计算每对簇之间的距离。
[0059]
(5)合并最相似的簇：从距离最小的两个簇开始，将它们合并成一个新的簇。重复此过程直到所有样本都合并为一个簇或达到预设的聚类数目。
[0060]
(6)构建聚类树：根据每次合并的顺序和距离值，构建一个层次化的聚类树，描述了样本之间的聚类关系。
[0061]
(7)干性亚型的划分：将树状图截断为3个聚类，通过热图展示9个干性分型基因在三个聚类样本中的表达水平，低表达聚类为低干性亚型，中表达聚类为中干性亚型，高表达聚类为高干性亚型(图1)。
[0062]
注：
①
最长距离(maximum)是一种常用的距离度量方式，也称为chebyshev距离或l∞距离。它计算的是两个向量或样本之间在各个维度上差异的最大值。其公式可以表示为：
[0063]
d_max(x,y)＝max(|x1-y1|,|x2-y2|,...,|x9
–
y9|)
[0064]
其中，x＝(x1,x2,...,x9)和y＝(y1,y2,...,y9)分别是两个向量或样本在9个干性分型基因维度上的取值。"||"表示取绝对值运算，max表示取最大值运算。
[0065]
②
ward.d2(也称为ward's方法)是一种用于层次聚类的聚合策略，它衡量了两个聚类簇之间的差异。其公式可以表示为：
[0066]
d^2(c1∪c2,c3)＝(|c1∪c2∪c3|/|c1∪c2|)*d^2(c1,c3)+(|c1∪
[0067]
c2∪c3|/|c1∪c2|)*d^2(c2,c3)-(|c3|/|c1∪c2|)*d^2(c1,c2)
[0068]
其中，c1和c2是要合并的两个聚类簇，c3是已经合并的其他聚类簇，||表示聚类簇的元素数量，d^2(x,y)表示聚类簇x和y之间的平方最长距离。
[0069]
该公式的含义是：在合并c1和c2形成新的聚类簇c1∪c2后，模拟在合并聚类簇c1和c2之前所获得的结果，通过考虑三个方面的贡献：c1∪c2∪c3与c1∪c2之间的大小差异、c1∪c2∪c3与c1∪c2之间的距离差异以及c3与c1∪c2之间的距离差异。ward.d2聚合策略旨在最小化合并后的聚类簇内部的方差增加。具体来说，它选择使得合并后聚类簇的方差增加最小的两个聚类簇进行合并，以保持聚类结果的紧凑性和稳定性。
[0070]
本发明的检测试剂盒将被用于检测前列腺癌患者活检样本，并依据检测结果给出患者分型结果。分型结果将用于指导患者的个体化治疗。
[0071]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.dlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr和top2a的基因组合在制备用于前列腺癌干性分型的检测试剂盒中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测dlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr、top2a的上、下游引物序列。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒还包括作为内参照的管家基因的引物。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述管家基因为β-actin。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：总rna抽提试剂、和/或pcr反转录试剂、和/或pcr定量试剂。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述总rna抽提试剂包括trizol试剂。7.一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，其特征在于，包括检测dlgap5、cdk1、ska3、kif4a、bub1、tpx2、ncapg、hmmr、top2a的上、下游引物序列。8.如权利要求7所述的一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括作为内参照的管家基因的引物。9.如权利要求8所述的一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，其特征在于，所述管家基因为β-actin。10.如权利要求7所述的一种用于前列腺癌分子分型检测的试剂盒，其特征在于，还包括：总rna抽提试剂、和/或pcr反转录试剂、和/或pcr定量试剂。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，公开了DLGAP5、CDK1、SKA3、KIF4A、BUB1、TPX2、NCAPG、HMMR和TOP2A的基因组合在制备用于前列腺癌干性分型的检测试剂盒中的应用。还公开了一种用于前列腺癌干性分型检测的试剂盒，包括检测DLGAP5、CDK1、SKA3、KIF4A、BUB1、TPX2、NCAPG、HMMR、TOP2A的上、下游引物序列。本发明的检测试剂盒，能客观、准确、灵敏地对前列腺癌进行干性分型，协助前列腺癌患者选择敏感治疗方法，从而有助于提高患者预后。从而有助于提高患者预后。从而有助于提高患者预后。


技术研发人员：郝洁 邹欣 郑坤 胡晓勇
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.08.23
技术公布日：2023/10/11