一种TF和PS修饰的脑靶向载丹参素脂质体制备方法及其应用

一种tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体制备方法及其应用。


背景技术：

2.脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现更严重的脑功能障碍，称为脑缺血/再灌注损伤（ci/ri），其机制较为复杂，主要与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性、细胞内超钙、炎性反应等多种机制有关。炎症反应的标志是星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。炎症细胞可以释放出细胞毒素，包括炎症因子等加重脑损伤，星形胶质细胞和小胶质细胞与缺血再灌注的炎症反应密切相关，可以认为是脑中潜在的巨噬细胞。星形胶质细胞和小胶质细胞在缺血后快速激活，同时增多的肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素1β可以导致星形胶质细胞和小胶质细胞进一步活化。过往的研究已经发现，星形胶质细胞和小胶质细胞在缺血再灌注中具有重要的作用，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，可以达到协同作用，进而减轻缺血再灌注的损伤。
3.丹参素对于缺血性卒中有着很好的保护作用，对于神经保护等的保护均有很好的作用，可以通过多种机制减轻缺血引起的脑损伤，包括：改善微循环、抗炎、抗氧化等作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。本发明设计将丹参素制备为载药的脂质体，经过tf和ps修饰，起到靶向中枢的作用，同时脂质体具有很好的脂溶性，可以透过血脑屏障，所以该靶向递药系统从理论上具良好的脑靶向性，对于缺血再灌注的药物研究有着一定的积极意义。
5.为实现上述目的，本发明第一方面，提供如下技术方案：（1）将薄膜材料（卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油（dppg）、磷脂-聚乙二醇-转铁蛋白（tf）、磷脂酰丝氨酸（ps）溶解在适量的甲醇/氯仿（1:3，v/v）中；（2）将混合物在40℃水浴中用旋转蒸发仪减压旋转蒸发1小时，除去有机溶剂，形成薄而均匀的类脂膜；（3）将混合物在40℃水浴中在硫酸铵溶液中水合1h，得到脂质体混悬液；（4）丹参素（dss）溶于1ml生理盐水中，加入到脂质体混悬液中，在摇床上100rpm的转速反应20min；（5）将反应溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），并用生理盐水透析2小时；（6）将溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），用纯化水透析2h；（7）在超声波细胞粉碎仪中对透析袋中的溶液进行超声波处理，直到其呈半透明（功率：35%，时间：1.8秒，间隔0.2秒，60个循环）；
（8）冷冻干燥后得到丹参素脂质体。
6.第二方面，一种根据第一方面所述制备方法制得的双靶头脑靶向载丹参素脂质体。
7.第三方面，一种根据第二方面所述的双靶头脑靶向载丹参素脂质体在制备治疗脑卒中药物的用途。
8.本发明的有益效果是：本发明的双靶头脑靶向载丹参素脂质体能够增加丹参素透过缺血区血脑屏障的能力，同时增加了丹参素在缺血脑区的聚集，提高了丹参素治疗急性缺血性脑卒中的作用。与传统用于治疗缺血性脑卒中的丹参素相比，本发明提高了丹参素的脑靶向性和治疗脑卒中效果。并且制备工艺简单，方法条件温和，制造成本低廉，对于脑卒中治疗具有药物经济学优势，适宜临床应用和市场推广。
附图说明
9.图1.脂质体的表征。tf/ps/dss-lps的粒径分布图（a），tf/ps/dss-lps的zeta电位图（b）；dss-lps的tem图（c）；tf/ps/dss-lps的稳定性图（d）；tf/ps/dss-lps和dss-lps在37℃的pbs溶液（ph6.5）中的释放曲线图（e，n=3）。
10.图2.安全性和生物相容性。tf/ps/dss-lps的溶血性图（a）；tf/ps/dss-lps溶血率统计结果图（b，n=3）；mtt法检测dss-lps和tf/ps/dss-lps对细胞存活率的影响（c，n=6）。
11.图3.星形胶质细胞和小胶质细胞对脂质体的摄取。流式细胞术分析星形胶质细胞的摄取机制（a）；荧光强度统计图（b，n=3，**p ＜ 0.01）；激光共聚焦显微镜（c）和流式细胞术（d）观察星形胶质细胞对tf/ps/dss-lps的摄取，比例尺=20μm；激光共聚焦显微镜（e）和流式细胞术（f）观察小胶质细胞对tf/ps/dss-lps的摄取，比例尺=20μm。
12.图4. 星形胶质细胞和小胶质细胞通过bbb对tf/ps/dss-lps的摄取。体外bbb建立（a）；tf/ps/dss-lps跨体外bbb的转运效率（b，n=3，*p ＜ 0.05）；bbb完整性评价（transwell跨膜电阻值（teer），图c，n=3）；体外bbb模型示意图（d）；荧光分光光度计检测tf/ps/dss-lps透过bbb对星形胶质细胞（e）和小胶质细胞（f）的摄取（n=3，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01）；激光共聚焦显微镜（g）和流式细胞术（h）观察星形胶质细胞的摄取，比例尺=20μm；激光共聚焦显微镜（i）和流式细胞术（j）观察小胶质细胞的摄取，比例尺=20μm；图5. tf/ps/dss-lps对ogdr损伤细胞的影响。星形胶质细胞的存活率（a，n=6，**p ＜ 0.01）；小胶质细胞的存活率（b，n=6，**p ＜ 0.01）；星形胶质细胞nf-κb和p-nf-κb蛋白表达（c）和统计图（d，n=3，**p ＜ 0.01）；小胶质细胞tlr4蛋白表达（e）和统计图（f，n=6，**p ＜ 0.01），图6.dss-lps和tf/ps/dss-lps靶向缺血脑组织的能力。mcao大鼠静脉注射dir（亲脂性荧光染料）、dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps-dir后不同时间点的活体实时图像（a）；各组大鼠解剖离体器官的代表性荧光图像（b）；各组大鼠解剖离体脑组织的荧光图像（c）；脑内荧光强度定量结果图（d，**p＜0.01）；荧光显微镜观察大鼠脑组织冰冻切片的荧光分布图（e）;伊文思蓝染色图（f）和伊文思蓝含量统计图（g，n=3，**p ＜ 0.01）。
13.图7.tf/ps/dss-lps对mcao/r模型大鼠脑梗死体积及神经功能的影响。ttc染色脑组织切片（a）；脑梗死体积定量分析结果图（b，n=6，**p ＜ 0.01）；神经功能评分（c，n=10，**p ＜ 0.01）；h&e染色、tunel染色和neun免疫荧光染色分析结果图（d，比例尺bar=20μ
m）。
14.图8.tf/ps/dss-lps治疗mcao大鼠的rna测序结果分析。mcao与control组和tf/ps/dss-lps组与mcao组差异基因火山图（a，b）； control组、mcao组和tf/ps/dss-lps组20种代表性差异基因的聚类热图（c）；kegg分析和go bp分析图（d）； mcao与control组和tf/ps/dss-lps组与mcao组log2 flod change和p-value（e，f）。
15.图9.tf/ps/dss-lps对nf-κb通路和tlr4通路的影响。elisa法检测tnf-α（a）、il-6（b）和il-1β（c）的表达水平（n=6，*p＜0.05，**p＜0.01）。gfap、iba1、nf-κb和tlr4免疫荧光染色（d-f，n=3，比例尺bar=20μm）以及western blot图（g-j，n=3，*p＜0.05，**p＜0.01）。
16.图10.tf/ps/dss-lps对星形胶质细胞表型转换的影响。c3和s100a10免疫荧光染色（a，b，比例尺bar=20μm）和western blot图（c、d，n=3，*p＜0.05，**p＜0.01）。
17.图11.tf/ps/dss-lps体内安全性评价。大鼠脑、心、肝、脾、肺和肾h&e染色图（a，比例尺=20μm）；alt（b）、ast（c）、bun（d）和crea（e）的含量统计图（n=6）。
实施方式
18.下面结合实施例对本发明进一步说明：实施例1tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体制备及表征1.tf/ps/dss-lps的制备在一个典型的实例中，可以按照以下步骤制备tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体：（1）将薄膜材料（卵磷脂6mg、胆固醇500μg、二棕榈酰磷脂酰甘油（dppg）2mg、tf1mg、ps500μg）溶解在适量的甲醇/氯仿（1:3，v/v）中；（2）将混合物在40℃水浴中用旋转蒸发仪减压旋转蒸发1小时，除去有机溶剂形成薄而均匀的类脂膜；（3）将混合物在40℃水浴中在硫酸铵溶液中水合1h；（4）将4mgdss溶于1ml生理盐水中，加入脂质体混悬液，在摇床上反应20min；（5）将反应溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），并用生理盐水透析2小时；（6）将溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），用纯化水透析2h；（7）在超声波细胞粉碎仪中对透析袋中的溶液进行超声波处理，直到其呈半透明（功率：35%，时间：1.8秒，间隔0.2秒，60个循环）；（8）冷冻干燥后得到脂质体tf/ps/dss-lps。
19.2.dss-lps的制备在一个典型的实例中，可以按照以下步骤制备ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体：（1）将薄膜材料（卵磷脂6mg、胆固醇500μg、二棕榈酰磷脂酰甘油（dppg）2mg、dspe-peg20001mg、ps500μg）溶解在适量的甲醇/氯仿（1:3，v/v）中；（2）将混合物在40℃水浴中用旋转蒸发仪减压旋转蒸发1小时，除去有机溶剂形成薄而均匀的类脂膜；（3）将混合物在40℃水浴中在硫酸铵溶液中水合1h；（4）将4mgdss溶于1ml生理盐水中，加入脂质体混悬液，在摇床上反应20min；
（5）将反应溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），并用生理盐水透析2小时；（6）将溶液转移到透析袋中（分子截留量为1000da），用纯化水透析2h；（7）在超声波细胞粉碎仪中对透析袋中的溶液进行超声波处理，直到其呈半透明（功率：35%，时间：1.8秒，间隔0.2秒，60个循环）；（8）冷冻干燥后得到脂质体dss-lps。
20.3.测试与评价粒径、多分散指数（pdi）及电位：采用动态光散射法测定了不同脂质体的粒径、多分散性指数和zeta电位。
21.如图1a所示，与dss-lps相比，tf/ps/dss-lps的粒径略有减小。具体参数包括粒径（size）、pdi、zeta电位、包封率（ee）和载药量（dl），如表1所示。
[0022][0023]
dss标准曲线：精密称取丹参素对照品10.00mg，置于25ml容量瓶内，加甲醇充分溶解并定容，得质量浓度为0.40mg/ml的丹参素对照品溶液；精密吸取丹参素对照品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml）分别于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配置成20、40、60、80、100、120
µ
g/ml的dss溶液。采用hplc测定dss浓度，检测波长为280nm，以dss浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算标准曲线的回归方程。以峰面积对dss浓度进行线性拟合，得到检测dss标准曲线的回归方程为 y=6959.7x-4470，r2=0.9983。dss 浓度在20~120
µ
g/ml 范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。
[0024]
ee和dl：将2mg的dss-lps和tf/ps/dss-lps冻干粉分别溶于1ml去离子水中，超声10min破乳，然后加入1ml色谱甲醇超声10min。过0.22μm的微孔滤膜，采用高效液相色谱法测定其中dss的含量。固定相为c18色谱柱（250
×
4.6mm，5μm）。流动相为乙腈：0.1％冰乙酸溶液，比例为10：90（v/v），流速为1ml/min，柱温35℃。检测波长λ=280nm，进样量为10μl。脂质体的dl和ee的计算公式如下：ee（％）＝在dss-lps和tf/ps/dss-lps中dss的重量/dss投药量
×
100%dl（％）＝在dss-lps和tf/ps/dss-lps中dss的重量/脂质体的重量
×
100%结果如表1所示，与dss-lps相比，tf/ps/dss-lps的ee和dl未有明显改变。
[0025]
稳定性研究：将dss-lps和tf/ps/dss-lps置于4℃下，在预定的时间间隔内测量粒径和pdi, 并绘制时间-粒度、pdi曲线图。由图1d所示，在4℃下20d内，脂质体的粒径变化很小，表明其随时间的稳定性很好。
[0026]
透射电镜（tem）分析：将1mg脂质体粉末溶于2ml去离子水中，滴10μl脂质体于碳膜涂层的铜网上，待快挥干时再滴加10μl磷钨酸（v/v，2%）溶液。用tem观察脂质体的形貌。结果如图1c所示，tem图像中dss-lps和tf/ps/dss-lps呈现均一的球型，两者均有明显的核壳结构，且tf/ps/dss-lps表面有一层tf修饰的靶头。
[0027]
体外药物释放：秤取一定量的dss-lps，溶于4ml的pbs（ph6.5）中，转移至截留分子量为1000da的透析袋中，分散于30ml的pbs中孵育，于 37℃恒温摇床中振荡透析。每隔一定
时间吸取3ml透析袋外液并补充相同体积的孵育液，用hplc测定峰面积。根据dss标准曲线计算释药量，以时间为横坐标，以dss的释放量为纵坐标，绘制dss-lps的释药曲线。dss-lps和tf/ps/dss-lps的释药动力学如图1e所示。tf/ps/dss-lps 2h累积释药56.65%，96h累积释药81.77%；dss-lps2h累积释药56.21%，96h累积释药74.73%。
[0028]
体外溶血试验：取sd大鼠全血10ml，离心（3000rpm，15min）；收集红细胞，并用生理盐水洗3次后，配置2.0%的红细胞悬液。将tf/ps/dss-lps加入到配置好的红细胞悬液，配置tf/ps/dss-lps（3.125、6.25、12.5、25、50和100μm）溶液，轻摇混匀，在37
°
c水浴中孵育1h，离心（3000rpm，15min），用紫外分光光度计测定415nm波长处的上清液吸光度。以生理盐水作为阴性对照，0.1%（v/v）dmso作为阳性对照，计算溶血率。如图2a、b所示，脂质体均未出现明显的溶血现象。
[0029]
溶血率（%）=（样品吸光度值-阴性对照吸光度值）/阳性对照吸光度值
×
100%。
[0030]
体外细胞毒性试验：利用mtt法考察tf/ps/dss-lps和dss-lps对huvec的毒性作用。取对数生长期的huvec细胞，pbs缓冲液清洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化2min，加入完全培养基终止消化，用无菌吸管吹打，离心（1500rpm，5min），弃去上清，加入完全培养基用无菌吸管吹打，使其悬浮于完全培养基中，吹匀后计数，接种于96孔板中（1
×
104个/孔，100μl/孔）。置于37℃的co2培养箱中24h，弃去培养基，将tf/ps/dss-lps和dss-lps溶于无血清的培养基中，浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200
µ
g/ml，以无血清培养基作为对照，每孔加入100μl，培养48h。向每孔加入10μl的mtt溶液（5mg/ml），继续培养4h后弃去培养基，每孔加入100μl的dmso。在全波长酶标仪上振荡孵育10min，于570nm处测定吸光度值，记录结果，比色以空白调零。以药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生存曲线图。结果发现，dss-lps和tf/ps/dss-lps组均未观察到明显的细胞毒性（图2c），说明dss-lps和tf/ps/dss-lps组均具有良好的生物相容性。
[0031]
细胞生存率%=（药物处理组的吸光度值/阴性对照的吸光度值）
×
100％。
[0032]
实施例2tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体的体外细胞摄取研究1.体外细胞摄取研究取对数生长期的星形胶质细胞和小胶质细胞，用pbs缓冲液清洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化2min，加入完全培养基终止消化，用无菌吸管吹打，离心（1500rpm，5min），弃去上清，加入完全培养基用无菌吸管吹散细胞，使其悬浮于完全培养基中，吹匀后计数，接种于6孔细胞培养板中（5
×
105个/孔，2ml/孔），在细胞培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后弃去培养基。将dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps-dir溶于无血清培养基，加入六孔板中，再分别孵育30min和4h，每组设置三个复孔。孵育完成后，弃去培养基。用预热的pbs缓冲液清洗细胞3次，5min/次，用0.25%胰蛋白酶消化，加入等体积的培养基终止消化，用无菌吸管吹散后收集细胞，离心（1500rpm，5min）后，弃去上清液，用400μl的pbs缓冲液重新悬浮收集到的细胞，采用流式细胞仪测定星形胶质细胞和小胶质细胞对tf/ps/dss-lps的摄取。
[0033]
取对数生长期的星形胶质细胞和小胶质细胞，用pbs缓冲液清洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化2min，加入完全培养基终止消化，用无菌吸管吹打，离心（1500rpm，5min），弃去上清，加入完全培养基用无菌吸管吹打，使其悬浮于完全培养基中，吹匀后计数，接种于φ22mm玻底培养皿中（5
×
105个/孔，2ml/孔），在细胞培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后弃去培养基。将dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps-dir溶于无血清培养基，加入玻底培养皿中，再分别
孵育30min和4h，每组设置三个复孔。孵育完成后，弃去培养基。用预热的pbs缓冲液清洗细胞3次，5min/次，用1ml多聚甲醛溶液（4%）固定15min，再用pbs缓冲液清洗3次，dapi溶液（500ng/ml）染色15min，注意避光，再用pbs缓冲液清洗3次。最后采用激光共聚焦显微镜观察星形胶质细胞和小胶质细胞对tf/ps/dss-lps的摄取情况。
[0034]
如图3c和3e所示，tf/ps/dss-lps-dir组的荧光高于dir和dss-lps-dir组，说明tf/ps/dss-lps-dir能更有效地进入星形胶质细胞和小胶质细胞。流式细胞术（图3d、3f）分析也得出相同的结论。这些结果表明，tf/ps/dss-lps-dir对星形胶质细胞和小胶质细胞具有较高的亲和力，这有助于tf/ps/dss-lps-dir特异性地将dss输送到tfr高表达的缺血半暗带区。
[0035]
2.体外细胞摄取机制研究星形胶质细胞以5
×
105细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h，待细胞贴壁后弃去培养液。对照组加入正常培养液，抑制剂组分别加入10
µ
g/ml氯丙嗪（网格蛋白途径摄取抑制剂）、800
µ
g/ml秋水仙素（大胞饮途径摄取抑制剂）、5
µ
g/ml甲基-β-环糊精（小窝蛋白途径摄取抑制剂）、100
µ
g/ml dspe-peg2000-ps（竞争结合psr）和900
µ
g/ml 2-脱氧-d-葡萄糖（atp抑制剂）各2ml，置于co2恒温培养箱中孵育。预处理1h，各组均加入tf/ps/dss-lps，继续孵育4h。弃去培养液，用预热的pbs缓冲溶液（37℃，ph7.4）洗3 次细胞，5min/次，用0.25%的胰酶消化细胞，收集细胞，1500r/min，离心5 min，弃去上清液，用 400
ꢀµ
l pbs缓冲溶液（ph7.4）重新悬浮收集到的细胞，采用流式细胞仪测定星形胶质细胞对tf/ps/dss-lps的摄取量，如图3a和3b。结果发现，ps和2-脱氧-d-葡萄糖抑制了星形胶质细胞的摄取，因此，tf/ps/dss-lps通过psr介导的内吞作用和能量依赖的主动转运过程对星形胶质细胞进行摄取。
[0036]
3.体外血脑屏障模型的建立bend.3细胞以1
×
105细胞/孔的密度接种于transwell供池中，在受池中加入dmem完全培养液，每隔一天更换一次培养液。培养7天后，采用电阻仪检测transwell供池和受池之间的电阻值，当电阻值＞200ω/cm2时，即认为体外血脑屏障模型构建成功。弃去培养液，分别将dss、dss-lps和tf/ps/dss-lps溶于无血清培养液后，加入供池中孵育12 h，测定其跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，teer）以评估bbb的完整性。弃去培养液，分别将dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps-dir溶于无血清培养液后，加入供池中孵育4h。采用荧光分光光度计测定受池中dir荧光强度，并计算脂质体的体外bbb透过率。转运效率（%）=（transwell受池中培养液荧光强度/给药前纳米粒溶液荧光强度）
×
100%。从图4b可以看出, tf/ps/dss-lps-dir体外bbb透过率显著大于dss-lps-dir（p＜0.05）；并且如图4c所示，体外血脑屏障模型构建成功后，在预定时间内测定其跨膜电阻，均在200ω/cm2以上，表明构建的bbb是完整的。
[0037]
4.脂质体跨体外血脑屏障转运（1）bend.3细胞以1
×
105细胞/孔的密度接种于transwell供池中，在受池中加入dmem完全培养液，每隔一天更换一次培养液。培养7天后，采用电阻仪检测transwell供池和受池之间的电阻值，当电阻值＞200ω/cm2时，将星形胶质细胞和小胶质细胞以2
×
105细胞/孔的密度接种于24孔板中。培养24h，待细胞贴壁后更换新的dmem完全培养液。将上述的tanswell供池置于24孔板中，弃去培养液，分别将dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps-dir溶于
无血清培养液后，加入供池中孵育1、6h。收集受池中的溶液，采用荧光分光光度计测定预定时间内受池中dir荧光强度，计算dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps的体外bbb穿透效率。如图4e、f所示，在预定时间内，tf/ps/dss-lps-dir透过bbb对星形胶质细胞和小胶质细胞的摄取显著多于dss-lps-dir（p＜0.05）。
[0038]
（2）按照（1）的操作，在transwell供池中加入dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps孵育 1、6 h 后，收集受池中的星形胶质细胞和小胶质细胞，采用流式细胞术分析dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps在这两种细胞内的蓄积。
[0039]
（3）接种星形胶质细胞和小胶质细胞前在24孔板中预先放置盖玻片，按照（1）的操作，在transwell供池中加入dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps孵育1、6h 后，弃transwell供池，弃去培养液，用预热的 pbs 缓冲液（ph7.4）洗涤3次，每次5min；受池中加入 4%多聚甲醛 1 ml，在co2恒温培养箱中固定 15 min，用预热的 pbs 缓冲液洗涤3次，每次5min；加入dapi溶液（500ng/ml）1ml，在co2恒温培养箱中染色 15 min，用预热的 pbs 缓冲液（ph7.4）洗涤3次，每次5min，除去残留的 dapi 溶液；在载玻片上预先滴加1滴抗荧光淬灭剂，将盖玻片倒扣于载玻片上，采用激光共聚焦显微镜观察脂质体在星形胶质细胞和小胶质细胞内的蓄积。
[0040]
如图4g-j所示，在预定时间内，tf/ps/dss-lps-dir透过bbb对星形胶质细胞和小胶质细胞的摄取明显多于dss-lps-dir。
[0041]
5. 细胞氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation and reperfusion, ogdr）模型制作实验分为5组：对照组（control）、模型组（ogdr）、ogdr+dss组、ogdr+dss-lps组和ogdr+tf/ps/dss-lps组（相当于dss5μmol/l），每组设6个复孔。取对数生长期的星形胶质细胞和小胶质细胞，pbs缓冲液清洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化2min，加入完全培养基终止消化，用无菌吸管吹打，离心（1500rpm，5min），弃去上清，加入完全培养基用无菌吸管吹打，使其悬浮于完全培养基中，吹匀后计数，接种于96孔板中（1
×
104个/孔，100μl/孔）。孵育24h后，吸弃培养基，分别加入100μl无糖培养基，置于缺氧小室中培养（37℃，5%co2，95%n2）2h，吸弃无糖培养基，control组和ogdr损伤组每孔加入100μl无血清培养基，给药组分别加入100μl含有dss、dss-lps和tf/ps/dss-lps的无血清培养基，以不加药物的无血清培养液为对照组，100μl/孔，每组设6个复孔，置于二氧化碳培养箱孵育72h。每孔加入cck-8溶液10μl，置于二氧化碳培养箱中继续孵育1h，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。细胞存活率=（给药组吸光度值/对照组吸光度值）
×
100%，如图5a、5b所示，星形胶质细胞ogdr造模后，tf/ps/dss-lps给药组与ogdr组相比有显著性差异（p＜0.01），且tf/ps/dss-lps给药组细胞存活率显著高于dss和dss-lps。小胶质细胞ogdr造模后，tf/ps/dss-lps给药组与ogdr组相比有显著性差异（p＜0.01），且tf/ps/dss-lps给药组细胞存活率显著高于dss和dss-lps。结果表明，tf/ps/dss-lps可以提高ogdr损伤星形胶质细胞和小胶质细胞的存活率。
[0042]
6. western blot将膜与以下抗体在4
°
c下孵育过夜：phospho-nf-κb p65（ser536）（p-nf-κb）、nf-κb p65、tlr4、c3、s100a10和gapdh。次日，将膜与hrp偶联的二抗孵育2小时。采用li-cor odyssey系统用于检测蛋白质条带。结果如图5c-d所示，表明tf/ps/dss-lps可通过nf-κb和tlr4通路，促进a1型星形胶质细胞向a2型星形胶质细胞转化，从而改善脑缺血再灌注损伤。
[0043]
实施例3tf和ps修饰的脑靶向载丹参素脂质体对大鼠局部脑缺血再灌注的影响1.活体成像正常sd大鼠尾静脉注射dir、dss-lps-dir和tf/ps/dss-lps，在1、6、12h、24h后采用活体成像仪观察脂质体在大鼠体内的分布。24h观察完之后将大鼠处死后，取出脑、心、肝、脾、肺和肾等器官组织，活体成像仪观察脂质体在大鼠各器官组织的蓄积。如图6a、b所示，活体成像结果提示tf/ps/dss-lps可有效靶向于大脑，且其分布呈时间依赖性增加。如图6c、d所示，对脑组织进行活体成像并进行统计学分析，结果提示，tf/ps/dss-lps组脑组织荧光强度显著大于dir组和dss-lps组（p＜0.01），说明tf/ps/dss-lps可以更有效地靶向于大脑。脑组织进行冰冻切片，显微镜下观察其荧光强度，结果如图6e，与上述统计学分析得出的结论一致。
[0044]
2.伊文思蓝染色评估体内血脑屏障通透性再灌注72h后，通过尾静脉给大鼠注射2%伊文思蓝溶液（4ml/kg体重）。2小时后用2%戊巴比妥钠（0.3ml/100g体重）麻醉大鼠，打开胸腔，心内灌注生理盐水200~300ml，至右心房流出的液体变澄清即可。快速断头、取脑，并拍照。矢状切取半脑，以分离缺血半球。取一半进行称重，然后将脑组织剪碎置于甲酰胺（1ml/mg脑组织）中匀浆，并在60
˚
c下孵育24小时，然后1000
×
g离心30分钟。收集上清液，使用全波长酶标仪检测波长在620nm时的吸光度，并计算梗死区与对侧脑组织伊文思蓝含量。mcao组梗死区脑组织伊文思蓝含量显著高于control组（p＜0.01）；tf/ps/dss-lps组梗死区脑组织伊文思蓝含量显著低于dss组和dss-lps组（p＜0.01，图6f、g）。
[0045]
3.大鼠大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion,mcao）模型制作将大鼠随机分为对照组（control）、模型组（mcao）、dss、dss-lps和tf/ps/dss-lps治疗组5组，给药组相当于dss2.5mg/kg，control和mcao尾静脉注射生理盐水。将大鼠置于条件适宜的动物房适应性生长3天。大鼠mcao造模前1天禁食，手术前用2%戊巴比妥钠（0.3ml/100g体重）麻醉，然后固定于手术板上，剔除大鼠颈部的毛，碘酒消毒，用眼科剪在颈正中剪开约1.5cm的切口，眼科弯镊钝性分离大鼠右侧颈总动脉（cca），小心分离与血管紧贴的神经。顺着cca继续向上小心钝性分离直至看见一个上下结构的分叉，分叉上为颈外动脉（ica）下为颈内动脉（eca）。结扎cca近心端和ica，cca结扎前端分叉口后用显微剪切口，插入mcao线拴，至有轻微阻力时立即停止，进线大约17~18mm，结扎eca并固定线栓，缝合伤口，将线栓暴露在外。将大鼠放置保温箱中取暖保温，2小时后将露出伤口的线栓拔出标记的点即可。再灌注完之后立即给药，待大鼠苏醒后，放回鼠笼中，之后连续给药三天，每天一次。
[0046]
4.脑梗死体积测定在最后一次神经功能评分后，将各组sd大鼠用2%戊巴比妥钠（0.3ml/100g体重）快速麻醉，迅速切除大脑，小心剥离脑组织，用生理盐水清洗两次，置冰上冰冻20min；将预冷的大脑放置在专用脑槽中，用刀片切成2mm厚度的冠状切片；用ttc溶液进行染色，水浴37℃避光染色30min，将ttc溶液吸出，加入4%多聚甲醛溶液固定24h。第二天，按顺序取出脑片，在同一条件下拍照，ttc染色后红色为大鼠正常脑组织，白色为大鼠梗死组织（图7a）。最后用adobephotoshopcs6软件处理照片，并用image-proplus软件分析脑组织梗死体积，为了补偿脑水肿的影响，梗死体积以对侧半球体积的百分比表示，校正公式为：修正梗死体积
lps可显著降低脑组织中tnf-α、il-6和il-1β的含量（图9a-c），表明tf/ps/dss-lps可减轻炎症反应。
[0052]
10. 免疫荧光染色将石蜡包埋的脑组织切片并在二甲苯和乙醇溶液中脱水，并进行免疫荧光分析。研究中使用的主要抗体包括兔抗neun、gfap、iba1、tlr4、p-nf-κb p65、c3和s100a10。细胞核用dapi染色。用荧光显微镜对梗死组织和正常组织之间的缺血半暗带区进行荧光成像。表明tf/ps/dss-lps可通过nf-κb和tlr4通路，减轻炎症反应（图9d-f），并促进a1型星形胶质细胞向a2型星形胶质细胞转化，最终改善脑缺血再灌注损伤。（图10a，10b）11.western blot将膜与以下抗体在4
°
c下孵育过夜：gfap、iba1、tlr4、p-nf-κb p65（ser536）、nf-κbp65、c3、s100a10和gapdh。次日，将膜与hrp偶联的二抗孵育2小时。采用li-cor odyssey系统用于检测蛋白质条带。表明tf/ps/dss-lps可通过nf-κb和tlr4通路（图9g-j），促进a1型星形胶质细胞向a2型星形胶质细胞转化，从而改善脑缺血再灌注损伤（图10c，10d）。
[0053]
12.体内安全性评价为了阐明脂质体的生物安全性，再灌注72小时后收集各组mcao大鼠心、肝、脾、肺和肾等器官组织，然后在4%多聚甲醛中固定24小时。组织经石蜡包埋、切片后进行h&e染色。在倒置显微镜下观察组织形态的变化。根据试剂盒说明书测定谷丙转氨酶（alt）、谷草转氨酶（ast）、血尿素氮（bun）和肌酐（crea）水平。dss组、dss-lps组和tf/ps/dss-lps组与control组相比无明显组织学改变（图11a）；并且dss组、dss-lps组和tf/ps/dss-lps组alt、ast、bun和crea含量均在正常值范围内（图11b-d）。这些结果表明实验剂量的tf/ps/dss-lps在体内具有良好的生物相容性和安全性。

技术特征：
1.一种丹参素脂质体药物，包括丹参素和脂质体载体，其特征在于，所述药物还包括修饰因子；所述修饰因子包括磷脂-聚乙二醇-转铁蛋白和磷脂酰丝氨酸。2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述的脂质体载体包括卵磷脂、胆固醇和二棕榈酰磷脂酰甘油。3.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油、磷脂-聚乙二醇-转铁蛋白、磷脂酰丝氨酸、丹参素的质量比为12：1：4：2：1：4-8。4.权利要求1-3任一项所述药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油、磷脂-聚乙二醇-转铁蛋白、磷脂酰丝氨酸溶解在溶剂中混合均匀；2）除去步骤1）得到的混合物中的溶剂，形成薄膜；3）将步骤2）去除溶剂的混合物在硫酸铵溶液中水合，得到脂质体混悬液；4）将丹参素溶于生理盐水中，加入步骤3）得到的脂质体混悬液，反应完全得到tf和ps修饰的丹参素脂质体；5）提纯步骤4）得到的tf和ps修饰的丹参素脂质体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的溶剂为体积比为1：3的甲醇/氯仿混合溶剂。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰甘油、磷脂-聚乙二醇-转铁蛋白、磷脂酰丝氨酸在甲醇/氯仿混合溶剂中完全溶解后，将混合物置于40℃水浴中用旋转蒸发仪减压旋转蒸发1小时，除去溶剂。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中，将步骤2）去除溶剂的混合物在40℃水浴中在硫酸铵溶液中水合1h，得到脂质体混悬液。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤5）对tf和ps修饰的丹参素脂质体的提纯方法包括：5.1）将步骤4）所得溶液转移到透析袋中用生理盐水透析；5.2）将步骤5.1）所得溶液转移到透析袋中用纯化水透析；5.3）对步骤5.2）所得透析袋中的溶液进行超声波破碎处理，直至溶液呈半透明状；5.4）冷冻干燥步骤5.3）透析袋中的溶液，得到tf和ps修饰的丹参素脂质体。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下a1）-a3）的一项或多项：a1）步骤5.1）用生理盐水透析时，透析袋的分子截留量为1000da，透析2小时；a2）步骤5.2）用纯化水透析时，透析袋的分子截留量为1000da，透析2小时；a3）步骤5.3）将透析袋中的溶液在超声波细胞粉碎仪中进行超声波处理，参数为：功率35%，时间1.8秒，间隔0.2秒，60个循环。10.权利要求1-3任一项所述的一种丹参素脂质体药物的应用，其特征在于，为b1）-b8）中的至少一种：b1）制备用于治疗脑卒中的药物；b2）制备用于提高神经功能的药物；b3）制备用于激活和/或通过nf-κb和/或tlr4信号通路的药物；b4）制备用于促进a1型星形胶质细胞向a2型星形胶质细胞转化的药物；
b5）制备用于降低脑组织中tnf-α、il-6和il-1β的含量和/或蛋白表达的药物；b6）制备用于激活nf-κb转录因子活性通路、肿瘤坏死因子介导的信号通路和/或白介素-1介导的信号通路的药物；b7）制备用于降低nfkb1、nfkb2、tnfaip3、nfkbie、il1rl1、tram1、chuk、tlr4、psmb8和/或fbln5基因表达的药物；b8）制备用于提高星形胶质细胞和小胶质细胞的存活率的药物。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，即一种用于缺血性脑卒中治疗的双靶头脑靶向载丹参素脂质体递药系统的制备方法及其应用，利用TF和PS改性丹参素，采用薄膜水合法制备脂质体。本发明双靶头修饰的脑靶向脂质体是利用TF和PS与血脑屏障（BBB）表面受体的胞吞作用进入脑内，增加了药物的血脑屏障透过率，并且使药物选择性地向缺血病灶部位富集，提高了药物的靶向能力，增强了药物对脑缺血再灌注损伤的保护作用，在治疗缺血性脑卒中方面具有很好的应用前景。治疗缺血性脑卒中方面具有很好的应用前景。治疗缺血性脑卒中方面具有很好的应用前景。


技术研发人员：丁一 白敏 崔娜 叶威良 王婧雯 文爱东 郭超 赵超 高凯
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/11