一种含有唾液酸乳糖或其盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎的组合物的制作方法

一种含有唾液酸乳糖或其盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎的组合物
1.本技术是2017年9月22日提交的同名发明专利申请201780084370.x的分案申请。
【技术领域】
2.本发明涉及一种含有3'-或6'-唾液酸乳糖(sialyllactose)或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎(osteoarthritis)的组合物。


背景技术：

3.退行性关节炎(osteoarthritis，oa)是主要由抑制软骨形成(cartilage ecm synthesis)和促进软骨破坏引起的退行性关节疾病。与老化相关的许多病理学的危险因素和病理生理学的过程影响退行性关节炎的进展。包括关节不稳定性和损伤的机械应力以及易患上退行性关节炎的与老化相关的因素是潜在的退行性关节炎引起机制。由于作为产生多种异化因子和同化因子的独特细胞类型的软骨细胞中生化途径的激活，这些因素导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)对细胞外基质(extracellular matrix，ecm)的降解、和通过软骨细胞的脱分化(dedifferentiation)及细胞凋亡(apoptosis)的ecm合成中断(pelletier jp et al.,arthritis rheum.,44:1237-47,2001)。尤其，形成关节的软骨组织一旦被损坏就不会在体内正常地再生。当这些关节的软骨组织受损时，产生剧烈的疼痛并局限日常活动，当软骨组织受慢性损伤时，导致致命的退行性关节炎，从而干扰正常生活或职业活动。
4.到目前为止，尚未开发出关节炎治疗剂，通常使用非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，nsaid)以缓解关节炎症。然而，因为基于nsaid药物的主要目的是暂时缓解关节炎症的效应，所以使用基于nsaid药物是对退行性关节炎不适合的治疗，退行性关节炎是一种非炎症性关节炎，需要软骨形成和抑制软骨组织破坏(pritchard mh et al.,annals of the rheumatic diseases,37:493-503,1978)。这些非甾体类抗炎药物(nsaids)作为炎症性关节炎的类风湿性关节炎的治疗剂适用于阻断炎症机制，但反而指出的问题是加速软骨损伤或对心血管、胃肠道、肾脏和肝脏等的副作用。
5.此外，目前为软骨形成而开发的自体软骨细胞移植技术是一种收集已经形成在患者正常部位的软骨和软骨下骨部分且通过在受损软骨上挖出适当的孔来移植以产生透明软骨的方法，所述方法尽管在一些患者中得到成功，但不能成为一种普遍的方法，因为只能用于软骨组织破坏很少且能够进行自体移植的患者(peterson l et al.,j bone joint surg am.85-a suppl:17-24,2003)。
6.另一方面，据报道在母乳寡糖中的3'-或6'-唾液酸乳糖(3'-or6-sialyllactose)具有影响肠内细菌活性的抗炎特性，并有助于肠内有用的细菌生长良好(izquierdo-useros n et al.,plos biol,2012,10)。由于唾液酸乳糖存在母乳中，因此已经验证了对给药的副作用，并正在进行各种功能的研究，虽然通过施用于类风湿性关节炎患者来证实了根据igg变化的自身免疫性疾病治疗的效果，但是3'或3'-6'-唾液酸乳糖对退行性关节
炎的预防和治疗作用尚不清楚。
7.因此，本发明人努力寻找能够有效预防和治疗退行性关节炎的新物质，结果证实3'-或6'-唾液酸乳糖在促进软骨形成的同时抑制软骨组织的破坏，从而完成了本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种含有3'-或6'-唾液酸乳糖(sialyllactose)或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防、改善或治疗退行性关节炎(osteoarthritis)的药物组合物。
9.本发明的另一个目的是提供一种退行性关节炎的治疗方法，所述方法包括施用含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物的步骤。
10.本发明的另一个目的是提供含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物在用于治疗退行性关节炎的用途。
11.为了实现上述目的，本发明提供一种含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎的组合物。
12.本发明进一步提供一种含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其食物学上可接受的盐作为有效成分的食物。
13.本发明进一步提供一种退行性关节炎的治疗方法，所述方法包括施用含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物的步骤。
14.本发明进一步提供含有3'-或6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物在用于治疗退行性关节炎的用途。
【附图说明】
15.图1为显示通过多种异化因子和同化因子诱导退行性关节炎的机制的模式图。
16.图2为(a)3'-唾液酸乳糖(3'-sialyllactose，3'-sl)和(b)6'-唾液酸乳糖(6'-sialyllactose，6'-sl)的化学结构式。
17.图3为通过在软骨细胞中以不同浓度处理(a)3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖来确认3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖对软骨细胞没有出现细胞毒性的结果。
18.图4为通过在软骨细胞中以0μm、50μm、100μm、250μm处理3'-唾液酸乳糖来确认ii型胶原蛋白(col2a1)表达增加的结果(a和b)；确认由il-1β减少的col2a1表达被3'-唾液酸乳糖中各浓度分别增加的结果(c和d)；确认由il-1β降低的sox-9活性被3'-唾液酸乳糖增加的结果(e)。
19.图5为通过在软骨细胞中以0μm、50μm、100μm、250μm处理6'-唾液酸乳糖来确认ii型胶原蛋白(col2a1)表达增加的结果(a)；确认由il-1β降低的col2a1表达被6'-唾液酸乳糖中各浓度分别增加的结果(b)；确认调节ii型胶原蛋白表达的转录因子sox-9活性因子被il-1β降低并再次被6'-唾液酸乳糖增加的结果(c)。
20.图6为确认在软骨细胞中由il-1β诱导关节破坏的mmp3和mmp13的表达增加的结果(a和b)；确认由il-1β增加的mmp3和mmp13的表达被3'-唾液酸乳糖减少的结果(c和d)。
21.图7为确认在软骨细胞中由il-1β诱导关节破坏的mmp3和mmp13的表达增加的结果(a)；确认由il-1β增加的mmp3和mmp13的表达被6'-唾液酸乳糖减少的结果(b)。
22.图8为确认在软骨细胞中由il-1β增加的erk磷酸化被3'-唾液酸乳糖失活的结果。
23.【具体实施方式以及优选实施例】
24.除非另外定义，否则本说明书使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本说明书使用的命名法是本领域公知的并且通常使用的。
25.关节炎主要可分为非炎性关节炎和炎性关节炎，非炎性关节炎例如可以是骨关节炎(退行性关节炎，osteoarthritis，oa)，炎性关节炎的典型例子是类风湿性关节炎(yusuf e et al.,ann rheum dis,70:60-67,2011；berebaum f et al.,osteoarthritis cartilage,21:16-21,2013)。
26.骨关节炎也称为退行性关节炎，其发病原因尚不清楚，但已知如遗传、外伤、肥胖、衰老、异化因子等的多种诱因相关其中。据报道，这些因素打破在软骨细胞中攻击因素和防御因子之间的平衡，随着促进软骨组织的破坏且软骨磨损加剧，骨关节炎的特征性病理变化导致患者感到疼痛并限制关节运动(pelletier jp等，arthritis rheum。，4：1237-47,2001)。
27.另一方面，对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)而言，与由软骨细胞和软骨组织破坏引起的退行性关节炎不同，已知通过自身免疫反应的疾病进展是一个重要的致病因素。类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病(autoimmune diseases)，其特征在于滑膜细胞的炎症和增殖，与骨关节炎不同，其引起关节周围骨质的骨质疏松症及骨侵蚀等。类风湿性关节炎是通过由滑膜(synovial membrane)的炎症扩散到关节囊(joint capsule)、韧带(ligament)，及肌腱(tendon)并侵入骨骼来进行的。因此，骨关节炎和类风湿性关节炎的发病原因和进展阶段完全不同，其治疗方法也不同。
28.先前已知的类风湿性关节炎治疗剂包括适合于阻断炎症机制的非甾体抗炎药(nsaids)、青霉胺、类固醇激素、tnf抑制剂、白细胞介素抑制剂、jak抑制剂、抗cd相关抑制剂(pritchard mh et al.,ann rheum dis,37:493-503,1978；2014frost&sullivan report:product and pipeline analysis of the global rheumatoid arthritis therapeutics market)。虽然nsaid药物和类固醇激素用于退行性关节炎患者以缓解关节疼痛和炎症，但只缓解症状而不治疗疾病本身，因此不能用作退行性关节炎的实际治疗剂(abramson sb et al.,osteoarthritis cartilage,7:380-1,1999)。不仅如此，主要由软骨细胞和软骨组织破坏引起的退行性关节炎的发病原因和症状与作为炎性关节炎的类风湿性关节炎不同，因此退行性关节炎的治疗方法也与类风湿性关节炎的治疗方法不同。
29.例如，直到2014年开发的用于治疗退行性关节炎的大多数治疗剂正朝着通过结合促进分泌col2a1和ecm的间充质干细胞与各种结构体并将其插入于软骨损伤部分来促进软骨再生的方向进行开发。另一方面，对类风湿性关节炎治疗剂而言，可以通过开发tnf抑制剂、白细胞介素抑制剂、jak抑制剂、抗cd相关抑制剂等来确认朝着从源头抑制炎性细胞因子的方向进行开发(2014frost&sullivan report:1.aproduct and pipeline analysis of the global knee cartilage repari market,2.product and pipeline analysis of the global rheumatoid arthritis therapeutics market)。即，在各种类型的关节炎的形式中，具有非炎症倾向的退行性关节炎与具有炎症倾向的类风湿性关节炎的治疗靶标具有相互不同的形式。
30.基于这些结果进行比较时，退行性关节炎和类风湿性关节炎具有完全不同的疾病原因，并且从目前正在开发的治疗剂还可以确认：退行性关节炎治疗剂以软骨再生为主开发；类风湿性关节炎治疗剂基于炎症抑制开发。因此，应该不同地应用用于治疗退行性关节炎的靶向因子和用于治疗炎性类风湿性关节炎的靶向因子。
31.本发明的术语“退行性关节炎(osteoarthritis，oa)”和“骨关节炎”互换使用，并应以相同的含义理解。
32.在本发明中，确认了3'-或6'-唾液酸乳糖不对软骨细胞表现出毒性，并促进在关节形成中起重要作用的ii型胶原蛋白(col2a1)的表达，同时抑制促进破坏软骨组织的mmp3、mmp13的表达。此外，确认了3'-或6'-唾液酸乳糖直接参与调节参与col2a1表达的转录因子sox-9的活性，并且还确认了3'-或6'-唾液酸乳糖直接参与调节参与mmp3、mmp13表达的perk信号传导系统。
33.因此，本发明在一方面涉及一种含有唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎的药物组合物。
34.在本发明中，所述唾液酸乳糖的特征在于可以为3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖。
35.本发明所用的术语"药学上可接受的盐"是指对施用所述化合物的有机体不会引起严重的刺激且不会损害所述化合物的生物活性和物理性能的化合物的制剂。所述药学上的盐包括：形成包含药学上可接受的阴离子的无毒酸加成盐的酸，例如，无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸、水杨酸等；磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等形成的酸加成盐。例如，药学上可接受的羧酸盐可以包括由锂、钠、钾、钙或镁等形成的金属盐或碱土金属盐；氨基酸盐，例如赖氨酸、精氨酸或胍等；和有机盐，例如二环己基胺、n-甲基-d-葡糖胺、三(轻甲基)甲胺、二乙醇胺、胆碱和三乙胺等。
36.在本发明中，所述3'-或6'-唾液酸乳糖的药学上可接受的盐可以是钠，但不限于此。
37.优选地，所述3'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式1的结构，所述6'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式2的结构，但不限于此。
38.[化学式1]
[0039][0040]
[化学式2]
[0041][0042]
在本发明中，使用的单一试验化合物是3'-或6'-唾液酸乳糖，其化学式为c23h38
no
19
na，并且是在母乳中含量丰富的天然衍生的单一化合物(single compound)(图2)。
[0043]
在本发明中，所述3'-或6'-唾液酸乳糖的特征可在于含有其衍生物。
[0044]
本发明的术语"衍生物"是指通过引入、取代、氧化，及还原等所述3'-或6'-唾液酸乳糖的官能团而使在母体的结构和性质不会大幅度改变的程度上改变的化合物。对这些官能团的种类没有限制，例如，所述官能团可以包括各自独立地被羟基、苯氧基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、环己基、烷基醇基、烷基二醇基，或取代或未取代的苯基取代或未取代的c1至c20的非环烃基；被羟基、羟甲基、甲基、或氨基取代或未取代的c3至c30的环烃基；或糖残基，但不限于此。
[0045]
在本说明书中，术语“糖残基”是指从多糖分子中除去一个氢原子的基团，因此可以指例如衍生自单糖或寡糖的残基。
[0046]
除非另有定义，否则本说明书所用的“取代的”是指官能团中的至少一个氢原子被卤原子(f、cl、br或i)、羟基、硝基、氰基、亚氨基(＝nh、＝nr、r为c1至c10的烷基)、氨基(-nh2,-nh(r'),-n(r")(r"'),r',r",r"'(各自独立地为c1至c10的烷基)、脒基，肼基，腙基，羧酸基、c1至c20烷基、c6至c30芳基、c3至c30环烷基、c3至c30杂芳基、或c2至c30杂环烷基取代的。
[0047]
在本发明中，所述3'-或6'-唾液酸乳糖，或3'-或6'-唾液酸乳糖衍生物表现出稳定性的ph范围优选为ph4至ph10，但不限于此。
[0048]
在本发明中，含有3'-或6'-唾液酸乳糖作为活性成分的用于预防或治疗退行性关节炎的药物组合物的特征可在于具有下列特征中的至少一种：
[0049]
(1)增加ii型胶原蛋白(col2a1)的表达；
[0050]
(2)减少基质金属蛋白酶3(mmp3)或基质金属蛋白酶13(mmp13)的表达；
[0051]
(3)增加sox-9活性；以及
[0052]
(4)增加p-erk的失活性。
[0053]
在本发明中，其特征可在于进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。“制药上(药学上)可接受的载体”是可以添加至活性成分以帮助制定制剂或稳定制剂而不对患者引起显著有害的毒性效果的物质。
[0054]
所述载体是指不刺激患者且不抑制根据本发明的3'-或6'-唾液酸乳糖的生物活性和特征的载体或稀释剂。将组合物制定制剂为液相溶液形式的药学上可接受的载体通过混合被灭菌并适合活体的生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及其一种以上成分来使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，可以另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，并制剂成可注射制剂如水溶液、悬浮液，及乳液等、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。其他载体描述于例如remington'spharmaceutical sciences(e.w.martin)文献中。
[0055]
制药上可接受的载体包括用于制备立即给药用途(extemporaneous)的无菌可注射溶液或分散液剂的无菌水溶液或分散液及灭菌粉末。对制药活性物质使用此类介质和作用剂是本领域中已知的。优选地，组合物制剂成用于非口服注射。组合物可以制剂为溶液、微乳、脂质体，或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合
的混合物。在一些情况下，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：根据需要将所需量的3'-或6'-唾液酸乳糖在合适的溶剂中与上述成分中的一种或其组合物混合，然后对所得混合物进行无菌微过滤。通常，通过将活性化合物添加到含有基本分散介质和上述那些物质中的其他所需成分的无菌媒介物中来制备分散液剂。对用于制备无菌可注射溶液剂的灭菌粉末而言，一些制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻结干燥)，其从预先灭菌过滤的溶液中制备活性成分和任何其他所需成分的粉末。
[0056]
此外，根据本发明的药物组合物可以根据患者的严重程度而变化的剂量和频率口服或非口服施用。可以根据需要将组合物作为推注(bolus)或者通过连续注入来施用于患者。
[0057]
含有本发明的唾液酸乳糖的组合物可以通过抑制由关节老化引起的软骨组织破坏和促进软骨形成来治疗退行性关节炎。
[0058]
目前为止，已知的退行性关节炎治疗方法包括人工关节置换术、软骨成形术、软骨移植术，及自体软骨细胞移植术等，但人工关节置换术需要切开关节，因此给患者带来痛苦和负担，并且手术复杂且困难。不仅如此，因为仅适用于可自体移植的患者，所以治疗中存在许多限制(peterson l et al.,j bone joint surg am,85:17-24,2003)。自体软骨细胞移植术是一种从患者的正常部位收集软骨组织来获得软骨细胞，且在体外培养和繁殖软骨细胞至所需数量并填充受损的软骨部分的方法。然而，手术过程复杂和困难的，因为供体组织有限并且需要手术来收获用于移植的组织(yoon etal.,jorunal of rheumatic diseases,19,2012)。此外，还有一种从自体骨髓、肌肉、脂肪等的组织获得间充质干细胞并通过体外分化来注射到关节软骨损伤部位的方法。然而，当将间充质干细胞基于tgf-b分化为软骨细胞时，存在间充质干细胞分化成肥大软骨细胞的风险，当以bmp将间充质干细胞分化为软骨细胞时，存在分化为骨赘的风险(1.park et al.,j of korean orthopaedic research society,18:2,2015；mamidi mk et al.,osteoarthritis cartilage,24:1307-16,2016)。此外，目前为止开发的大多数退行性关节炎医药品和健康食品类倾向于只着重疼痛缓解和抗炎作用而不着重实际上对退行性关节炎治疗很重要的软骨细胞活性和软骨再生作用。
[0059]
因此，可以解决现有的退行性关节炎治疗医药品和健康食品类具有的副作用、软骨再生效果的降低和安全性的确保等问题，并且可以预期对人体无副作用的母乳成分之一的3'或6'-唾液酸乳糖可有效地用作预防、治疗或改善退行性关节炎的原料。
[0060]
因此，本发明在另一方面涉及一种退行性关节炎的治疗方法，所述方法包括施用含有唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物的步骤。
[0061]
本发明在另一方面还提供含有唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为活性成分的组合物在用于治疗退行性关节炎的用途。
[0062]
在本发明中，所述唾液酸乳糖优先为3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖，所述3'-唾液酸乳糖的盐更优先地具有以下化学式1的结构，所述6'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式2的结构，但不限于此。
[0063]
[化学式1]
[0064][0065]
[化学式2]
[0066][0067]
本发明在另一方面还涉及唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐用于制造抑制软骨组织破坏和促进软骨形成的组合物的用途。
[0068]
在本发明中，所述唾液酸乳糖的特征可在于可以是3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖。
[0069]
在本发明中，所述3'-唾液酸乳糖的食物学上可接受的盐优选地具有所述化学式1的结构，并且所述6'-唾液酸乳糖的食物学上可接受的盐优选地具有所述化学式2的结构，但不限于此。
[0070]
在本发明中，所述3'-或6'-唾液酸乳糖的食物学上可接受的盐可以是钠，但不限于此。
[0071]
在本发明中，所述3'-或6'-唾液酸乳糖的特征可在于含有其衍生物。
[0072]
本发明的食物可以任何形式制备，例如功能性食品(functional food)、营养补充剂(nutritional supplement)、保健食品(health food)和食品添加剂(food additives)等。例如，作为保健食品，本发明的3'-唾液酸乳糖可以制成茶、果汁和饮料的形式来饮用，也可以制成颗粒、胶囊和粉末的形式来摄取。另外，作为功能性食品，可以将本发明的3'-唾液酸乳糖添加到饮料(包括酒精饮料)、果实及其加工食品(如水果罐头、瓶装食品、果酱，柑橘酱等)、鱼类、肉类及其加工食品(如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包及面条类(如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干，糖，乳制品(如黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、干馏食品、冷冻食品、各种调味料(如大酱、酱油、酱汁等)中。
[0073]
所述保健功能食品也包括如功能食品、营养补充剂、保健食品、食品添加剂等的各种形式作为食品组合物，并且可以通过根据本领域已知的常规方法，例如将所述的3'-或6'-唾液酸乳糖制成茶、果汁、饮料的形式，或制成颗粒、胶囊、粉末的形式，或将其化合物或提取物添加到饮料、果实及加工食品、鱼类、肉类及加工食品、面包类、苗条类、调味料等添加到各种食物中来提供。
【实施例】
[0074]
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。本领域技术人员应该理解，这些实施例仅用于更详细地描述本发明，根据本发明的主旨本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0075]
【实施例1：测量唾液酸乳糖对软骨细胞的毒性】
[0076]
从出生后5日龄的正常小鼠的股骨头(femoral heads)、股骨髁(femoral condyles)及胫骨平台(tibial plateaus)组织获得软骨细胞(chondrocyte)。将得到的软骨细胞在含有10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum,gibco，美国)、50μg/ml链霉素(sigma-aldrich，美国)和50unit/ml青霉素(sigma-aldrich，美国)的dmem培养基(gibco,美国)中培养。
[0077]
为了确认3'-或6'-唾液酸乳糖对软骨细胞没有毒性，将软骨细胞在96孔培养容器中以9
×
103细胞/孔培养，然后分别在0μm、10μm、50μm、100μm，及250μm的浓度下处理3'-或6'-唾液酸乳糖(genechem inc.，韩国大田)并于5％co2培养箱在37℃下培养24小时。通过使用ez-cytox细胞活力测定试剂盒(dogen，韩国)测量450nm处的吸光度来确认3'-或6'-唾液酸乳糖对软骨细胞的毒性。
[0078]
结果确认，3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖在所有浓度下均对软骨细胞都没有细胞毒性，并且不会对软骨细胞增殖产生不利影响(图3)。
[0079]
【实施例2：确认唾液酸乳糖对软骨形成及再生效果】
[0080]
【2-1：增加ii型胶原蛋白(col2a1)的表达】
[0081]
为了确认通过3'-或6'-唾液酸乳糖的软骨形成及再生效果，将实施例1中获得的软骨细胞培养36小时，然后分别在0μm、10μm、50μm、100μm，及250μm的浓度下处理3'-或6'-唾液酸乳糖并进一步培养36小时。
[0082]
然后，使用tri试剂(molecular research center inc.)从软骨细胞中提取rna以进行qrt-pcr，并且使用序列号1和序列号2的引物在55℃的退火温度下通过pcr扩增所述逆转录rna而获得cdna，以确认对软骨形成重要的ii型胶原蛋白(col2a1，173bp)的表达。作为对照组，用序列号3和序列号4的引物确认了gapdh(450bp，退火温度为58℃)。
[0083]
序列号1:5'-cacactggtaagtggggcaaga-3'(col2a1-s)
[0084]
序列号2:5'-ggattgtgttgtttcagggttcg-3'(col2a1-as)
[0085]
序列号3:5'-tcactgccacccagaagac-3'(gapdh-s)
[0086]
序列号4:5'-tgtaggccatgaggtccac-3'(gapdh-as)
[0087]
另外，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒(roche)的溶解缓冲液(150mm氯化钠，1％np-40，50mm tris，5mm氟化钠)从软骨细胞中提取总细胞裂解液以确认了col2a1的表达。使用计算机程序测量在使用抗chol2a1抗体(millipore)和抗erk抗体(cell signaling)的免疫印迹和免疫印迹带中条带的厚度和浓度，并通过密度计表示其相对值(图4a和图4b)。
[0088]
结果确认，3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖增加软骨细胞中col2a1的表达，并且发现其有效促进软骨形成(图4a、图4b和图5a)。
[0089]
【2-2：增加由il-1β抑制的ii型胶原蛋白(col2a1)的表达】
[0090]
il-1β是一种抑制软骨细胞中col2a1表达的典型的炎性细胞因子。在培养软骨细胞36小时后，将il-1β(genescript，美国)5ng/ml处理24小时，以确认了il-1β降低col2a1的表达。
[0091]
为了确认3'-或6'-唾液酸乳糖在软骨细胞中再次增加如此降低的col2a1的表达，以与所述实施例2-1相同的方式进行了qrt-pcr和免疫印迹法。
[0092]
结果确认，3'-或6'-唾液酸乳糖逐渐增加在软骨细胞中由il-1β抑制的col2a1的
表达(图4c、图4d和图5b)。即，可以知道3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖促进软骨形成及再生。
[0093]
【实施例3：通过唾液酸乳糖激活软骨形成及再生的信号传导】
[0094]
对软骨形成及再生很重要的col2a1的表达被转录因子sox-9调节，因此检查了转录因子sox-9是否可被3'-唾液酸乳糖调节。
[0095]
在sox-9报告基因中，将由48个基因组成的sox9结合位点插入pgl3载体中对应于sv40启动子上游区域中人col2a1基因的第一个内含子的位点(zhou g et al.,j biol chem 1998,12,14989-97)。
[0096]
使用阳离子脂质体2000(invitrogen)将这些sox-9报告基因1μg转染于软骨细胞各3小时。将转染的细胞与5ng/ml白细胞介素1β(il-1β)和0μm、10μm、50μm、100μm，及250μm的3'或6'-唾液酸乳糖同时处理24小时，然后获得软骨细胞并通过荧光素酶活性来确认了sox-9活性。
[0097]
结果确认，由il-1β降低的sox-9活性被3'-或6'-唾液酸乳糖恢复(图4e和图5c)。这可以表明3'-或6'-唾液酸乳糖直接调节sox-9的活性，因此调节对软骨形成很重要的col2a1的表达。即，3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖促进软骨形成及再生。
[0098]
【实施例4：确认唾液酸乳糖对关节炎症及软骨破坏的抑制】
[0099]
il-1β是一种典型的炎性细胞因子，其减少对在软骨细胞中软骨形成很重要的col2a1，并同时促进关节炎症和软骨组织破坏。用5ng/ml的il-1β随时间处理软骨细胞，然后通过实施例2-1的方法使用下表1中所示的条件和引物进行qrt-pcr，以确认了mmp3和mmp13表达的抑制。
[0100]
【表1】
[0101][0102][0103]
使如mmp3和mmp13的分泌蛋白质与100μl三氯乙酸(trichloroacetic acid，tca)在900μl无血清条件培养基(conditioned medium)中进行反应，然后在0℃进行反应20分钟。然后，通过离心分离器在12,000rpm，4℃下进行离心10分钟以除去上清液，并在20℃下与100％冷丙酮500μl进行反应1小时。将正在与100％丙酮反应中的样品通过离心分离器来除去上清液，最后沉淀并检测蛋白质，然后使用计算机程序测量在使用抗mmp3抗体(abcam)和抗mmp13抗体(abcam)的免疫印迹和免疫印迹带中条带的厚度和浓度，并通过密度计表示其相对值。
[0104]
结果确认，il-1β增加在软骨细胞中诱导关节炎症和软骨组织破坏的mmp3和mmp13的表达(图6a、图6b和图7a)。
[0105]
因此，用il-1β5ng/ml和3'-或6'-唾液酸乳糖0μm、10μm、50μm、100μm，及250μm处理软骨细胞24小时，以确认mmp3和mmp13的表达水平。使用所述表1中所示的条件和引物进行qrt-pcr，并通过免疫印迹法确认在软骨细胞中由il-1β增加的mmp3和mmp13的表达被3'-或6'-唾液酸乳糖浓度依赖性地减少(图6c、图6d和图7b)。这表明3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸
乳糖可以缓解和抑制关节炎症和软骨组织的破坏。
[0106]
【实施例5：通过唾液酸乳糖抑制软骨破坏信号传导体系】
[0107]
作为由il-1β增加的软骨破坏因子的mmp3及mmp13通过软骨细胞中的各种信号传导途径被激活。因此，确认了3'-唾液酸乳糖可以阻断由il-1β调节的各种信号转导途径(signal transduction pathway)。
[0108]
通过用5ng/ml il-1β处理小鼠膝关节软骨细胞10分钟，通过细胞外信号调节激酶(extarcellular-signal regulated kinase，erk)磷酸化来确认了erk活化。
[0109]
因此，通过将软骨细胞用5ng/ml il-1β和3'-唾液酸乳糖0μm、50μm、100μm，及250μm一起处理来确认了erk磷酸化被3'-唾液酸乳糖减少(图8)。即，通过免疫印迹法和光密度测定法确认，由于3'-唾液酸乳糖抑制可以激活在il-1β中的mmp3和mmp13的信号转导途径中的erk信号传导途径，从而可以抑制mmp3和mmp13。
[0110]
一般来说，可以确认erk活化也在退行性关节炎患者的组织中得到促进(yang et al.,nat med,2010)，这表明3'-唾液酸乳糖可以强烈地抑制在退行性关节炎患者中涉及最多的软骨破坏信号转导系统。
[0111]
【统计分析】
[0112]
本发明所有实施例的结果是基于如mankin评分的序数评级系统的量化数据，使用非参数统计方法对此进行了分析。首先使用夏皮罗-威尔克(shapiro-wilk)检验法分析由相对的倍数变化(fold changes)指示的qrt-pcr数据以确认正态分布(normal distribution)，然后分别使用包括学生t检验(student's t-test)和事后检验(post hoc test)的方差分析(analysis of variance，anova)进行成对比较(pair-wise comparisons)和多重比较(multi-comparisons)。以0.05水平的概率接受统计学显着性(p《0.05)。
[0113]
【工业实用性】
[0114]
由于本发明的3'-或6'-唾液酸乳糖促进软骨形成并有效抑制软骨组织破坏，所以可用作预防或治疗骨关节炎的组合物。
[0115]
如上所述，虽然参考特定实施例详细描述了本发明，但是对于本领域普通技术人员将明了的是，这些具体描述仅是优选实施例并且不限于本发明的范围。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。
[0116]
本说明书还包括下列内容：
[0117]
1.一种含有唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎的药物组合物。
[0118]
2.根据实施方式1的药物组合物，其特征在于，所述唾液酸乳糖是3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖。
[0119]
3.根据实施方式2的药物组合物，其特征在于，所述3'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式1的结构：
[0120]
[化学式1]
[0121][0122]
4.根据实施方式2的药物组合物，其特征在于，所述6'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式2的结构：
[0123]
[化学式2]
[0124][0125]
5.根据实施方式1所述的药物组合物，其特征在于，具有以下一种或多种特征：
[0126]
1)增加ii型胶原蛋白(col2a1)的表达；
[0127]
2)减少基质金属蛋白酶3(mmp3)或基质金属蛋白酶13(mmp13)的表达；
[0128]
3)增加sox-9活性；以及
[0129]
4)增加p-erk的失活性。
[0130]
6.根据实施方式1所述的药物组合物，其特征在于，进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0131]
7.一种含有唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或改善退行性关节炎的食物。
[0132]
8.根据实施方式7的食物，其特征在于，所述唾液酸乳糖是3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖。
[0133]
9.根据实施方式8的食物，其特征在于，所述3'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式1的结构：
[0134]
[化学式1]
[0135][0136]
10.根据实施方式8的食物，其特征在于，所述6'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式2的结构：
[0137]
[化学式2]
[0138]

技术特征：
1.3'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐用于制造预防或治疗因软骨细胞中攻击因素和防御因子之间的平衡被打破而引发的退行性关节炎的药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于预防或治疗软骨损伤、抑制软骨组织破坏和促进软骨形成，且所述药物组合物具有下列一种以上的特征：(1)增加ii型胶原蛋白(col2a1)的表达；(2)减少基质金属蛋白酶3(mmp3)或基质金属蛋白酶13(mmp13)的表达；以及(3)增加sox-9活性。2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述3'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式1的结构：【化学式1】3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物具有下列特征：(4)增加p-erk的失活性。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。5.6'-唾液酸乳糖或其药学上可接受的盐用于制造预防或治疗因软骨细胞中攻击因素和防御因子之间的平衡被打破而引发的退行性关节炎的药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于预防或治疗软骨损伤、抑制软骨组织破坏和促进软骨形成，且所述药物组合物具有下列一种以上的特征：(1)增加ii型胶原蛋白(col2a1)的表达；(2)减少基质金属蛋白酶3(mmp3)或基质金属蛋白酶13(mmp13)的表达；以及(3)增加sox-9活性。6.根据权利要求5的用途，其特征在于，所述6'-唾液酸乳糖的盐具有以下化学式2的结构：【化学式2】7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

技术总结
本发明涉及一种含有3'-或6'-唾液酸乳糖(sialyllactose)或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗退行性关节炎(Osteoarthritis)的组合物。由于本发明的3'-或6'-唾液酸乳糖在促进软骨形成的同时有效抑制软骨组织破坏，因此可用于预防或治疗退行性关节炎的组合物。关节炎的组合物。关节炎的组合物。


技术研发人员：梁时荣 全祉珉 姜理中 曹讚美
受保护的技术使用者：库比奥尼有限公司
技术研发日：2017.09.22
技术公布日：2023/10/11