一种无机砷在诱导SKNSH细胞焦亡中的应用

一种无机砷在诱导sknsh细胞焦亡中的应用
技术领域
1.本发明涉及神经疾病技术领域，具体涉及一种无机砷在诱导sknsh细胞焦亡中的应用。


背景技术：

2.焦虑症（anxiety），又称为焦虑性神经症，是神经症这一大类疾病中最常见的一种，以焦虑情绪体验为主要特征。可分为慢性焦虑，即广泛性焦虑（generalized anxiety）和急性焦虑，即惊恐发作（panic attack）两种形式。主要表现为：无明确客观对象的紧张担心，坐立不安，还有植物神经功能失调症状，如心悸、手抖、出汗、尿频等，及运动性不安。注意区分正常的焦虑情绪，如焦虑严重程度与客观事实或处境明显不符，或持续时间过长，则可能为病理性的焦虑。
3.广泛性焦虑障碍是对多种境遇的过分焦虑和担忧，以自主神经功能兴奋和过分警觉为特征的一种慢性焦虑障碍。现有手段多使用丁螺环酮、舍曲林、帕罗西汀、苯二氮卓、文拉法辛、度洛西汀和艾司西酞普兰等药物进行治疗，丁螺环酮主要通过激活大脑5-羟色胺1a受体来改变焦虑；舍曲林是一种选择性的5-羟色胺重摄取抑制剂，能够帮助维持5-羟色胺的水平，起到抗抑郁的作用；帕罗西汀增强神经递质5-羟色胺水平；苯二氮卓是通过加强或者硬化γ-氨基丁酸的作用；文拉法辛有效低拮抗5-ht和na的再摄取，对da的再摄取也有一定的作用；度洛西汀是去甲肾上腺素和5-羟色胺再摄取抑制剂；艾司西酞普兰是一种高选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂，可以增强中枢5-羟色胺神经的相关功能；而其他相关途径的研究很少，且现有的技术中并没有mir-425-3p对广泛性焦虑具有任何影响以及作用的研究报道，为了增加对广泛性焦虑的研究，明确诱发广泛性焦虑的作用机制，研究人员针mir-425-3p的作用机制进行了一些列通路研究。


技术实现要素：

4.发明人在针对mir-425-3p的研究中首次发现：1、mir-425-3p在广泛性焦虑（gad）发挥重要作用，2、mir-425-3p通过靶向调节nfkb蛋白从而激活神经细胞焦亡，从而导致广泛性焦虑（gad）的发生，3、首次在广泛性焦虑（gad）大鼠中发现了神经细胞细胞焦亡。
5.基于上述发现：一方面，本发明提供了mir-425-3p在制备治疗焦虑症的药物中的用途。
6.进一步的，所述焦虑症为广泛性焦虑障碍。
7.进一步的，所述焦虑症为无机砷上调焦亡相关蛋白导致的广泛性焦虑障碍。
8.进一步的，所述焦亡相关蛋白为nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β和il-18。
9.进一步的，所述nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β和il-18能够引起细胞焦亡。
10.进一步的，所述细胞为神经元细胞。
11.进一步的，其中所述焦虑症为无机砷抑制mir-425-3p表达导致的广泛性焦虑障
碍。
12.进一步的，所述mir-425-3p能够与nfkb1基因存在靶向结合。
13.进一步的，所述mir-425-3p能够逆转所述细胞焦亡。
14.本发明首先通过人群研究，结果显示，无机砷中毒与广泛性焦虑（gad）共同调控的基因有181个，对这些基因进行分析发现，富集的信号通路主要与炎症反应以及转录因子的激活密切相关。
15.并在动物研究以及细胞研究上各有结果显示，各结果显示如下：动物研究结果显示：无机砷暴露导致大鼠活动度减弱、探索行为降低等广泛性焦虑（gad）样行为；无机砷暴露能够上调大鼠前额叶皮质nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β、il-18等焦亡相关蛋白表达水平；无机砷暴露能降低大鼠前额叶皮质mir-425-3p的表达水平。
16.细胞研究结果显示：无机砷暴露能上调sknsh神经细胞中nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β、il-18等焦亡相关蛋白表达水平；无机砷暴露能降低sknsh神经细胞中mir-425-3p的表达水平；双荧光素酶报告基因实验显示mir-425-3p与nfkb1基因存在靶向结合；过表达mir-425-3p通过抑制nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β、il-18等焦亡相关蛋白表达水平，逆转无机砷引起的sknsh细胞焦亡。
附图说明
17.图1为本发明实施例一中饮水型砷暴露引起大鼠gad行为的活动轨迹图；图2为本发明实施例二中饮水型砷暴露的作用机制图；图3为本发明实施例三中砷对大鼠前额叶皮质所引起的蛋白表达示意图；图4为本发明实施例四中砷对sknsh细胞中各蛋白表达水平的示意图；图5为本发明实施例五中砷暴露对大鼠血浆以及sknsh神经细胞的差异表达的验证；图6为本发明实施例六中生物信息学以及双荧光报告基因显示的结果图；图7为本发明实施例七中mir-425-3p逆转naaso2的各蛋白表达水平显示图；图8为本发明无机砷诱发gad机制图。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-8，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.大鼠：购自广州维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为no.3359754033实施例一：本实施例通过对大鼠喂食不同浓度的饮水，进行了四种大鼠模型的建立，并以此
确认砷对大鼠gad样行为的影响作用是否相关。
20.选取8周龄spf级的成年健康雄性wistar大鼠，体重在（355.18
±
6.60）g范围。
21.该研究获得桂林医学院伦理委员会的批准（glmc202103366）。
22.大鼠进入动物房后，自由进食和饮水，并在每天固定时间进行5分钟的抚摸。此外，维持12l（6:00-18:00）/12d(18:00-6:00)的光照节律，室温（20
±
2）℃，相对湿度50%-60%的条件，以保持它们的安静，期间记录了大鼠的体重、活动情况和外貌特征变化。
23.预养一周后，对这些大鼠进行oft测试，记录每只大鼠的水平得分和垂直得分，并相加总得分。
24.选取评分相近的24只大鼠，利用随机数字表将它们随机分到正常组、gad组、高砷组和低砷组，每组6只大鼠，分笼喂养。
25.根据中国饮用水标准gb 5749-2022，饮用水中无机砷的限值为0.01mg/l（10ug/l），水中的naas02浓度超过标准限制值的10倍，则属于高砷饮水。我们将大鼠饮用的水中naas02的含量 100ug/l为高砷组，饮用水中naas02的含量为50ug /l为低砷组，正常组的大鼠自由饮用自来水。
26.此外参照林文娟等人使用不确定空瓶刺激方法，制备gad模型的实验组，具体方法如下：在模型建立前的前7天，对大鼠进行定时的喂水训练，每天的9:00-9:10和21:00-21:10分别给予大鼠10分钟的饮水时间，其余时间撤去水瓶不给水，使大鼠处于口渴的状态。从第8天开始到第21天，开始进行应激实验，在以上两个时间段内随机选择一个时间段进行空瓶刺激，而在另一个时间段内给予大鼠喝水。
27.对以上正常组、gad组、高砷组和低砷组的大鼠进行评估焦虑的实验测试，方法有两种，具体步骤如下：（1）、旷场实验，英文称open field test，缩写oft，这是一种广泛使用的焦虑障碍测试实验。
28.使用一款大小为100cm x 100cm x 50cm的木制敞箱，内部四周和底部均为黑色，其内部共有共25个格子。每次实验前，大鼠都放置在相同的位置。记录大鼠的水平运动次数，大鼠跨越的格子数，反映其运动活力；记录大鼠的垂直运动次数，大鼠站立的次数（两前肢离地1cm以上或攀附箱壁），反映其探索能力，观察大鼠是否害怕或不安来判断其焦虑状态。每次实验后利用酒精清理大鼠粪便并记录其状态，等待1-2分钟使味道散发后再进行下一次实验。每只大鼠的测试时间为5分钟。
29.观察指标包括：水平得分（hs，计分标准：三爪以上或身体1/2以上跨入邻格，爬越1次计1分）；垂直得分（vs，计分标准：后肢站立，两前肢离地1cm以上，站立1次计1分）；中央格子的停留次数和时间；有无修饰性行为（包括亲吻、清理、咬耳朵、搔痒等）、运动轨迹图；总路程。
30.（2）、高架十字迷宫实验，高架十字迷宫为一个包含两个开放臂（oa，50cm*10cm）、两个闭合臂（ca，50cm*10cm*15cm）和一个连接四个臂的中央平台（10cm*10cm）的结构。闭合臂周围有15cm高的挡板，开放臂和闭合臂相互垂直。在正式测试前，先用酒精喷雾和纸巾擦
拭迷宫内部，等待气味散发后再进行实验。实验开始时，将大鼠放置在迷宫入口，观察大鼠的行为和动作，通过分析大鼠的行为和动作来判断其焦虑状态。每次测试结束后，用酒精喷洒和纸巾清理大鼠的粪便，并记录粪便数量和状态，等待1-2分钟直至气味散去后再进行下一次实验。每次实验持续5分钟。
31.观察指标包括：进入闭合臂的次数（ce）；进入开放臂的次数（oe）；在闭合臂内停留的时间（ct）；在开放臂内停留的时间（ot）；中央平台的停留次数和时间；运动轨迹图；进入开放臂的次数（oe）占进入两个臂的总次数（te）的百分比和在开放臂内停留的时间（ot）占停留在两个臂内的总时间（tt）的百分比，用于评估大鼠的焦虑程度。
32.如图1中a所示，与正常组相比，gad模型组、高砷组以及低砷组大鼠均表现出焦虑样行为，其中大鼠移动总路程、跨格次数以及站立均显著次数减少（p ＜ 0.05），修饰次数显著增加（p ＜ 0.05），具体数据见下表：如图1a所示，高砷组、低砷组与gad模型组大鼠与正常组大鼠相比，他们的探索行为减弱，长时间蜷缩不动，更喜欢沿边缘行走。使用高架十字迷宫实验测试了各组大鼠的焦虑样行为。
33.如图1b中的痕迹所示，高砷组、低砷组与gad模型组大鼠与正常组大鼠相比，更愿意在闭臂中停留，在迷宫的开放臂中的活跃度明显降低。
34.图1中，a代表旷场测试检测大鼠焦虑水平，红色线框代表旷场箱的范围，绿色线框代表场箱中有25个小格，绿色轨迹线代表大鼠活动的轨迹路线；b代表高架十字迷宫实验检测大鼠探索行为，横向长方条代表闭臂，竖向代表开闭，紫色轨迹线代表大鼠的移动轨迹。
35.实施例二本实施例通过对phenopedia、ctdbbase、disgenet 数据库进行gad相关基因的收集与分析，以此确认砷诱发的gad与炎症反应与细胞焦亡的相关性。
36.在phenopedia、ctdbbase、disgenet三个数据库中，分别在线预测70、103和443个人群中gad相关基因，三者取并集获，获得560个调控gad的相关基因。
37.如图2中a所示，继续利用ctdbbase 数据库预测了4963个与无机砷中毒的相关基因，将gad相关的560个基因与无机砷的4963个基因取交集，获得181个共同作用的基因。
38.利用david在线网站，我们对这181个基因进行kegg和go富集分析，并使用bioinformatics（http://www.bioinformatics.com.cn/）在线工具对图片进行绘制。
39.go富集分析包括三个部分，生物过程（bp）富集到、细胞成分（cc）和分子功能（mf），
其中bp与cc都富集到181基因，而mf富集了178个基因，占比98.3%，每个部分挑选排名靠前的10个条目，如图2中c所示；生物过程（bp）主要参与inflammatory response、immune response、protein phosphorylation等生物过程；细胞成分（cc）主要是涉及了cytoplasm、nucleus、nucleoplasm及integral component of membrane等；分子功能（mf）主要涉及transcriptional activator activity、protein kinase activity、rna polymerase ii transcription factor activity, sequence-specific dna binding等功能。
40.kegg富集了146个基因，占比80.7%，如图2中b所示，结果显示了排名前30的信号通路，其主要参与tnf signaling pathway、pi3k-akt signaling pathway、mapk signaling pathway等信号通路，这些信号通路主要与炎症反应，转录因子的激活密切相关。
41.结合生物信息学的提示，我们利用不同浓度的naaso2（0、2、4、6、8μm）刺激sknsh神经细胞，24h后通过qpcr实验检测细胞中与炎症相关基因（如nlrp3及il-1β）的mrna表达水平，如图2中d所示，0μm组相比，2、4、6、8μm的naaso2刺激均能上调sknsh神经细胞中nlrp3及il-1β的mrna的表达水平。
42.nlrp3与il1β公认的作为在细胞焦亡过程中起着重要的作用的一类物质，nlrp3能够组装成炎性小体，激活caspase-1酶从而促进il-1β和il-18等炎性细胞因子的成熟和分泌导致细胞焦亡的发生。nlrp3与il1β的激活提示饮水型砷暴露诱发gad与细胞焦亡密切相关。
43.图2中，a. gad与无机砷中毒相关基因交集获得181个共同作用基因；b. kegg通路预测，结果显示靶基因富集的前 30个 kegg 信号通路情况；c. go富集预测，包括三个部分：生物过程（bp）、细胞成分（cc）和分子功能（mf），各部分10条目；d. qpcr检测naaso2刺激sknsh神经细胞nlrp3与il-1βmrna水平。*p《0.05 **p《0.01 ***p《0.005代表与 0μm组对比。
44.实施例三本实施例为研究饮水中砷对大鼠前额页皮质中相关蛋白的表达水平的影响。
45.使用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉、腹主动脉采血后脱颈处死，并在冰上迅速取出大脑组织。用1
×
pbs清洗掉血液，并选取三个全脑组织用福尔马林固定，以便进行石蜡切片。除此之外，还单独解剖出前额叶皮质组织，将它们放置于ep管中，液氮速冻；取0.2g动物组织，加入100μl ripa 细胞裂解液和 1μl 100
×
蛋白酶抑制剂，充分振荡混匀，冰上静置5min。将混合液在低温环境下使用超声细胞破碎仪以50hz强度、50%工作-间歇时间（超声10s，间歇10s）的条件超声破碎细胞3次，离心上清液于4℃ 12000
×
g离心5min。重复上述超声操作，再次离心上清液于4℃ 12000
×
g离心15min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，标记为蛋白悬液。蛋白悬液可以短期储存于-20℃，也可以长期储存于-80℃；蛋白标品配置：采用碧云天公司 bca 蛋白浓度试剂盒检测各组样本的总蛋白浓度。按照说明书提供的表 10 使用 bsa 溶液（浓度，2mg/ml；试剂盒提供）和去离子水配置标准品 a-i。
46.蛋白质浓度的测定方法如下：（1）取4μl待测蛋白悬液和8μl高压去离子水混合，制成蛋白稀释液（3倍稀释）；（2）按照50：1的比例混合试剂盒中的a、b液，在每个反应孔中加入100μl工作液和5μl蛋白稀释液/标准品a-i（工作液：蛋白液=20：1），并设置一个只加工作液的调零孔；（3）在恒温摇床上以37℃速度避光孵育30分钟后，使用酶标仪测定每个孔在572nm的光密度值，并记录；（4）使用调零孔的光密度值校正工作液干扰，将所有空的光密度值调零；（5）绘制标准品a-i的浓度-光密度值关系曲线，求出光密度值和浓度的导数式od值=a
·
浓度-b（其中a、b为常数）；（6）将待测蛋白悬液的光密度值代入导数式中，将结果乘以3，即可得到蛋白质悬液的浓度；sds-page制备方法如下：首先用去离子水清洗所需使用的薄板和厚板，并晾干。然后将它们安装到制胶装置中夹紧，以防止漏胶，并放置在水平表面上。接着按照表11的配置，配制所需的不同浓度的分离胶，并缓缓加入到薄厚板之间的空隙中。在这个过程中，需要注意避免产生气泡，并将分离胶的高度设置为距板沿4-4.5cm。剩下的空间可以用去离子水封闭。然后在室温下静置15分钟，待分离胶凝固后，移除封闭的去离子水，并用滤纸吸干。接下来，根据表9的配置，配制5%浓缩胶，在分离胶上缓缓注入并使其高度与入口平齐，然后快速插入梳子。再在室温下静置15分钟，最后取下玻璃板，用水洗净外表面，sds-page制备完成。制备好的样品可使用去离子水在4℃下储存7天；选取大鼠的前额叶皮质，通过western blot实验检测组织中焦亡相关蛋白的表达水平，结果如图3所示，与正常组动物相比，高砷组、低砷组与gad模型组大鼠焦亡相关的蛋白包括nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd、il-1β与il-18均表达上调。
47.我们在go分析中，如图2中c发现转录因子的激活在饮水型砷暴露诱发gad起着重要作用。此外，我们还检测大鼠前额叶皮质中nf-κb信号分子的蛋白表达情况，正常组大鼠相比，高砷组、低砷组与gad模型组大鼠nf-κb蛋白表达上调。
48.图3中，a：westren blot 检测nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd 、il-1β与il-18和nf-κb蛋白表达水平；b：westren blot 检测蛋白表达统计图。*p《0.05 **p《0.01 ***p《0.005代表与 control组对比。
49.实施例四本实施例为研究饮水中砷对sknsh神经细胞中相关蛋白的表达水平的影响，进行了细胞水平的验证。
50.sknsh神经细胞作为常见的神经细胞模型，因其具有特殊的生物学特性，因此这种细胞系在神经系统相关的疾病的研究中被广泛应用。
51.在本次研究中，利用不同浓度的naaso2（0、2、4、6、8μm）刺激sknsh神经细胞，24h后收集细胞上清，利用泉州市睿信生物公司人白细胞介素1β（il-1β）elisa试剂盒检测细胞上清中il-1β蛋白的分泌情况。
52.通过western blot实验我们发现，如图4中a所示，与0μm组相比，不同浓度的naaso2均能上调sknsh神经细胞中焦亡相蛋白包括nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd 、il-1β与il-18。
53.此外，由于细胞在焦亡时会分泌大量的炎性因子，通过elisa检测细胞上清中il-1β，如图4中b所示，结果与0μm组相比，不同浓度的naaso2均能上调细胞上清中il-1β蛋白水平；检测sknsh神经细胞中nf-κb信号分子的蛋白表达情况，结果与动物实验中保持一致。
54.如图4a所示，naaso2浓度超过4μm后，细胞数量显著减少，因此选择4μm作为本次研究最适浓度，本实施例进一步验证了饮水型砷暴露能通过激活神经细胞中nf-κb信号分子调控神经细胞焦亡途径导致gad的发生。
55.图4中，a：westren blot 检测细胞中nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd 、il-1β与il-18和nf-κb蛋白表达水平；b：westren blot 检测蛋白表达统计图；*p《0.05 **p《0.01 ***p《0.005代表与 0μm组对比。
56.实施例五本实施例为验证饮水中砷对于mir-425-3p表达的影响。
57.real-time pcr 引物的设计：使用ncbi网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索大鼠il-1β、nlrp3和gadph（参考基因）的mrna序列，并使用primer 5.0软件设计引物，上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体引物信息详见下表。
58.mirna real-time pcr 引物的设计：mir-425-3p、u6（参考基因）的引物由genepharma公司设计合成，引物序列详见表2。
59.引物序列
使用takara生物技术有限公司的primescript
™ꢀ
rt with gdna eraser (perfect real time) 试剂盒利用茎环法逆转录mirna。使用powerup
™ꢀ
sybr
™ꢀ
green 预试剂盒进行实时荧光定量pcr（rt-pcr）具体步骤如下：去除dna反应步骤冰上制备反应体系，按照下表的配置比例配置所需的反应体系表6茎环法反应体系（冰上配制）42℃ 2 min（或者室温 5 min*2）反应完成后置于冰上备用或-80℃保存。
60.逆转录反应1）冰上制备反应体系，按照下表的配置比例配置所需的反应体系表7 茎环产物逆转录反应体系（冰上配制）
混合上述反应体系，37℃反应15min，然后于85℃孵育5s;反应完成后所得cdna置于冰上备用或-80℃保存。
61.qpcr反应表8 qrt-pcr反应体系使用下表三步法pcr反应程序进行扩增。
62.表9两步法pcr扩增程序
数据统计和计算：使用2
△△
ct方法计算mrna和mirna的相对表达量。具体步骤如下：(1)
ꢀ△
ct=ct目的基因-ct内参基因；(2)
ꢀ△△
ct=
△
ct实验组
‑△
ct对照组；(3) 相对表达水平=2
△△
ct。
63.我们利用浓度为4μm的naaso2刺激sknsh神经细胞，同时构建过表达mir-425-3p的模拟物（mimic）及乱序mirna（nc）为对照，使用lp3000转染试剂，将其转染至sknsh神经细胞中。24小时后，通过qpcr检测mir-425-3p的表达情况。
64.通过对饮水型砷暴露大鼠进行血浆外泌mirna测序获得了一批差异表达的mirnas（如图5a）。结合相关文献我们发现mir-425-3p、mir-200c-3p、mir-141-3p、mir-425-5p及mir-503-3p这5类mirnas与炎症相关但在gad中鲜有报道。
65.对此，我们首先在大鼠前额叶皮质组织对这5个mirna进行qpcr检测，结果检测到了三个差异表达的mirnas；相较于正常组大鼠，高砷组、低砷组与gad模型组大鼠mir-425-3p表达均下调；mir-141-3p，gad与高砷组大鼠表达显著升高，而低砷组表达无统计学差异；对于mir-425-5p，gad与高砷组大鼠表达无统计学差异，而低砷组表达显著降低；至于mir-200c-3p和mir-503-3p我们均没有检测出表达差异（如图5c）。在细胞层面，我们同样利用0、2、4、6、8μm浓度的naaso2刺激sknsh神经细胞，24h后通过qpcr检测，我们发现无机砷均能不同程度下调mir-425-3p、mir-200c-3p、mir-141-3p以及mir-503-3p的表达，但对mir-425-5p无作用（如图5b）。结合体内动物实验与体外细胞实验研究我们确定mir-425-3p对naaso2刺激下调最为敏感。
66.图5中，a:饮水型砷暴露大鼠血浆外泌体测序差异mirnas表达热图，b 大鼠前额叶组织中通过qpcr对差异表达mirnas进行验证；c：sknsh细胞中通过qpcr实验对差异表达mirnas进行验证；*p《0.05 **p《0.01 ***p《0.005代表与 0μm/contral组对比。
67.实施例六本实施例为验证nfkb1与mir-425-3p靶向结合的情况。
68.利用rnahybrid 在线网站分析大鼠和人mir-425-3p 与 nfkb1 3'utr 结合自由能情况，如图6中a所示，两者结合自由能较低。
69.图6中a:利用rnahybird在线网站分析人及大鼠nfkb1 3' utr与mir-425-3p结合自由能情况；c：人源与鼠源的mir-425-3p序列对比；b: miranda microrna 靶标预测网站显示mir-425-3p与nfkb1基因靶向结合情况；d：双荧光报告基因显示mir-425-3p与nfkb1基因靶向结合；***p《0.001
利用miranda microrna 靶标预测网站（www.bioinformatics.com.cn/local_miranda_mirna_target_prediction_120）对mir-425-3p 与nfkb1基因的结合位点进行预测，如图6中b结果显示mir-425-3p与nfkb1可能存在靶向结合， mir-425-3p 与nfkb1可能存在生理学作用。
70.通过荧光素酶报告基因实验验证mir-425-3p与nfkb1 3'utr的结合：针对nfkb13'utr上潜在的mir-99b-3p结合位点，构建人pgl3
‑ꢀ
nfkb1
ꢀ‑
3'utr野生型(nfkb1 3’utr)及突变型(nfkb1 3’utr-mut)荧光素酶报告基因质粒和mir-425-3p mimic以及nc mimic，共转染到hek293t细胞中，48小时后进行双荧光素酶活性检测，明确mir-425-3p对nfkb1的靶向调控。
71.为了验证mir-425-3p 与nfkb1之间的靶向结合，通过双荧光素报告基因实验进行验证，荧光素酶活性检测结果显示，与转染mimic nc组相比，转染mir-425-3p mimic后nfkb1基因荧光素酶活表达水平显著下调。
72.为了排除内外因素的影响的干扰，对nfkb1进行基因突变，突变后的nfkb1不受mir-425-3p mimic调控，结果如图6中c所示表明nfkb1受到mir-425-3p的调控。
73.由于体内研究我们选取的是wistar大鼠，体外研究选取的是sknsh神经细胞，为了排除物种之间差异造成的影响，通过人与大鼠mir-425-3p的同源性比较我们发现两者序列长度，核苷酸组成基本一致，特别是mirnas功能区—seed区，两者序列相同。
74.实施例七本实施例为明确mir-425-3p的功能进行的逆转naaso2对细胞的损害验证。
75.构建过表达mir-425-3p mimic与nc，将其转染至sknsh神经细胞中，通过qpcr检测各组mir-425-3p的表达情况，结果如图7中a显示，即使在naaso2刺激下，转染mir-425-3p mimic仍能显著上调细胞中mir-425-3p表达。
76.其次通过western blot实验检测转染mir-425-3p mimic能否逆转naaso2对细胞产生的损伤。
77.如图7中b和c所示，与as+nc组相比， as+mimic组的nf-κb、nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd、il-1β与il-18蛋白表达下调，因此通过调节mir-425-3p的表达能够抑制nf-κb蛋白分子，以此对gad疾病进行控制及治疗。
78.图7中，将构建的过表达mir-425-3p mimic转染至sknsh细胞中，qpcr检测各组mir-425-3p的表达情况；b:westren blot 检测nlrp3、cleaved-caspase-1、gsdmd 、il-1β与il-18和nf-κb蛋白表达水平； c：westren blot 检测蛋白表达统计图；（*，*p《0.05 **p《0.01 ***p《0.005代表与 control组对比；# p《0.05代表与 as+nc组对比。
79.分析通过实施例一至实施例七可知，无机砷暴露能下调mir-425-3p的表达，从而靶向调控nf-κb信号分子的激活，进而激活nlrp3/caspase-1/gsdmd，介导il-1β与il-18的释放，导致gad的发生，具体过程如图8所示。
80.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.mir-425-3p在制备治疗焦虑症的药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述焦虑症为广泛性焦虑障碍。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，其中所述焦虑症为无机砷上调焦亡相关蛋白导致的广泛性焦虑障碍。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述焦亡相关蛋白为nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β和il-18。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述nf-κb、nlrp3、caspase-1、gsdmd、il-1β和il-18能够引起细胞焦亡。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞为神经元细胞。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述焦虑症为无机砷抑制mir-425-3p表达导致的广泛性焦虑障碍。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述mir-425-3p能够与nfkb1基因存在靶向结合。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述mir-425-3p能够逆转所述细胞焦亡。

技术总结
本发明提供一种无机砷在诱导SKNSH细胞焦亡中的应用，属于神经疾病技术领域，本发明在针对miR-425-3p的研究中首次发现miR-425-3p在广泛性焦虑（GAD）发挥重要作用，miR-425-3p通过靶向调节NFKB蛋白从而激活神经细胞焦亡，从而导致广泛性焦虑（GAD）的发生，首次在广泛性焦虑（GAD）大鼠中发现了神经细胞细胞焦亡。性焦虑（GAD）大鼠中发现了神经细胞细胞焦亡。性焦虑（GAD）大鼠中发现了神经细胞细胞焦亡。


技术研发人员：王娜 雷炜星 张磊 崔钧贺 郭林楠 侯媛媛 高东
受保护的技术使用者：桂林医学院
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/11