菊苓复方指纹图谱的构建方法及其指纹图谱与应用

1.本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种菊苓复方指纹图谱的构建方法及其指纹图谱与应用。


背景技术：

2.菊苓复方是全国著名老中医张冰教授治疗痹证、急慢性痛风关节炎治验的高度凝练与总结，集中反映其整合论治代谢疾病的用药思路。张冰教授认为痛风病发生的表象虽在关节，但其实质是以机体尿酸代谢紊乱为根本，加之外因而诱发的，故应治以健脾祛湿调整尿酸代谢，化浊除痹干预尿酸盐沉积。菊苓复方由菊苣、土茯苓、秦艽、茯苓、槐米组成，其中菊苣土茯苓健脾祛湿化浊、通利关节，调节尿酸代谢，共为君药；茯苓秦艽祛风湿除痹痛、干预痛风性炎症肿痛，为臣药；槐米清热凉血、消炎止痛，为佐使药。全方共奏健脾祛湿化浊、降酸消肿止痛之功。文献学及网络药理学研究表明，该方含多种可作用于尿酸生成、排泄及炎症途径的化学成分，具有多成分、多靶点、多功效的防治优势，是契合了痛风病现代病理认识的综合抗痛风病药物。
3.目前，对于菊苓复方的研究集中在临床应用及药理药效等方面，但缺乏深入分析内在药效成分的差异对菊苓复方质量影响的有效方法。
4.中药指纹图谱是鉴别中药产品、评价其产品质量的一种有效手段。例如，“菊苣和毛菊苣的hplc指纹图谱构建及模式识别研究”(《中国中药杂志》第38卷第9期，1401-1405页)研究了菊苣和毛菊苣的hplc指纹图谱的构建方法以及获得的hplc指纹图谱的应用。但是，中药复方的成分复杂，该文献中用于单味中药材的指纹图谱构建方法无法适用于中药复方。此外，该文献中采用有机溶剂甲醇超声提取菊苣和毛菊苣，与临床不符。
5.因此，建立菊苓复方的超高效液相色谱指纹特征图谱，并通过中药色谱特征图谱相似度评价系统对其进行分析，建立对照指纹图谱，为菊苓复方的质量控制提供依据，是目前亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的发明目的是提供一种菊苓复方指纹图谱的构建方法及其指纹图谱与应用，以实现对菊苓复方品质的全面、客观、准确的评价。
7.本发明提供了一种菊苓复方指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
8.(1)将菊苓复方制成供试品溶液；
9.(2)采用从绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷构成的组中选出的至少2种对照品制备混合对照品溶液；
10.(3)分别将所述供试品溶液和所述混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，对获得的色谱图进行相似度分析，得到所述菊苓复方指纹图谱。
11.可选地，在步骤(1)中，采用甲醇对所述菊苓复方的提取物粉末或浸膏粉进行提
取，得到的上清液进行过滤得到滤液，作为所述供试品溶液；
12.优选地，在步骤(1)中，采用70％甲醇对所述菊苓复方的提取物粉末或浸膏粉进行提取，得到的上清液采用0.22μm微孔滤膜进行过滤得到滤液，作为所述供试品溶液。
13.可选地，在步骤(2)中，采用绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷制备混合对照品溶液。
14.可选地，在步骤(2)中，将各对照品混合之后采用甲醇溶解，得到所述混合对照品溶液；或者，采用甲醇分别将各对照品配制成对照品溶液，然后混合得到所述混合对照品溶液；
15.优选地，在步骤(2)中，将各对照品等比例混合之后采用70％甲醇溶解，得到每种对照品的含量是lμg/ml的所述混合对照品溶液；或者，采用70％甲醇分别将各对照品配制成100μg/ml的对照品溶液，然后混合得到每种对照品的含量是lμg/ml的所述混合对照品溶液。
16.可选地，在步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的色谱柱采用accquity uplc hss t3色谱柱，以甲醇为流动相a，0.1％甲酸水溶液为流动相b，流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量为2μl，检测波长为300nm；
17.优选地，所述高效液相色谱仪的色谱柱采用规格是2.1
×
100mm、1.8μm的accquity uplc hss t3色谱柱。
18.可选地，在步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的洗脱条件是：
19.0～2分钟，流动相a的体积分数由5％上升至10％，流动相b的体积分数由95％下降至90％；
20.2～16分钟，流动相a的体积分数由10％上升至40％，流动相b的体积分数由90％下降至60％；
21.16～26分钟，流动相a的体积分数由40％上升至54％，流动相b的体积分数由60％下降至46％；
22.26～26.5分钟，流动相a的体积分数由54％上升至95％，流动相b的体积分数由46％下降至5％；
23.26.5～27.5分钟，流动相a的体积分数是95％，流动相b的体积分数是5％；
24.27.5～28分钟，流动相a的体积分数由95％下降至5％，流动相b的体积分数由5％上升至95％。
25.本发明还提供了一种采用上述的构建方法得到的菊苓复方指纹图谱，所述菊苓复方指纹图谱包括15个指纹峰。其中，2号峰的相对保留时间为9.64min，对应的化学物质为绿原酸；3号峰的相对保留时间为10.57min，对应的化学物质为6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷；5号峰的相对保留时间为11.51min，对应的化学物质为龙胆苦苷；8号峰的相对保留时间为16.73min，对应的化学物质为新落新妇苷；9号峰的相对保留时间为17.16min，对应的化学物质为落新妇苷；10号峰的相对保留时间为18.50min，对应的化学物质为芦丁；11号峰的相对保留时间为18.90min，对应的化学物质为异落新妇苷。
26.本发明还提供了上述菊苓复方指纹图谱在鉴别和/或评价菊苓复方的质量中的应用。
27.本发明还提供了一种鉴别和/或评价菊苓复方的品质的方法，包括：将待测菊苓复方的高效液相色谱图与上述菊苓复方指纹图谱进行比较，将相似度大于0.9识别为合格。
28.由上述技术方案可知，本发明的菊苓复方指纹图谱的构建方法及其指纹图谱与应用，至少具有如下有益效果：
29.本发明根据菊苓复方中所含的活性成分，包括黄酮类、有机酸类、环烯醚萜苷类等的结构性质特点，通过实验确定了流动相组成、梯度洗脱程序、检测波长、色谱柱、柱温等色谱分析条件。经多次实验验证表明，采用本发明的构建方法获得的菊苓复方指纹图谱可以全面、客观、准确的检测和评价菊苓复方的质量，为保证患者用药安全有效具有重要意义。
30.针对成分复杂的菊苓复方，本发明通过超高效液相色谱(uhplc)更全面的揭示了其指纹图谱，是对单味药材菊苣和毛菊苣指纹图谱研究的更进一步补充。此外，本发明通过水煎煮的方法提取菊苓复方，更贴近临床用药。
附图说明
31.图1显示了本发明实施例1中10个批次的菊苓复方的共有指纹峰的保留时间。
32.图2显示了本发明实施例1中利用10个批次的菊苓复方获得的对照指纹图谱。
具体实施方式
33.为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。除非另有说明，否则本发明中涉及的技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
34.在本发明中，所谓“菊苓复方”是指以菊苣、茯苓、土茯苓、槐米和秦艽为原料药制成的中药组合物。优选的，该中药组合物由如下原料药制成：菊苣6～18重量份、茯苓5～15重量份、土茯苓10～60重量份、槐米5～10重量份和秦艽3～10重量份；进一步优选的，该中药组合物由如下原料药制成：菊苣6～10重量份、茯苓10～15重量份、土茯苓20～40重量份、槐米5～10重量份和秦艽3～10重量份；最优选的，该中药组合物由如下原料药制成：菊苣9重量份、茯苓10重量份、土茯苓30重量份、槐米6重量份和秦艽9重量份。具体地，可参考申请号是202210821181.9的中国发明专利申请中记载的中药组合物，该专利申请通过引用的方式整体并入本发明中。
35.菊苓复方含多种可作用于尿酸生成、排泄及炎症途径的化学成分，具有多成分、多靶点、多功效的防治优势。但是，目前中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一、指标少，因此现有的评价方法难以全面反映药味多、多组分多靶标的菊苓复方组合物的质量状况。
36.针对这些问题，本发明的发明人将中药hplc指纹图谱技术应用到菊苓复方的品质评价中，针对菊苓复方自身的活性成分与结构性质特点，对hplc指纹图谱技术的流动相组成、梯度洗脱程序、检测波长、色谱柱、柱温等色谱分析条件进行优化与完善，并筛选相匹配的对照品，从而提出了一种菊苓复方指纹图谱的构建方法。
37.本研究采用超高效液相方法代替传统高效液相方法进行菊苓复方指纹图谱研究，能够使复方中的所有有效成分都很好的分离并同时检出、能够出峰较多、能够出峰稳定。
38.第一方面，本发明提供了一种菊苓复方指纹图谱的构建方法，包括：(1)将菊苓复
方制成供试品溶液；(2)制备混合对照品溶液；(3)将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，对获得的色谱图进行相似度分析，得到菊苓复方指纹图谱。下面结合一种具体实施方案，对本发明的菊苓复方指纹图谱的构建方法进行详细说明。
39.(1)将菊苓复方制成供试品溶液。
40.在本发明中，可以采用菊苓复方的提取物粉末或浸膏粉制备供试品溶液。
41.在一种优选的实施方案中，采用菊苓复方的提取物粉末制备供试品溶液。具体地，精密称定菊苓复方提取物粉末，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇提取，取提取液放冷至室温后再次称重，并用70％甲醇溶液补足缺失的重量，取上清液用滤膜过滤，取续滤液即得菊苓复方供试品溶液。其中，菊苓复方的提取物粉末的制备方法可以参考现有技术中的相关方案，本发明不作具体限定。
42.在另一种优选的实施方案中，采用菊苓复方的浸膏粉制备供试品溶液。具体地，精密称取浸膏粉，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇(v/v)定容至10ml，稀释至6mg/ml，振摇，超声30min滤过，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
43.其中，菊苓复方的浸膏粉的制备方法可以参考现有技术中的相关方案，仅作为一个示例，菊苓复方的浸膏粉可以采用如下方法制备：按照菊苓复方比例准确称取菊苣、秦艽、槐米、茯苓、土茯苓饮片，加12倍量水后浸泡30min，进行加热煎煮。待沸腾后煎煮1.5h，过滤。重复提取3次，合并水煎液，于旋转蒸发仪减压浓缩至含生药量1g/ml，即得复方水煎浓缩液。将复方浓缩液置80℃水浴锅蒸至无流动性后，放入真空干燥箱进行干燥，干燥温度保持80℃，持续干燥7天，取出，放至常温后粉碎，即得复方浸膏粉。
44.(2)制备混合对照品溶液。
45.根据菊苓复方的活性成分特点，本发明选择从绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷构成的组中选出至少2种物质作为对照品，并且优选地，本发明采用绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷作为对照品制备混合对照品溶液。
46.在本发明中，可以将各对照品混合之后采用甲醇溶解，得到混合对照品溶液；或者，也可以采用甲醇分别将各对照品配制成对照品溶液，然后混合得到混合对照品溶液。
47.在一种优选的实施方案中，分别精密称取绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、水仙苷对照品，置于容量瓶中，加70％甲醇溶解并定容摇匀，用微孔滤膜滤过，得混合对照品溶液。
48.在另一种优选的实施方案中，分别精密称定绿原酸、6
’‑
o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、水仙苷对照品适量，加70％甲醇溶解分别制成每1ml约含100μg的溶液(即100μg/ml的对照品溶液)。精密量取前述对照品溶液各1ml，置同一100ml容量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，每1ml混合对照品溶液含各对照品lμg，即在混合对照品溶液中，每种对照品的含量是1μg/ml。
49.(3)将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，对获得的色谱图进行
相似度分析，得到菊苓复方指纹图谱。
50.在本发明中，采用的色谱条件是：色谱柱采用accquity uplc hss t3色谱柱，其规格优选是内径2.1mm、柱长100mm、粒径1.8μm，以甲醇为流动相a，0.1％甲酸水溶液为流动相b，流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量为2μl，检测波长为300nm。
51.在本发明中，按下表进行梯度洗脱：
52.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0-25
→
1095
→
902-1610
→
4090
→
6016-2640
→
5460
→
4626-26.554
→
9546
→
526.5-27.595527.5-2895
→
55
→
95
53.将通过高效液相色谱获得的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，得到菊苓复方指纹图谱。
54.在此需要说明的是，本发明的构建方法中涉及的各种物质，例如中药材、对照品等，都可以通过市场购买获得。
55.第二方面，本发明提供了一种菊苓复方指纹图谱，包括15个指纹峰。
56.参考图2中的编号，本发明的菊苓复方指纹图谱的关键峰包括2、3、5、8、9、10、11号指纹峰等。其中，2号峰的相对保留时间为9.64min，对应的化学物质为绿原酸；3号峰的相对保留时间为10.57min，对应的化学物质为6
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o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷；5号峰的相对保留时间为11.51min，对应的化学物质为龙胆苦苷；8号峰的相对保留时间为16.73min，对应的化学物质为新落新妇苷；9号峰的相对保留时间为17.16min，对应的化学物质为落新妇苷；10号峰的相对保留时间为18.50min，对应的化学物质为芦丁；11号峰的相对保留时间为18.90min，对应的化学物质为异落新妇苷。
57.本发明的菊苓复方指纹图谱能够用于全面、客观、准确的检测和评价菊苓复方的质量，因此，在第三方面，本发明提供了一种鉴别和/或评价菊苓复方的品质的方法，包括：采用上述的色谱条件和梯度洗脱程序获得待测菊苓复方的高效液相色谱图，将该高效液相色谱图与本发明的菊苓复方指纹图谱进行比较，如果相似度大于0.9，则认为待测菊苓复方为合格品。
58.实施例
59.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
60.实施例1：菊苓复方对照指纹图谱的建立及应用
61.1.仪器与试剂、药材
62.waters acquity uplc h-class超高效液相色谱仪，accquity uplc hss t3色谱柱；kq-5200e型超声波清洗器(昆山超声仪有限公司，功率250w，频率40khz)，mtw120型电子天平(深圳美孚电子有限公司)；粉碎机(小熊电器股份有限公司)。
63.甲醇、甲酸(色谱纯，美国fisher公司)；蒸馏水(香港屈臣氏实业有限公司)；纯水
由实验室提供。
64.从全国各地收集菊苓复方中5味药材饮片，每味药材饮片10批，其产地与批次见表1和表2。
65.表1
66.批次编号茯苓批号编号土茯苓批号编号槐米批号s1f1北京h20502t1广东180101h1河北20191227s2f2北京221015003t2北京220418001h2北京190409004s3f3安徽20210324t3广东01050901h3河北20210513s4f4安徽h20901t4广东20210401h4河北93430801s5f5安徽220201t5广东21112017h5河北c23011202s6f6安徽22110201t6广东22083102h6河北c22080603s7f7北京22011901t7北京20220813h7河北539200601s8f8湖南194221001t8湖南220602h8河北c22081906s9f9云南221017002t9广东1907096h9河北2001049s10f10云南220417t10广东20220813h10河北c22092216
67.表2
68.批次编号秦艽批号编号菊苣批号s1q1北京180101j1新疆181201s2q2北京90850601j2新疆20200326s3q3甘肃00851201j3新疆20201031s4q4甘肃20210415j4新疆20200329s5q5甘肃200604004j5新疆20210801s6q6内蒙211206002j6新疆20210807s7q7北京20201004j7新疆20210403s8q8甘肃20112303j8新疆20210813s9q9云南220302j9辽宁20200327s10q10甘肃20220107j10安徽20200328
69.2.菊苓复方指纹图谱的构建
70.(1)供试品溶液制备
71.按照菊苣9克、茯苓10克、土茯苓30克、槐米6克和秦艽9克，准确称取表1和表2中s1至s10批次的各饮片，获得10个批次的供试品。针对这10个批次的供试品，分别进行如下操作：
72.加12倍量水后浸泡30min，进行加热煎煮。待沸腾后煎煮1.5h，过滤。重复提取3次，合并水煎液，于旋转蒸发仪减压浓缩至含生药量1g/ml，即得复方水煎浓缩液。将复方浓缩液置80℃水浴锅蒸至无流动性后，放入真空干燥箱进行干燥，干燥温度保持80℃，持续干燥7天，取出，放至常温后粉碎，即得复方浸膏粉；
73.精密称取浸膏粉，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇定容至10ml，稀释至6mg/ml，振摇，超声30min滤过，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
74.(2)混合对照品溶液的制备
75.分别精密称定绿原酸、6
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o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、水仙苷对照品适量，加70％甲醇溶解分别制成每1ml约含100μg的溶液。精密量取上述对照品溶液各1ml，置同一100ml容量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(每1ml含各对照品lμg)；
76.(3)超高效液相色谱法测定菊苓复方指纹图谱
77.将步骤(1)制备得到的10个批次的菊苓复方供试品溶液和步骤(2)制备得到的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪。
78.色谱条件：色谱柱采用accquity uplc hss t3色谱柱(内径2.1mm、柱长100mm、粒径1.8μm)，以甲醇为流动相a，0.1％甲酸水溶液为流动相b，流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量为2μl，检测波长为300nm，按下表进行梯度洗脱。
79.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0-25
→
1095
→
902-1610
→
4090
→
6016-2640
→
5460
→
4626-26.554
→
9546
→
526.5-27.595527.5-2895
→
55
→
95
80.将获得的10个批次的菊苓复方供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)：选择10个批次菊苓复方色谱图中均存在且含量较高的色谱峰作为共有峰；用中位数计算法生成菊苓复方的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，对照指纹图谱中有15个共有指纹峰，(10批次供试品溶液的指纹图谱相识度均大于0.90)。
81.15个共有指纹峰的保留时间如图1所示，本实施例获得的对照指纹图谱如图2所示。
82.实施例2：方法学考察
83.1.精密度实验
84.精密吸取同一批次菊苓复方粉末，按上述实施例1的步骤(1)方法制备得到供试品溶液，按上述实施例1步骤(3)色谱条件重复进样6次，计算共有峰1，2，3，5，6，7，8，10的峰面积的rsd值均《4.0％，保留时间的rsd均《1.0％，证明仪器精密度良好。
85.2.重复性试验
86.精密吸取同一批次菊苓复方粉末，按上述实施例1的步骤(1)方法平行制备得到6份供试品溶液，按上述实施例1步骤(3)色谱条件进样6次，计算共有峰1，2，3，5，6，7，8，10的峰面积的rsd值均《3.5％，保留时间的rsd均《1.0％，证明该方法重复性良好。
87.3.稳定性试验
88.精密吸取同一批次菊苓复方粉末，按上述实施例1的步骤(1)方法制备得到供试品溶液，按上述实施例1步骤(3)色谱条件分别在制样后的0h、1h、2h、5h、12h和24h进样分析，计算共有峰1，2，3，5，6，7，8，10的峰面积的rsd值均《3.5％，保留时间的rsd均《1.0％，证明供试品溶液在24h内稳定性良好。
89.经过上述研究可以确定，本发明用指纹图谱技术建立了菊苓复方的uhplc指纹图谱，可快速、直观地辨识复杂中药汤剂体系中的药效物质基础；同时结合灰色关联度分析和偏最小二乘法分析等化学识别模式，评价各批次样品之间的质量差异，为菊苓复方的关键质量属性研究提供参考，为后续相关制剂的制备工艺、质量控制以及产品安全性、稳定性的评价提供有益的参考。
90.最后，需要注意的是：以上列举的仅是本发明的具体实施例子，当然本领域的技术人员可以对本发明进行改动和变型，倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种菊苓复方指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将菊苓复方制成供试品溶液；(2)采用从绿原酸、6
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o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷构成的组中选出的至少2种对照品制备混合对照品溶液；(3)分别将所述供试品溶液和所述混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，对获得的色谱图进行相似度分析，得到所述菊苓复方指纹图谱。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用甲醇对所述菊苓复方的提取物粉末或浸膏粉进行提取，得到的上清液进行过滤得到滤液，作为所述供试品溶液；优选地，在步骤(1)中，采用70％甲醇对所述菊苓复方的提取物粉末或浸膏粉进行提取，得到的上清液采用0.22μm微孔滤膜进行过滤得到滤液，作为所述供试品溶液。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，采用绿原酸、6
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o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、3-o-咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、芦丁、异落新妇苷、异绿原酸c、槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和水仙苷制备混合对照品溶液。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，将各对照品混合之后采用甲醇溶解，得到所述混合对照品溶液；或者，采用甲醇分别将各对照品配制成对照品溶液，然后混合得到所述混合对照品溶液；优选地，在步骤(2)中，将各对照品等比例混合之后采用70％甲醇溶解，得到每种对照品的含量是lμg/ml的所述混合对照品溶液；或者，采用70％甲醇分别将各对照品配制成100μg/ml的对照品溶液，然后混合得到每种对照品的含量是lμg/ml的所述混合对照品溶液。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的色谱柱采用accquity uplc hss t3色谱柱，以甲醇为流动相a，0.1％甲酸水溶液为流动相b，流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量为2μl，检测波长为300nm；优选地，所述高效液相色谱仪的色谱柱采用规格是2.1
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100mm、1.8μm的accquity uplc hss t3色谱柱。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的洗脱条件是：0～2分钟，流动相a的体积分数由5％上升至10％，流动相b的体积分数由95％下降至90％；2～16分钟，流动相a的体积分数由10％上升至40％，流动相b的体积分数由90％下降至60％；16～26分钟，流动相a的体积分数由40％上升至54％，流动相b的体积分数由60％下降至46％；26～26.5分钟，流动相a的体积分数由54％上升至95％，流动相b的体积分数由46％下降至5％；26.5～27.5分钟，流动相a的体积分数是95％，流动相b的体积分数是5％；27.5～28分钟，流动相a的体积分数由95％下降至5％，流动相b的体积分数由5％上升
至95％。7.一种采用权利要求1～6任一项所述的构建方法得到的菊苓复方指纹图谱，其特征在于，所述菊苓复方指纹图谱包括15个指纹峰。8.根据权利要求7所述的菊苓复方指纹图谱，其特征在于，2号峰的相对保留时间为9.64min，对应的化学物质为绿原酸；3号峰的相对保留时间为10.57min，对应的化学物质为6
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o-β-d-葡萄糖基龙胆苦苷；5号峰的相对保留时间为11.51min，对应的化学物质为龙胆苦苷；8号峰的相对保留时间为16.73min，对应的化学物质为新落新妇苷；9号峰的相对保留时间为17.16min，对应的化学物质为落新妇苷；10号峰的相对保留时间为18.50min，对应的化学物质为芦丁；11号峰的相对保留时间为18.90min，对应的化学物质为异落新妇苷。9.权利要求7或8所述的菊苓复方指纹图谱在鉴别和/或评价菊苓复方的质量中的应用。10.一种鉴别和/或评价菊苓复方的品质的方法，其特征在于，包括：将待测菊苓复方的高效液相色谱图与权利要求7或8所述的菊苓复方指纹图谱进行比较，将相似度大于0.9识别为合格。

技术总结
本发明公开了一种菊苓复方指纹图谱的构建方法，包括：(1)将菊苓复方制成供试品溶液；(2)采用绿原酸、6


技术研发人员：张冰 林志健 王雨 李耀磊 韩宇
受保护的技术使用者：北京中医药大学
技术研发日：2023.08.11
技术公布日：2023/10/11