一种与细毛羊净毛率相关的SNP位点及其应用

一种与细毛羊净毛率相关的snp位点及其应用
技术领域
1.本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种与细毛羊净毛率相关的snp位点及其应用。


背景技术：

2.羊毛是指覆盖在羊体表面的一层具有纺织价值的纤维，是皮肤的衍生物。羊毛是毛纺工业的主要精纺原料，主要用来加工服装面料。在细毛羊育种实践中，羊毛性状是重要的经济性状，直接影响羊毛生产的品质和数量，主要包括产毛量、平均纤维直径、断裂强度、净毛率等多个指标。其中净毛率是指纯净毛纤维在公定回潮率条件下的重量占原毛样重的百分数，是羊毛最重要的一项经济指标。影响细毛羊净毛率的因素较多，如品种、环境、营养水平、年龄、性别等均可影响羊毛净毛率，其中品种和环境因素是最主要的。
3.细毛羊以其生产优质羊毛而闻名，羊毛作为一种天然纤维，是用于服装和纺织品的重要农产品。其中，羊毛质量由纤维直径、纤维长度、净毛率、卷曲和油汗颜色决定。细毛羊的羊毛性状一直是人工选育的重点。在众多羊毛性状中，净毛率在羊毛流通领域中是羊毛交易计算重量与价格的重要依据，且在养羊业生产上测定和统计羊群与个体的产毛量时，都以净毛量为基础。因此净毛率直接影响羊毛经济价值。
4.本发明发现了一种影响细毛羊净毛率性状的snp分子标记，位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at(p《0.05)。本发明通过对细毛羊净毛率性状相关的snp位点进行检测，可用于育种早期选留，能够增加细毛羊净毛率的遗传进展，具有操作简单的优点，提高品种甄选的精确度，减少细毛羊净毛率优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种影响细毛羊净毛率性状的snp分子标记，并通过检测所述snp分子标记碱基类型，实现细毛羊的净毛率基因分型，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at；通过优选该snp分子标记的优势等位基因，能够增加细毛羊净毛率的遗传进展，具有操作简单的优点，提高品种甄选的精确度，减少细毛羊净毛率优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种检测与细毛羊净毛率性状相关的snp分子标记的试剂在检测细毛羊净毛率中的应用，所述snp分子标记位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处；突变碱基为a或t。
7.优选地，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at。
8.优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。
9.优选地，所述引物对的序列为：
10.f：5
’‑
tagaatagtgggacgtgaata-3’；
11.r：5
’‑
acttattagcatggcaactt-3’。
12.优选地，实现检测细毛羊净毛率的方法包括：
13.(1)提取细毛羊血液基因组dna为模板dna；
14.(2)利用引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
15.(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；其中，所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at。
16.优选地，所述pcr扩增体系25μl：金牌mix 22μl，上、下游引物各1μl，模板dna1μl。
17.优选地，所述pcr扩增程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃10s，共40个循环；72℃延伸2min。
18.第二方面，本发明提供了一种检测与细毛羊净毛率性状相关的snp分子标记的试剂在细毛羊净毛率性状早期育种中的应用，所述snp分子标记位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处；突变碱基为a或t。
19.优选地，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at。
20.优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。
21.优选地，所述引物对的序列为：
22.f：5
’‑
tagaatagtgggacgtgaata-3’；
23.r：5
’‑
acttattagcatggcaactt-3’。
24.优选地，实现细毛羊净毛率性状早期育种的方法包括：
25.(1)提取细毛羊血液基因组dna为模板dna；
26.(2)利用引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
27.(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；其中，所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at；选取基因型为aa的细毛羊个体进行细毛羊净毛率性状的早期育种。
28.优选地，所述pcr扩增体系25μl：金牌mix 22μl，上、下游引物各1μl，模板dna1μl。
29.优选地，所述pcr扩增程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃10s，共40个循环；72℃延伸2min。
30.本发明的有益效果是：
①
本发明提供了一种影响细毛羊净毛率的snp分子标记，所述的snp分子标记位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处，突变碱基为a或t；所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；aa基因型的细毛羊个体的净毛率显著高于at基因型个体(p《0.05)；
②
通过对细毛羊净毛率相关的snp位点进行检测，能够判断细毛羊的净毛率，为细毛羊分子标记辅助育种提供依据，可以加强细毛羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育
进程；
③
通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，通过优选该snp分子标记的优势等位基因，能够增加细毛羊净毛率的遗传进展，具有操作简单的优点，提高品种甄选的精确度，减少细毛羊净毛率优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争，在对细毛羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。
附图说明
31.图1pcr扩增结果；
32.图2pcr产物经纯化并测序后所得到的基因型分型结果。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
34.下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所有试验的实验条件如无特殊说明，均为常规条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw，molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
36.本发明所述的snp是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。
37.实施例1细毛羊不同基因型与净毛率之间的相关性
38.1.样品采集
39.采集具有生产记录的383只细毛羊血样，每只羊静脉采血5ml，置于加入edta-k2抗凝剂的采血管中，充分混匀之后放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后置于-20℃冰箱冷冻保存，用以dna的提取。本试验样品来自甘肃省绵羊繁育技术推广站。
40.2.主要试剂及仪器
41.edta-k2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；nanodrop2000分光光度计美国thermo fisher scientific公司；dl2000 marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；金牌mix(green)购自北京擎科生物技术有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；pcr仪购自biorad公司。
42.3.方法
43.3.1血液基因组dna的提取
44.使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒进行采集血样dna的提取，将提取出的dna置于紫外分光光度计下检测其浓度与纯度，浓度》20ng/μl、od
260
/od
280
在1.7～1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。
45.3.2引物设计
46.参考国际绵羊基因组ars-ui_ramb_v2.0(gcf_016772045.1)版本第1号染色体基因序列(genbank登录号：nc_019458.2，snp标记位于第236304249位)，利用primer premier 5.0软件设计一对特异性引物，包含所述的snp位点。
47.引物序列：
48.f：5
’‑
tagaatagtgggacgtgaata-3’(seq id no.1)；
49.r：5
’‑
acttattagcatggcaactt-3’(seq id no.2)。
50.扩增片段长度130bp，引物由北京擎科生物技术有限公司合成。
51.3.3pcr扩增与测序
52.pcr扩增体系25μl：金牌mix(green)22μl，上、下游引物各1μl，模板1μl。
53.pcr扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。
54.pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，扩增的核苷酸序列如seq id no.3或4所示，snp标记位于seq id no.3或4所示核苷酸序列的31位。
55.测序由北京擎科生物技术有限公司完成。利用生物分析软件对pcr产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。
56.3.4统计分析
57.根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用popgen32软件计算所述snp位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(ne)、位点杂合度(he)、hardy-weinberg平衡检验，利用pic计算软件计算多态信息含量。采用ibm spss statistics 22软件中一般线性模型分析细毛羊不同基因型与净毛率的关联性，结果以“平均值
±
标准误”表示。
58.4.结果
59.4.1pcr扩增及测序结果
60.用1.5％琼脂糖凝胶检测细毛羊第1号染色体所述snp位点扩增产物(见图1)，条带清晰无杂带，特异性良好，pcr产物片段大小为130bp符合预期大小，可以进行下一步实验。
61.pcr产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2可知，所述snp位点发生a/t突变，存在aa、at两种基因型。
62.4.2统计分析结果
63.从群体遗传学角度对细毛羊第1号染色体所述snp位点的基因型和等位基因频率进行分析。由表1可见，在所述snp位点上，aa基因型频率最高，为优势基因型，a等位基因频率为95.0％，表现为优势等位基因。由χ2适应性检验表明，snp位点处于hardy-weinberg平衡状态(p》0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.10，多态信息含量(polymorphism information content，简称pic)为0.09，属于低度多态。
64.表1细毛羊第1号染色体236304249snp位点多态性
[0065][0066]
4.3细毛羊不同基因型与净毛率的关联分析
[0067]
采用ibm spss statistics 22软件中一般线性模型分析细毛羊不同基因型与净毛率的关联性，aa基因型的细毛羊净毛率显著大于at基因型个体(p《0.05)。通过检测细毛
羊第1号染色体所述snp位点的碱基，能够判断细毛羊净毛率，结果见表2。
[0068]
表2细毛羊不同基因型与净毛率之间的相关分析
[0069][0070]
注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
[0071]
综上所述，本发明所述的snp分子标记位于国际绵羊参考基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249个碱基处；变异类型为a/t，存在两个基因型，当所述的第1号染色体上第236304249个碱基为a时，基因型为aa；当所述的第1号染色体上第236304249个碱基为t时，基因型为at；通过不同基因型与净毛率的关联分析，发现所述at基因型的细毛羊净毛率显著小于aa基因型个体，p《0.05。
[0072]
上述结果表明，通过检测细毛羊第1号染色体上第236304249个核苷酸位点的碱基，能够判断细毛羊净毛率，为细毛羊净毛率的分子标记辅助育种提供依据，可以加强细毛羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该snp分子标记的优势等位基因，能够增加细毛羊净毛率的遗传进展，采用与净毛率相关的分子标记进行性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选净毛率高的细毛羊，提高品种甄选的精确度，减少细毛羊净毛率优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。
[0073]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.检测与细毛羊净毛率性状相关的snp分子标记的试剂在检测细毛羊净毛率中的应用，其特征在于，所述snp分子标记位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处；突变碱基为a或t。2.检测与细毛羊净毛率性状相关的snp分子标记的试剂在细毛羊净毛率性状早期育种中的应用，其特征在于，所述snp分子标记位于国际绵羊基因组oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249位点的碱基处；突变碱基为a或t。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物对的序列为：f：5
’‑
tagaatagtgggacgtgaata-3’；r：5
’‑
acttattagcatggcaactt-3’。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，实现检测细毛羊净毛率的方法包括：(1)提取细毛羊血液基因组dna为模板dna；(2)利用引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；其中，所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，实现细毛羊净毛率性状早期育种的方法包括：(1)提取细毛羊血液基因组dna为模板dna；(2)利用引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为a时，基因型为aa；当所述snp分子标记碱基为t时，基因型为at；其中，所述基因型aa的细毛羊净毛率显著大于基因型at；选取基因型为aa的细毛羊个体进行细毛羊净毛率性状的早期育种。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述pcr扩增体系25μl：金牌mix 22μl，上、下游引物各1μl，模板dna 1μl。9.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述pcr扩增程序：98℃ 2min；98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 10s，共40个循环；72℃延伸2min。

技术总结
本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种与细毛羊净毛率相关的SNP位点及其应用。本发明所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第1号染色体上第236304249个核苷酸位点A/T突变。本发明还提供了检测上述SNP位点的试剂在检测细毛羊净毛率性状或在细毛羊分子标记辅助育种中的应用，在细毛羊品种筛选、品种鉴定或分子标记辅助育种中都有巨大的应用价值；用于早期育种选择，缩短世代间隔，加速育种进程，节约了大量的育种成本，市场前景广阔。前景广阔。前景广阔。


技术研发人员：郭婷婷 袁超 卢曾奎 岳耀敬 刘建斌 杨博辉
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
技术研发日：2023.08.18
技术公布日：2023/10/11