一种白术离体根的培养方法与流程

1.本发明涉及白术离体根培养技术领域，尤其涉及一种白术离体根的培养方法。


背景技术：

2.白术(学名：atractylodes macrocephala koidz)：菊科苍术属多年生草本植物，主产于浙江、江苏、安徽、四川、重庆、云南、贵州、湖北等省市，是著名中药材“浙八味”之一，为我国常用大宗中药材品种之一，具有健脾益气、燥湿利水、安胎、和胃、固表、止汗等功能，主治脾虚食少、消化不良、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等症。白术根茎含挥发油，油中主要成分为苍术酮、苍术醇、白术内酯等。现代药理研究表明，白术具有利尿、降低血糖升高白细胞等功效。
3.文献分析表明，自白术栽培研究有记载以来，各地相继开展了多种方式的繁殖技术研究工作，包括自然变异选育、多倍体及诱变育种、组织培养等，同时还对白术开展了无性系选育和分子标记等研究工作。但在栽培过程中，白术的繁殖一直以无性繁殖为主，然而白术为异花授粉杂合体，无性后代性状混杂，多代有性繁殖后常导致严重的种性退化，表现为抗性减弱、病虫害日趋严重、产量和质量下降等。严重制约了白术生产的发展，不利于白术药用资源的开发利用。
4.目前利用生物技术进行中药资源繁殖并大规模生产其有效成分已成为一条新的发展途径。但由于药用植物的大多数有效成分均为次生代谢产物，其合成在细胞阶段稳定性差，导致通过细胞培养生产的药用植物有效成分的含量不稳定，因此不能实现大量生产。离体根培养技术作为新发展起来的技术，以植物离体根作为培养对象，具有培养时间短、不受生长季节限制、次生代谢物含量稳定、产量大的特点，成为根茎类药用植物生产次生代谢物的主要途径。因此，建立快速生长的根无性繁殖体系，可实现根茎类药用植物次生代谢物的工业化生产，从而有效的解决野生药用植物资源不足等问题。白术的根是主要的入药部位。将植物离体根增殖培养技术应用培养白术根茎活性成分定向提取原材料，可在短时间内大量获得白术的离体根及次生代谢产物(有效成分)。
5.基于此，本发明提出了一种白术离体根的培养方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种白术离体根的培养方法。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种白术离体根的培养方法，包括以下步骤：
9.(1)将消毒后的白术种子接种至启动培养基中培养，得到白术无菌种胚；
10.(2)将所述白术无菌种胚接种至离体根固体诱导培养基，进行暗培养，得到白术离体根；
11.(3)将所述白术离体根接种至离体根固体增殖培养基，继续进行暗培养，得到增殖的白术离体根。
12.优选的，步骤(1)所述启动培养基的组成为：ms+ga
3 0.3～0.5mg/l+琼脂7.0～7.5g/l+蔗糖25～30g/l；所述启动培养基的ph值为5.8～6.0。
13.优选的，步骤(1)所述培养时的光照强度为2000～2500lx，每天的光照时间为14～16h，培养的温度为25℃
±
2.0℃，培养时间为5～7天。
14.优选的，步骤(2)所述离体根固体诱导培养基的组成为：1/2ms+naa 0.3～0.8mg/l+iba 0.3～0.5mg/l+蔗糖25～30g/l+琼脂7.2～7.6g/l；所述离体根固体诱导培养基的ph值为5.8～6.0。
15.优选的，步骤(2)所述离体根固体诱导培养基的培养时间为10～15天。
16.优选的，步骤(2)所述白术离体根培养至长度为2～4cm后，切割至长度为0.8～1.2cm，再转移至所述离体根固体增殖培养基。
17.优选的，所述离体根固体增殖培养基的组成为：1/2ms+naa 0.5～0.8mg/l+蔗糖30～40g/l+琼脂7.2～7.6g/l；所述离体根固体增殖培养基的ph值为5.8～6.0。
18.优选的，步骤(2)和步骤(3)中所述暗培养的时间为15～20d，温度为23～27℃，湿度为50％～65％。
19.本发明将消毒后的白术种子依次经过启动培养基、离体根固体诱导培养基、离体根固体增殖培养基培养后，得到白术的离体根。本发明提供的培养方法不受生长季节限制，通过建立快速生长的白术离体根无性繁殖体系，可在短时间内大量获得白术离体根，且得到的白术离体根的分支多，根系粗壮。
20.采取本发明的培养方法，诱导白术离体根的成功率在90％以上，与现有的白术常规种植方法相比，本技术在缩短白术根部药用部位培养时间的同时，还显著的提高了白术根部药用部位的产量，并且还保持了白术根部次生代谢产物的稳定性，为今后利用白术离体根增殖体系实现白术根部药用有效成分的稳定、快速生产和白术药用有效成分的工业化提取奠定了基础。同时也解决了野生白术原料的供需矛盾问题，进一步开发了宝贵的中药资源。
附图说明
21.图1为实施例1白术成熟种子；
22.图2为实施例1白术种子在启动培养基中培养7d露出种胚的状态；
23.图3为实施例1中在白术离体根固体诱导培养基中培养10d长出的白术离体根；
24.图4为实施例1中白术离体根在固体增殖培养基中培养14天的生长情况；
25.图5为实施例1中白术离体根在固体增殖培养基中培养20d的生长状态；
26.图6为实施例1中白术离体根在固体增殖培养基中培养40d的生长情况。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.实施例1
29.启动培养基的组成为：ms+ga30.4mg/l+琼脂7.0g/l+蔗糖30g/l，ph值为6.0。
30.离体根固体诱导培养基的组成为：1/2ms+naa 0.5mg/l+iba 0.5mg/l+蔗糖30g/l+
琼脂7.2g/l，ph值为6.0。
31.离体根固体增殖培养基的组成为：1/2ms+naa 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.4g/l，ph值为6.0。
32.(1)选取粒大、饱满的白术种子快速经过酒精灯火焰除种皮上的毛茸，除去毛绒后用75％的酒精消毒40s，用水冲洗2遍，再用0.1％的氯化汞(hgcl2)消毒5min，用水冲洗2遍，得到消毒的白术种子；在25℃环境下，将消毒的白术种子接种到启动培养基中(如图1所示)，在光照强度2000～2500lx、光照时间为16h/d、温度为25℃
±
2.0℃的条件下培养7天，得到白术无菌种胚(如图2所示)；
33.(2)将步骤(1)得到的白术无菌种胚接种至离体根固体诱导培养基，25℃、55％湿度的条件下，进行暗培养，在培养第10d观察白术离体根的生长情况，如图3所示，继续培养至白术离体根长度达到3.0cm；
34.(3)将步骤(2)得到的白术离体根切割至长度为1.0cm，再接种至离体根固体增殖培养基，在25℃、55％湿度的条件下，继续进行暗培养，分别在培养的14天、20天、40天观察白术离体根的生长情况，结果如图4～6所示。可见，本实施例可在短时间内培养得到大量的白术离体根。
35.实施例2
36.采取实施例1所述方法，探究在不添加激素的情况下，不同培养基对白术离体根诱导效果的影响，结果如表1所示。其中各培养基的组成为：
37.ms培养基：硫酸铵1.32g/l、硝酸钾2.0g/l、7水硫酸镁0.36g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、氯化钙0.44g/l、硫酸锰0.0168g/l、7水硫酸锌0.0085g/l、硼酸0.0065g/l、碘化钾0.00083g/l、钼酸钠0.00025g/l、硫酸铜0.000025g/l、氯化钴0.000025g/l、7水硫酸铁0.0278g/l、乙二胺四乙酸二钠0.0373g/l、甘氨酸0.0020g/l、盐酸硫胺素0.0004g/l、盐酸吡哆醇0.0005g/l、肌醇0.010g/l。
38.white培养基：硝酸钾80.0mg/l、柠檬酸2.0mg/l、硝酸钙287.0mg/l、硫酸镁738.0mg/l、硫酸钠53.0mg/l、氯化钾65.0mg/l、磷酸二氢钠19.1mg/l、盐酸硫胺素(维b1)0.1mg/l、盐酸吡哆素(维b6)0.1mg/l、盐酸0.5mg/l、甘氨酸3.0mg/l、、硫酸锰6.6mg/l、硫酸锌2.7mg/l、碘化钾0.75mg/l、硼酸1.5mg/l。
39.b5培养基：硝酸钾2.5g/l、mgso4·
7h2o 0.25g/l、cacl2·
2h2o 0.15g/l、(nh4)2so40.1340g/l、nah2po4·
h2o 0.1500g/l、ki 0.00075g/l、h3bo
4 0.0030g/l、mnso4·
4h2o 0.010g/l、znso4·
7h2o 0.0020g/l、na2moo4·
2h2o 0.00025g/l、cocl2·
6h2o 0.000025g/l、cuso4·
5h2o 0.000025g/l、na
2-edta 0.0373g/l、feso4·
7h2o 0.0278g/l、肌醇0.10g/l、烟酸0.0010g/l、盐酸吡哆醇0.0010g/l、盐酸硫铵0.010g/l。
40.表1不同培养基对白术离体根的影响
[0041][0042]
由表1可知，白术离体根在不同培养基中的生长状态差异较大，取同一培养时间(固体增殖培养基中生长30d材料)进行比较发现：在1/2ms培养基中离体根的生长情况最好，平均分支数达到18.68个，鲜重达到2.41g；在white培养基中离体根的生长情况最差，2/3ms培养基和b5培养基的离体根分支也较多，鲜重也较高，但总体不如1/2ms培养基。由上可知，1/2ms培养基中离体根的生长情况最好，适用于白术离体根培养。
[0043]
实施例3
[0044]
采取实施例1的培养方法，探究在培养基相同(均为1/2ms)的情况下，不同离体根固体诱导培养基中激素的种类和添加量对白术离体根诱导效果的影响，分组如下，结果如表2所示。
[0045]
每组的培养基和激素组成为：
[0046]
1组：1/2ms+naa 0.2mg/l；
[0047]
2组：1/2ms+naa 0.5mg/l；
[0048]
3组：1/2ms+iba 0.5mg/l；
[0049]
4组：1/2ms+iba 1.0mg/l；
[0050]
5组：1/2ms+naa 0.8mg/l；
[0051]
6组：1/2ms+naa 0.3mg/l+iba 0.3mg/l；
[0052]
7组：1/2ms+naa 0.5mg/l+iba 0.5mg/l。
[0053]
表2不同培养基对白术离体根的诱导影响
[0054]
组别培养基配比诱导成功率(％)11/2ms+naa 0.2mg/l80.1621/2ms+naa 0.5mg/l84.1731/2ms+iba 0.5mg/l86.3641/2ms+iba 1.0mg/l78.1251/2ms+naa 0.8mg/l80.2861/2ms+naa 0.3mg/l+iba 0.3mg/l90.2171/2ms+naa 0.5mg/l+iba 0.5mg/l93.57
[0055]
由表2可见，1/2ms+naa0.5 mg/l+iba 0.5mg/l为白术离体根培养的最适离体根固体诱导培养基，白术离体根的诱导率为93.57％。
[0056]
综上，本发明提供的白术离体根的培养方法，可在短时间内培养得到大量的白术离体根，并且培养的白术离体根的分支多，根系粗壮，且诱导率高。与现有的白术常规种植方法相比，本技术在缩短白术根部药用部位培养时间的同时，还显著的提高了白术根部药用部位的产量，并且还保持了白术根部次生代谢产物的稳定性，能够快速大量获得白术的离体根，实现白术离体根次生代谢产物的工业化生产。
[0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种白术离体根的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将消毒后的白术种子接种至启动培养基中培养，得到白术无菌种胚；(2)将所述白术无菌种胚接种至离体根固体诱导培养基，进行暗培养，得到白术离体根；(3)将所述白术离体根接种至离体根固体增殖培养基，继续进行暗培养，得到增殖的白术离体根。2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)所述启动培养基的组成为：ms+ga30.3～0.5mg/l+琼脂7.0～7.5g/l+蔗糖25～30g/l；所述启动培养基的ph值为5.8～6.0。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)所述培养时的光照强度为2000～2500lx，每天的光照时间为14～16h，培养的温度为25℃
±
2.0℃，培养时间为5～7天。4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述离体根固体诱导培养基的组成为：1/2ms+naa 0.3～0.8mg/l+iba0.3～0.5mg/l+蔗糖25～30g/l+琼脂7.2～7.6g/l；所述离体根固体诱导培养基的ph值为5.8～6.0。5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述离体根固体诱导培养基的培养时间为10～15天。6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述白术离体根培养至长度为2～4cm后，切割至长度为0.8～1.2cm，再转移至所述离体根固体增殖培养基。7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述离体根固体增殖培养基的组成为：1/2ms+naa 0.5～0.8mg/l+蔗糖30～40g/l+琼脂7.2～7.6g/l；所述离体根固体增殖培养基的ph值为5.8～6.0。8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述暗培养的时间为15～20d，温度为23～27℃，湿度为50％～65％。

技术总结
本发明提供了一种白术离体根的培养方法，属于白术离体根培养技术领域。本发明提供的一种白术离体根的培养方法，包括以下步骤：(1)将消毒后的白术种子接种至启动培养基中培养，得到白术无菌种胚；(2)将所述白术无菌种胚接种至离体根固体诱导培养基，进行暗培养，得到白术离体根；(3)将所述白术离体根接种至离体根固体增殖培养基，继续进行暗培养，得到增殖的白术离体根。本发明提供的培养方法可在短时间内大量获得白术离体根，且得到的白术离体根的分支多，根系粗壮，诱导成功率在90％以上。诱导成功率在90％以上。诱导成功率在90％以上。


技术研发人员：郭兰萍 张成才 黄璐琦 王升 王红阳 闫滨滨 康传志 代晓雨
受保护的技术使用者：德兴市中医研究院试验培训基地
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/11