一种复合微生物菌剂及其在水稻促生抗病降镉中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，公开了一种复合微生物菌剂及其在水稻促生抗病降镉中的应用。


背景技术：

2.水稻作为我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40％，其产量的高低直接关系着国家的粮食安全。施肥是提高水稻单位面积产量的重要措施之一。化肥的施用对我国农业的发展功不可没，但过量及长期不合理使用化肥导致了很多环境问题的出现，如土壤中重金属元素富集、土壤生物多样性被破坏和耕地肥力退化等。随着人们对绿色无公害食品日益增长的需要以及农业生态环境保护的要求，微生物菌剂及微生物肥料的研究开发和应用越来越受到重视。许多研究表明，微生物菌剂和微生物菌肥在生物防治、土壤改良、促进作物营养吸收、增强植物健康水平、提高作物产量和品质等方面发挥了积极作用。
3.农用微生物菌剂主要分单一菌剂和复合菌剂，单一菌剂是由一种功能微生物制成；复合菌剂是由两种或以上的有益微生物组成。常使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、细黄链霉菌、绿色木霉、哈茨木霉、菌根真菌等。与单一菌剂相比，复合菌剂通常会具有一定的协同作用，具有种类更多样、定殖水平更高且功能更齐全等优点，能更好地影响植株的生理代谢活动。目前，有关用于水稻抗病、促生和降镉的多功能复合菌剂的报道极少，而水稻作为重要的粮食作物，对多功能复合菌剂的需求较大。因此，本发明以水稻为研究对象，期望能够挖掘在增产、防治水稻稻瘟病和降米镉方面具有显著效果的微生物复合菌剂。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺陷，本发明将来源、特性和功能不同的微生物有机组合，通过基质育苗试验筛选获得对水稻幼苗具有明显促生效应的复合微生物菌剂(20-10+ahn65)。田间小区试验显示复合菌剂(20-10+ahn65)处理能增产19.35％，对稻瘟病最高防效为56.74％，米镉降低率最高可达26.42％，均显著高于单一菌剂的增产、抗病和降镉效果，体现了微生物菌群的协同增效作用。复合微生物菌剂(20-10+ahn65)绿色环保，对人畜无害，其增产、抗病和降镉效果显著，可用于新型微生物药肥的开发与应用。
5.本发明的首要目的是提供一种复合微生物菌剂，
6.所述复合微生物菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)和链霉菌(streptomyces sp.)两种微生物。
7.进一步地，具体采用的贝莱斯芽孢杆菌20-10的分类命名为bacillus velezensis，其保藏编号为cctcc no:m 20221980，保藏日期为2022年12月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；链霉菌ahn65的分类命名为streptomyces sp.，其保藏编号为cctcc no:m20221981，保藏日期为2022年12月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保
藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
8.所述的复合微生物菌剂采用贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液混合配制，获得的复合微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌20-10的活菌数为1
×
10
10
～5
×
10
10
cfu/ml，链霉菌ahn65孢子的浓度为1
×
10
10
～5
×
10
10
cfu/ml。
9.进一步地，贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液等比例配制完成。
10.本发明的第二个目的是提供一种上述的复合生物菌剂的制备方法，包括步骤：将贝莱斯芽孢杆菌20-10和链霉菌ahn65分别进行培养，以获得贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子粉，链霉菌ahn65的孢子粉用0.05％吐温80水溶液进行悬浮制得孢子悬浮液，随后将贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液分别稀释至预定浓度后按1:1的比例进行配制，获得所述复合微生物菌剂。
11.进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌20-10培养过程中所用的发酵种子液培养基配方：氯化钠10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，ph值为7.2，即lb培养基配方；发酵培养基配方：淀粉20g/l，甘露醇1g/l，黄豆粉10g/l，蛋白胨2g/l，氯化钠2g/l，七水硫酸镁0.5g/l，ph值为7.2。
12.进一步地，所述链霉菌培养过程中所用的液体培养基配方：麦芽提取物10g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖4g/l，ph值为7.2，即isp2培养基配方；固体培养基配方：甘露醇20g/l，大豆粉20g/l，琼脂20g/l，ph值为7.2，具体地，所述配方为ms平板配方。
13.进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌20-10培养方法具体步骤包括：将贝莱斯芽孢杆菌20-10在平板上划线活化，30℃恒温培养箱中培养12～18h，待长出单菌落以后，挑取单菌落接种于lb种子培养基中，于30℃、180rpm/min条件下振荡培养过夜，制成种子液；将种子液按2％接种量接种至发酵培养基中，30℃、180rpm/min条件下振荡培养3d，获得贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液。
14.进一步地，所述链霉菌ahn65培养方法及其孢子悬浮液制备方法具体步骤包括：挑取新鲜的ahn65分生孢子转接至液体isp2培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养过夜，用移液枪取200μl振荡培养过夜的菌液转移至ms平板上，涂布均匀后置于28℃恒温培养箱中倒置培养5～7天，用称量勺刮取孢子粉至无菌的50ml离心管中，加入浓度为0.05％的吐温80水溶液进行悬浮获得链霉菌ahn65的孢子悬浮液。
15.更进一步地，分别将贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液稀释至预定浓度后按1:1的比例均匀混合复配，获得所述复合微生物菌剂；配制完成后，复合微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌20-10的活菌数和链霉菌ahn65的孢子浓度均可达1
×
10
10
～5
×
10
10
cfu/ml。
16.本发明的第三个目的是提供一种上述的复合微生物菌剂在促进水稻生长和/或防治水稻病害和/或降低稻米重金属含量中的应用。
17.进一步地，所述促进水稻生长包括增加水稻幼苗的根长、茎长和茎横切面积，还包括增加水稻的稻谷产量。
18.进一步地，所述水稻病害包括水稻稻瘟病。
19.进一步地，所述降低稻米重金属含量包括降低米镉含量。
20.更进一步地，应用的方法包括采用所述的复合微生物菌剂稀释200～400倍后进行
浸种；或者在水稻生长的关键节点将所述复合微生物菌剂稀释200～400倍后喷施使用。
21.进一步地，所述水稻生长的关键节点包括分蘖期、抽穗期。
22.进一步地，所述复合微生物菌剂的施用频率及用量为：露白种子播种前进行浸种1h，用量为5l(菌剂稀释液)/5kg(露白种子)；分蘖期和抽穗期分别进行喷雾处理，喷施用量为50l(菌剂稀释液)/亩。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.(1)本发明采用的贝莱斯芽孢杆菌20-10分离自水稻根际土，具有极强的生物膜形成能力，可快速定殖于水稻根际周围，促进水稻根系营养的吸收；链霉菌ahn65分离自水稻茎组织，属于植物内生菌，与水稻具有天然的亲和力；与现有技术相比，复合微生物菌剂(20-10+ahn65)在水稻植株中的定殖速度更快，生防稳定性更好，促生能力更强。(2)本发明中的两种微生物菌株20-10和ahn65兼具固氮、解钾、产铁载体、产iaa、抗病、吸附重金属等功能，将它们组合成复合菌剂后，能显著促进水稻的增产、抗稻瘟病和降米镉效果，生物功能高于现有同类微生物药肥产品。(3)本发明的复合微生物菌剂属于高效多功能的环境友好型生物制剂，绿色环保，效果显著，能增加稻谷产量19.35％，对稻瘟病最高防效为56.74％，米镉降低率最高可达26.42％；使用本发明的复合微生物菌剂可以减少化肥农药的使用，提升稻米品质，推进水稻绿色有机生产的发展。
附图说明
25.图1是菌株20-10基于16s rrna的系统发育树；
26.图2是菌株ahn65基于16s rrna基因的系统发育树；
27.图3是基质育苗试验中复合微生物菌剂(20-10+ahn65)对水稻幼苗的促生效果图；
28.图4是复合微生物菌剂(20-10+ahn65)及其单一菌株培养48h后对不同重金属离子的吸附效果。
具体实施方式
29.以下结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不会形成对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
30.实施例1两株功能菌株20-10和ahn65的分离筛选及鉴定
31.本实例为两株功能菌株20-10和ahn65的分离筛选及鉴定过程，其具体包括步骤：
32.(1)功能菌株的筛选
33.菌株来源：20-10由辽宁省阜新市的水稻根际土中分离得到；ahn65由海南水稻稻瘟病发病区的未发病水稻茎组织中分离得到。
34.菌种分离方法：贝莱斯芽孢杆菌20-10的分离参照稀释平板涂布法，对土壤细菌进行分离。取100μl稀释液依次涂布在nb固体培养基上，每个梯度3个重复，于28℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在-80℃冰箱中备用。通过初筛和复筛，挑取具有高效固氮、溶磷、解钾、产铁载体和吲哚乙酸(indole acetic acid，iaa)的微生物菌株。
35.菌种分离方法：链霉菌ahn65的分离参照植物内生菌分离法。从海南三亚市水稻田中采集轻度发病和未发病的水稻组织，清洗、表面消毒，然后将茎剪成1cm左右长的小段，放置于twye培养基中，于37℃培养，待内生放线菌从组织中析出，将其挑出转移到1/2pda培养基中划线进行分离纯化，从而获得该菌的纯培养物。纯化后的菌株用25％的甘油悬浮储存至-80℃冰箱。在isp2培养基上采用平板对峙法对分离、纯化后的菌株进行筛选，通过初筛和复筛挑取抑制稻瘟病菌效果最好的菌株。
36.(2)功能菌株的鉴定
37.采用上海生物工程有限公司细菌总dna提取试剂盒提取细菌20-10和放线菌ahn65的基因组dna，扩增其16s rrna序列，引物序列见表1。pcr产物经电泳纯化后送上海擎科生物有限公司长沙分公司进行测序，测序结果在genbank数据库中进行blast序列比对，并运用软件clustalw2和mega 7.0，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。
38.基于16s rrna的进化树(图1)显示，20-10菌株与贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)标准菌株nrrl b-41582同处一个分支，相似性达到99.86％，因此鉴定20-10为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株该菌株于2022年12月19号保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc m 20221980。
39.基于16s rrna的进化树(图2)显示，ahn65菌株与链霉菌(streptomyces sp.)标准菌株atcc 4.1838的同源性最高，为99.48％，因此鉴定ahn65为链霉菌。该菌株于2022年12月19号保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc m 20221981。
40.表1pcr扩增16s rrna基因序列所需引物序列
[0041][0042]
实施例2基质育苗试验中促生复合菌群的筛选
[0043]
本实例为促生复合菌群(20-10+ahn65)在基质育苗试验中的筛选过程，其具体包括步骤：(1)复合菌剂的配制
[0044]
将表2中来源、特性和功能不同的6种微生物菌株有机组合，构建9个微生物菌群：(c7-1+ahn65)、(c7-1+s11-11)、(c7-1+c10-19)、(c7-1+21-10)、(c7-1+l26)、(20-10+ahn65)、(20-10+l26)、(20-10+c10-19)、(20-10+s11-11)。细菌接种至100ml液体lb培养基中，30℃，180r/min振荡培养16h，以平板菌落计数法测定菌液浓度，用无菌水将菌液浓度稀释至108cfu/ml备用；放线菌接种涂布于isp2平板上，28℃培养3～5d，待培养皿产满孢子，用称量勺刮取孢子粉至无菌的50ml离心管中，用适量的含0.05％吐温的水溶液悬浮，悬浮
液中分生孢子浓度采用血球计数板计数，并用0.05％吐温水溶液将其稀释至108cfu/ml备用；将稀释好的菌液或分生孢子悬浮液以1:1的比例混合，获得试验所需的9种复合菌剂。
[0045]
表2供试的6株功能菌株
[0046][0047]
(2)基质育秧及生长指标测定
[0048]
将生物有机肥、灭菌土和蛭石按质量比1.5：3：1配制育秧基质，并按2.5kg/盘的标准将基质均匀铺在塑料育秧盘(58cm
×
28cm)中待用。选取颗粒饱满的水稻种子，先用75％的乙醇表面消毒5min，然后用1％naclo浸泡5min，无菌水清洗3～5次。将表面消毒后的种子置于滤纸保湿的培养皿中，于30℃恒温箱中催芽至露白，而后将露白种子按30g/盘的量均匀撒在铺满基质的育秧盘中，并以100ml/盘的标准喷施配制好的复合菌剂，对照喷施等量的无菌水。菌剂喷施完成后在种子表面覆盖一层薄的基质并喷施适量清水用于保湿，随后将育秧盘转移至温室大棚正常培养并注意保湿。待育秧盘中的水稻苗生长至3～4叶期时，将幼苗拔出，洗净根部杂质后测量根长、茎长及茎横切面积，每个处理统计30根幼苗。
[0049]
促生复合菌群的筛选结果：
[0050]
在基质育苗试验中，构建的9个微生物菌群对水稻幼苗的促生作用如表3所示。9个微生物菌群都能有效促进水稻幼苗的生长，经它们处理过的水稻幼苗的根长、茎长和茎横切面积相比对照均有不同程度的提高。其中，菌剂(20-10+ahn65)的促生效果最为突出(图3)，其根长、茎长和茎横切面积比对照分别提高了50.04％、15.05％和82.97％，三个促生指标的提高比例均排在首位，因此选择该菌剂组合及其单一菌株进行了后续试验。
[0051]
表3微生物菌群对水稻幼苗的促生效果
[0052][0053]
注：数值＝均值
±
标准误差，不同小写字母表示差异显著性(p《0.05)，“—”表示未测出，下文同
[0054]
实施例3菌株的重金属耐受和吸附试验
[0055]
本实例为菌株20-10、ahn65和复合菌群(20-10+ahn65)对重金属的耐受和吸附方面的验证，其具体包括步骤：
[0056]
采用96孔细胞培养板对菌株的重金属耐受水平进行检测。分别在lb和isp2培养液中加入cd
2+
、as
3+
、pb
2+
离子母液，配置含不同重金属离子的培养液。浓度梯度设置10个梯度，
其中，cd
2+
的梯度浓度为5～2560mg/l，as
3+
和pb
2+
的梯度浓度为12.5～3200mg/l。将含有不同重金属离子的培养液加入96孔细胞培养皿中，每孔200ul，并按2％的接种量接入提前活化好的微生物菌株，700rpm，28℃培养，分别在24h和48h在酶标仪中检测细胞培养板在600nm处的光密度，根据菌体浓度评估菌株在不同梯度浓度重金属离子的条件下的生长状况。
[0057]
在此基础上，选择初始cd
2+
浓度为10mg/l、as
3+
和pb
2+
浓度为25mg/l检测菌株对重金属的吸附水平。在500ml三角瓶中装入含有相应重金属浓度的lb/isp2液体培养基50ml，经灭菌后，将活化好的菌株/菌群按2％的接种量接入其中，28℃，180rpm培养48h。然后将发酵液12000rpm，4℃离心10min，收集上清并通过0.22μm的滤膜过滤，获得滤液，使用原子吸收分光光度计测定滤液中cd
2+
、pb
2+
的浓度，使用原子荧光光度计测定滤液中as
3+
的浓度，并根据以下公式计算菌株/菌群的重金属离子吸附率。
[0058]
重金属离子吸附率＝(初始重金属离子浓度-滤液重金属离子浓度)/初始重金属离子浓度
×
100。
[0059]
菌株20-10、ahn65和菌群(ahn65+20-10)对重金属的耐受性和吸附结果：
[0060]
菌株20-10、ahn65和菌群(ahn65+20-10)对不同梯度浓度的重金属离子的耐受性如表4所示。从表4中可以看出，菌株20-10和ahn65对三种重金属离子均具有一定的耐受性，且对pb
2+
和cd
2+
的耐受性较好，即使在含超高浓度pb
2+
(3200mg/l)和cd
2+
(2560mg/l)的环境下也能生长，只是生长速度稍低于对照。同时，我们还能发现，菌群(ahn65+20-10)对重金属离子的耐受性相比单一菌株有所提高，其在高浓度的as
3+
(1600mg/l)环境中依然能生存，且在较高浓度的pb
2+
(2400mg/l)和cd
2+
(1280mg/l)环境中还能较快生长，说明菌群(ahn65+20-10)进行组合后可以对重金属的耐受起到协同增效的作用。对重金属的吸附试验结果显示(图4)，复合菌剂对重金属的吸附能力显著高于单一菌剂，进一步说明，要想获得更好的降重金属效果，将多种功能微生物进行组合的策略是正确的。
[0061]
表4菌株20-10、ahn65和菌群(ahn65+20-10)对不同重金属离子的耐受性
[0062][0063]
注：+++表示生长良好，++表示生长一般，+表示生长不好但能生存，-表示不能生长。
[0064]
实施例4复合微生物菌剂(20-10+ahn65)在田间的应用
[0065]
本实施为菌株20-10、ahn65和复合生物菌剂(20-10+ahn65)进行水稻促生、水稻病害(稻瘟病)防治和稻米降镉方面的验证，其具体步骤包括：
[0066]
(1)试验设计
[0067]
2022年4～10月，在湖南省益阳市岳家桥镇岳家桥村开展田间小区试验，分早稻和晚稻两季。设复合菌剂(ahn65+20-10)、单一菌剂ahn65、单一菌剂20-10和清水对照四个处理，每667m2按50l水量均匀喷雾。小区处理面积20m2(5m
×
4m)，每处理4次重复，小区随机排列。
[0068]
(2)菌剂配制
[0069]
将贝莱斯芽孢杆菌20-10在平板上划线活化，30℃恒温培养箱中培养12～18h，待长出单菌落以后，挑取单菌落接种于lb种子培养基中，于30℃、180rpm/min条件下振荡培养过夜，制成种子液；将种子液按2％接种量接种至发酵培养基中，30℃、180rpm/min条件下振荡培养3d，获得贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液。以平板菌落计数法统计20-10发酵液中活菌的数量，然后用无菌水将其稀释成108cfu/ml的浓度，即为20-10单一菌剂。
[0070]
挑取新鲜的ahn65分生孢子转接至液体isp2培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养过夜，用移液枪取200μl振荡培养过夜的菌液转移至ms平板上，涂布均匀后置于28℃恒温培养箱中倒置培养5～7天，用称量勺刮取孢子粉至无菌的50ml离心管中，加入浓度为0.05％的吐温80水溶液进行悬浮获得链霉菌ahn65的孢子悬浮液。悬浮液中分生孢子浓度采用血球计数板计数，并用0.05％吐温水溶液将其稀释至108cfu/ml，即为ahn65单一菌剂。
[0071]
将稀释好的20-10单一菌剂和ahn65单一菌剂以1:1的比例混合，即为试验所需的复合生物菌剂(20-10+ahn65)。
[0072]
(3)菌剂处理
[0073]
选取颗粒饱满的种子，清水浸泡24h后于30℃恒温室中催芽40h至露白。将露白的种子置于配制好的菌剂中浸泡1h，以无菌水处理为空白对照，而后将浸泡好的种子转移至秧田自然生长。小区按16行
×
21行的标准人工插秧，并在水稻生长至分蘖期和抽穗期各喷施一次菌剂，空白对照喷施等量的清水。
[0074]
(4)小区数据调查
[0075]
分别对早稻和晚稻中各小区的稻谷进行产量和米镉含量测定。晚稻依据国际稻瘟病圃irbn的标准对苗瘟和穗颈瘟发病情况进行统计，7月底调查叶瘟，每个处理选取40株幼苗；9月中旬调查穗颈瘟，每小区5点取样法，每点10穴，共50穴。根据以下公式计算各个小区中叶瘟和穗颈瘟的发病率和病情指数，评估不同菌剂防治水稻稻瘟病的效果。
[0076]
发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)
×
100；病情指数＝[σ(各病级植株数
×
各级代表数值)/调查总植株数
×
最高级别值]
×
100；病情指数防治效果(％)＝[(对照病指数-处理病指数)/对照病指数]
×
100。
[0077]
复合菌剂处理对田间水稻产量和米镉含量的影响：
[0078]
菌剂处理后，田间各小区的水稻产量如表5所示。从表5中我们可以看出，菌剂处理能明显促进水稻产量提高，且复合菌剂比单一菌剂增产效果更显著，其早稻和晚稻增产率分别可达19.35％和18.74％。菌剂处理对水稻米镉含量的影响如表6所示。从表6中可以发现，复合菌剂处理的米镉降低率依然显著高于单一菌剂，体现了微生物菌群的协同增效作用。此外，晚稻的产量低于早稻且晚稻米镉含量高于早稻，可能与2022年8月当地气候过于干旱有关，这也导致米镉降低效果晚稻比早稻低。
[0079]
表5菌剂处理对水稻产量的影响
[0080][0081]
表6菌剂处理对水稻米镉含量的影响
[0082][0083]
复合菌剂处理对田间水稻抗稻瘟病的影响：
[0084]
微生物菌剂处理能显著提高水稻对稻瘟病的抗病水平，特别是复合菌剂处理的防治效果显著高于两种单一菌剂，其对水稻苗瘟和穗颈瘟的生物防效分别高达53.38％
±
2.17％和56.74％
±
5.42％(表7)。令人意外的是，菌株20-10在实验室条件下对稻瘟病病原菌几乎没有拮抗作用，但是在田间小区试验中，该菌剂对叶瘟和穗颈瘟的防效分别为23.18％和23.78％，生防效果明显。分析其原因，可能该菌株的处理在促进水稻生长的同时，提高了水稻的抗病性。
[0085]
表7菌剂处理对水稻抗稻瘟病的影响
[0086]

技术特征：
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)和链霉菌(streptomyces sp.)两种微生物。2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为20-10，其保藏编号为：cctcc no:m 20221980；所述链霉菌为ahn65，其保藏编号为：cctcc no:m 20221981。3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，采用贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液混合配制，获得的复合微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌20-10的活菌数为1
×
10
10
～5
×
10
10
cfu/ml，链霉菌ahn65孢子的浓度为1
×
10
10
～5
×
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cfu/ml。4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液稀释至预定浓度后以等比例配制完成。5.权利要求1～4任一项所述的复合生物菌剂的制备方法，包括步骤：将贝莱斯芽孢杆菌20-10和链霉菌ahn65分别进行培养，以获得贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子粉，链霉菌ahn65的孢子粉用0.05％的吐温80水溶液进行悬浮制得孢子悬浮液，随后将贝莱斯芽孢杆菌20-10的发酵液和链霉菌ahn65的孢子悬浮液稀释至预定浓度后以等比例混合配制，获得所述复合微生物菌剂。6.一种如权利要求1～4任一项所述的复合微生物菌剂在促进水稻生长和/或防治水稻病害和/或降低稻米重金属含量中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述促进水稻生长包括增加水稻幼苗的根长、茎长和茎横切面积，还包括增加水稻的稻谷产量。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水稻病害包括水稻稻瘟病。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降低稻米重金属含量包括降低米镉含量。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述的复合微生物菌剂稀释200～400倍后进行浸种；或者在水稻生长的关键节点将所述复合微生物菌剂稀释200～400倍后喷施使用。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种复合微生物菌剂及其在水稻促生抗病降镉中的应用。本发明所述复合微生物菌剂由保藏编号为CCTCC NO:M 20221980的贝莱斯芽孢杆菌20-10和保藏编号为CCTCC NO:M 20221981的链霉菌Ahn65组成，它们分别分离自水稻根际土壤和水稻茎组织。本发明的复合微生物菌剂具有显著的促生、抗稻瘟病和降米镉功能，与单一菌株相比，该复合微生物菌剂表现出明显的协同增效作用，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：胡展 杨华 肖蓉 付祖姣 程伟 伍善东 刘朱东 张敏 郭照辉 单世平
受保护的技术使用者：湖南省微生物研究院
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/11