猪胴体性状的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用

1.本技术涉及猪胴体性状技术领域，具体涉及猪胴体性状的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。


背景技术：

2.猪胴体性状的主要指标包括猪眼肌面积、背膘厚以及瘦肉率，这些指标也是决定养猪业经济效益的重要因素。一般而言，猪背膘厚与瘦肉率之间呈很强的负相关，眼肌面积与瘦肉率呈中高等的显著正相关。而瘦肉率的计算需要将猪屠宰后进行测定，无法活体测定，测量复杂且成本较高，一般不适合作为常规育种的选留指标。在猪的生产和选育中，用容易测量的背膘厚和眼肌面积作为瘦肉率的评定指标具有重要意义。常规的育种方法，周期长，制约了优质猪选育效率。随着分子生物学技术的发展，采用分子辅助标记选择与常规育种相结合的方法大大加速了猪育种的进程，缩短了育种年限。用于辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)标记等。snp标记是指基因组上单个核苷酸变异引起的dna序列的多态性，它具有数量多、准确性高、多态性高等特点，在育种实践中可以利用snp对某些优良基因进行定位，并结合表型确定标记与特定性状之间的关联性，还可以将分子标记在群体中进行验证并应用在分子育种上。


技术实现要素：

3.成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor 10，fgf10)属于成纤维细胞生长因子家族成员，是由84-246个氨基酸组成的碱性蛋白。研究表明，fgf10基因通过激活fgfr1和fgfr2来调控细胞增殖与分化，fgf10在胚胎的上皮细胞、间质细胞以及成纤维细胞中表达，参与调控动物肺脏和四肢的发育过程。而有关fgf10基因对猪胴体性状的影响还未见报道。
4.本技术发明人对背膘厚高、低组硒都黑猪背最长肌组织进行转录组测序，发现fgf10基因差异表达，说明其可以作为影响猪肉质性状的候选基因。本技术发明人扩增了猪fgf10基因的部分核苷酸序列，筛选出snps并与猪胴体性状进行关联分析，获得了与猪眼肌面积、背膘厚和瘦肉率性状相关的新的分子标记。
5.为此，本技术实施例至少公开了以下技术方案：
6.(1)：猪胴体性状的分子标记，包括猪fgf10基因第一内含子g.28770933处发生单核苷酸突变a》g形成的核苷酸序列。
7.(2)：猪胴体性状的分子标记引物，包括如seq id no.3所示的dna分子和如seq id no.4所示的dna分子。
8.(3)：一种核酸分子，由(2)所述的分子标记引物经pcr扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述猪胴体性状关联。
9.(4)：一种试剂盒，包括(2)所述的分子标记引物以及其他pcr扩增所需试剂。
10.(5)：猪胴体性状的检测方法，包括：
11.获取待测猪基因组dna；
12.通过(2)所述的分子标记引物进行pcr扩增；
13.根据扩增产物的核苷酸序列检测猪fgf10基因第一内含子g.28770933处的基因型；
14.根据所述基因型确定所述猪胴体性状。
15.(6)：猪的筛选方法，包括(5)所述的检测方法。
16.(7)：(1)所述的分子标记、(2)所述的分子标记引物、(3)所述的核酸分子或(4)所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：
17.1)所述胴体性状的检测与分析，所述胴体性状选自眼肌面积、背膘厚和瘦肉率中的至少一种；
18.2)猪的筛选与育种。
19.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
20.本技术实施例以硒都黑猪基因组dna混合池为模板进行pcr扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，并与大白母猪繁殖性能进行关联分析，发现猪fgf10基因第一内含子g.28770933处存在单核苷酸突变a》g，通过对该单核苷酸多态性位点的基因型频率和等位基因频率进行分析，发现其与猪眼肌面积、背膘厚和瘦肉率相关联，可为硒都黑猪的分子标记辅助选育提供帮助。
附图说明
21.图1为本技术实施例提供的猪fgf10基因第一内含子的pcr扩增结果，m为dl 2000maker，泳道1-5为pcr产物。
22.图2为本技术实施例提供的猪fgf10基因第一内含子如seq id no.1和seq id no.2第346bp碱基处基因型的测序结果。
具体实施方式
23.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
24.需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
25.为了更好地理解本技术而不是限制本技术的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，
除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
26.为研究猪胴体性状的关联的分子标记，本技术实施例对背膘厚高、低组硒都黑猪背最长肌组织进行转录组测序，发现fgf10差异表达，通过扩增猪fgf10基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与猪胴体性状的关联分析，发现猪fgf10基因第一内含子g.28770933处存在单核苷酸突变a》g，通过对该单核苷酸多态性位点的基因型频率和等位基因频率进行分析，发现其与猪眼肌面积、背膘厚和瘦肉率性状相关联。
27.为此，本技术实施例提供了猪胴体性状的分子标记，包括猪fgf10基因第一内含子g.28770933处发生单核苷酸突变a》g形成的核苷酸序列。其中，猪fgf10基因参考genbank数据库中猪fgf10基因(登录号：nc_010458.4)。
28.在一些实施例中，所述胴体性状选自眼肌面积、背膘厚和瘦肉率中的至少一种。
29.在一些实施例中，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体眼肌高显著高于ag基因型个体和gg基因型个体。
30.在一些实施例中，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体平均背膘厚显著低于ag基因型个体和gg基因型个体。
31.在一些实施例中，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体瘦肉率显著高于ag基因型个体和gg基因型个体。
32.基于此，根据猪fgf10基因第一内含子g.28770933处的基因型，可以对猪个体的猪胴体性状进行遗传标记，以利于选育高眼肌面积、高瘦肉率和/或低背膘厚性状的品种。
33.在一些实施例中，所述分子标记如seq id no.1和/或seq id no.2所示。通过确定如seq id no.1和/或seq id no.2所示的核苷酸序列，即可确定猪fgf10基因第一内含子g.28770933处的基因型。
34.由此，参考genbank数据库中猪fgf10基因的dna序列第一内含子设计特异引物(该引物的序列如序列表seq id no.3和seq id no.4所示)，以硒都黑猪基因组dna混合池为模板进行pcr扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，得到如序列表seq id no.1和seq id no.2所示的基因片段。由此，本技术实施例还公开了一种猪胴体性状的分子标记引物，包括如seq id no.3所示的dna分子和如seq id no.4所示的dna分子。其中，“分子标记引物”是用来扩增包含猪胴体性状联锁的分子标记，例如snps的核苷酸序列，以分析该分子标记的基因型，从而得知猪胴体性状。
35.基于此，本技术实施例还公开了一种核酸分子，由所述的分子标记引物经pcr扩增而成，所述核酸分子的基因型与猪胴体性状关联。
36.基于此，本技术实施例还公开了一种试剂盒，包括所述的分子标记引物以及其他pcr扩增所需试剂。
37.基于此，本技术实施例还公开了一种猪胴体性状的检测方法，包括：获取待测猪基因组dna；通过所述的分子标记引物进行pcr扩增；根据扩增产物的核苷酸序列检测猪fgf10基因第一内含子g.28770933处的基因型；根据所述基因型确定所述胴体性状。例如，根据该基因型确定猪眼肌面积，或者确定猪背膘厚，或者确定猪瘦肉率。
38.基于此，本技术实施例还公开了一种猪的筛选方法，包括所述的检测方法。例如，根据上述检测方法，确定了猪眼肌面积、或者确定猪背膘厚、或者确定猪瘦肉率，进而对猪品种进行筛选，以获得优良猪品种。
39.基于此，本技术实施例还公开了所述的分子标记、所述的分子标记引物、所述的核酸分子或所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：
40.1)所述胴体性状的检测与分析，所述胴体性状选自眼肌面积、背膘厚和瘦肉率中的至少一种；
41.2)猪的筛选与育种。
42.现结合具体实例对本技术做进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本技术，但不构成对本技术的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
43.一、猪基因组dna的提取
44.实施例采用试验猪品种为硒都黑猪，猪基因组dna的提取采用北京擎科生物科技有限公司生产的基因组dna试剂盒(按照试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
45.(1)将采取猪耳缘组织，用无菌手术剪刀剪碎、研磨充分，置于2ml离心管中，然后加入200μl buffer ga，涡旋混匀。
46.(2)加入20μl proteinase k，混匀后，56℃水浴至组织酶解到无颗粒感。
47.(3)加入200μl buffer gb于消化液中，涡旋混匀，然后56℃水浴10min。
48.(4)加入200μl无水乙醇至消化液中，涡旋混匀。
49.(5)吸附柱置于收集管中，然后将上一步所得混合液转移至吸附柱中12000r/min离心1min。
50.(6)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl buffer wb1于吸附柱中，12000r/min离心30sec。
51.(7)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl buffer wb2于吸附柱中，
52.12000r/min离心30sec。
53.(8)重复步骤(7)。
54.(9)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，12000r/min空管离心2min，将吸附柱置于室温放置几分钟，彻底晾干残留的漂洗液。
55.(10)将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入50-100μl tebuffer(提前在65℃中水浴加热)，室温放置5min，12000r/min离心2min，收集dna溶液(洗脱体积应不少于50μl，体积过少会影响洗脱效率，为得到更多的dna，可将得到的dna溶液重新加入吸附柱中进行二次洗脱)。
56.(11)测dna浓度后保存于4℃，长期保存须放置于-20℃。
57.二、猪fgf10目的片段序列的获取
58.1、pcr扩增
59.根据fgf10基因的基因组序列(genbank登录号：nc_010458.4)设计以下引物对：
60.正向引物：5’ttgagcctgaaatgtctgt 3’，seq id no.3
61.反向引物：5’atgggaatctactttgagtgtcg 3’，seq id no.4
62.利用上述引物在硒都黑猪基因组dna中进行pcr扩增，pcr反应体系为30μl，体系中各组分的浓度为100ng模板dna，2
×
pcr mix 15μl、上述正反向引物各0.5μm，pcr的运行程序如下：预变性98℃，45sec，然后变性95℃，15sec，退火55℃，30sec，延伸72℃，20sec，35个循环；终延伸72℃，60sec。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，所得pcr产物的长度为869bp。
63.2、pcr产物纯化
64.上述pcr产物用gel extraction kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：
65.(1)在紫外灯下尽可能快速切下目的片段，并将含目的片段的凝胶转移至1.5ml离心管中。
66.(2)加入等体积的binding buffer(xp2)，在65℃水浴至凝胶完全融化，并振荡混匀。
67.(3)取干净2ml收集管并放置hibind dna mini柱子，将上一步获得的混合液转移至柱子中，室温下10000r/min离心1min，弃收集管中滤液，(如果混合液的体积超过700μl，一次只能转移700μl至柱子中，余下的继续重复该步骤)将柱子套回2ml收集管内。
68.(4)转移700μl spw wash buffer至柱子中，室温下10000r/min离心1min(浓缩的spw wash buffer在使用之前必须按照标签提示用无水乙醇稀释，如果dna洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中，须将其拿出置于室温下)。
69.(5)重复步骤(4)。
70.(6)弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集，室温下13000r/min离心2min甩干柱子基质中剩下的液体。
71.(7)重新取一个干净的1.5ml离心管，将柱子放在离心管上，加入15-30μl(具体取决于预期的终产物浓度)的elution buffer(提前在65℃水浴锅中预热)到柱子上。
72.(8)室温下静置2min。
73.(9)12000r/min离心1min以洗脱dna。
74.(10)测定dna浓度后，于-20℃中保存。
75.3、基因型分析
76.将上述获得的pcr产物直接送到奥科鼎盛公司进行测序，所得产物序列如seq id no.1或seq id no.2所示(no.1或no.2的第346bp处为snp位点)，直接从测序图谱上进行基因型分析，结果如图2和表1所示。
77.如表1所示，在硒都黑猪品种中，fgf10基因g.28770933a》g位点表现为aa、ag、gg三种基因型，基因型频率分别为0.24、0.49、0.27，g等位基因的和a等位基因的频率分别为0.51和0.49，g等位基因属于优势等位基因。
78.表1硒都黑猪fgf10基因g28770933a》g位点基因型频率和等位基因频率
79.基因snp位点基因型个体数基因型频率等位基因等位基因频率
ꢀꢀ
aa800.24a0.49fgf10g.28770933a》gag1660.49g0.51
ꢀꢀ
gg900.27
ꢀꢀ
80.三、本发明分子标记与猪胴体性状的关联分析及应用
81.用于关联分析的实验猪群为336头硒都黑猪，采用上述实验例所建立的pcr产物直接测序法进行多态性检测，用sas统计软件中的glm程序进行方差分析，分析猪fgf10基因三种不同基因型与猪胴体和肉质性状的关联，利用reg程序计算基因的加性效应和显性效应，并且进行差异性检验。所采用的模型为：y
ijklmn
＝μ+ai+bj+ck+d
l
+xm+e
ijklmn
，其中y为性状表型值，μ为群体均值，ai为基因型效应，bj为年效应，ck为年度效应，d
l
为家系效应，xm为协变量，e
ijklmn
为残差。
82.关联分析结果如表2所示，在硒都黑猪群体中，g.28770933a》g位点显著影响眼肌面积、平均背膘厚和瘦肉率等胴体性状(p《0.05)。携带aa基因型个体的眼肌面积和瘦肉率显著高于ag和gg基因型个体(p《0.05)，且aa基因型个体的平均背膘厚显著低于ag和gg基因型个体(p《0.05)，在育种中应优先选留携带aa基因型的个体，有利于提高群体的瘦肉率。
83.表2为该多态位点与硒都黑猪眼肌面积和平均背膘厚关联分析统计表
[0084][0085]
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，相同或者无字母表示差异不显著。μ：均值。se：标准误差。
[0086]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.猪胴体性状的分子标记，包括猪fgf10基因第一内含子g.28770933处发生单核苷酸突变a>g形成的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的分子标记，所述胴体性状选自眼肌面积、背膘厚和瘦肉率中的至少一种。3.根据权利要求1所述的分子标记，可选地，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体眼肌面积显著高于ag基因型个体和gg基因型个体；可选地，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体平均背膘厚显著低于ag基因型个体和gg基因型个体；可选地，猪fgf10基因第一内含子g.28770933处，aa基因型个体瘦肉率显著高于ag基因型个体和gg基因型个体。4.猪胴体性状的分子标记引物，包括如seq id no.3所示的dna分子和如seq id no.4所示的dna分子。5.一种核酸分子，由如权利要求4所述的分子标记引物经pcr扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述猪胴体性状关联。6.根据权利要求5所述的核酸分子，所述分子标记如seq id no.1和/或seq id no.2所示。7.一种试剂盒，包括如权利要求4所述的分子标记引物以及其他pcr扩增所需试剂。8.猪胴体性状的检测方法，包括：获取待测猪基因组dna；通过如权利要求4所述的分子标记引物进行pcr扩增；根据扩增产物的核苷酸序列检测猪fgf10基因第一内含子g.28770933处的基因型；根据所述基因型确定所述胴体性状。9.猪的筛选方法，包括如权利要求8所述的检测方法。10.权利要求1～4任一所述的分子标记、权利要求5所述的分子标记引物、权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：1)所述胴体性状的检测与分析，所述胴体性状选自眼肌面积、背膘厚和瘦肉率中的至少一种；2)猪的筛选与育种。

技术总结
本申请涉及猪胴体性状技术领域，具体涉及猪胴体性状的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。该猪胴体性状的分子标记，包括猪FGF10基因第一内含子g.28770933处发生单核苷酸突变A>G形成的核苷酸序列。该分子标记的AA基因型个体眼肌面积高于其他基因型，背膘厚低于其他基因型。选育AA基因型个体，有利于提高瘦肉率，降低背膘厚。背膘厚。背膘厚。


技术研发人员：乔木 武华玉 牛韶华 彭先文 梅书棋 吴俊静 周佳伟 张宇 徐忠 李梓芃 冯越 孙华 宋忠旭 赵海忠 李良华
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/11