体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶、包含该重组微纤溶酶的药物组合物以及包括施用该重组微纤溶酶的治疗血栓栓塞相关疾病的方法与流程

体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶、包含该重组微纤溶酶的药物组合物以及包括施用该重组微纤溶酶的治疗血栓栓塞相关疾病的方法
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技术领域
1.本技术涉及重组蛋白质和溶栓治疗剂的技术领域，该重组蛋白质和溶栓治疗剂用于治疗心血管系统疾病和其他凝血导致的疾病。


背景技术：

2.如今发生致病性血栓栓塞和凝血-止血平衡紊乱引发的血栓性疾病导致的死亡占全球总死亡的51％，远超过癌症甚至新冠病毒全球流行导致的死亡。血液循环系统中复杂的纤溶网络包括纤溶酶原(plg)/纤溶酶(plm)、尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)/组织型纤溶酶原激活物(tpa)和诸如与tpa和upa结合并抑制tpa和upa的plg激活物抑制剂(pai)、与plm结合并抑制plm的α2-抗纤维蛋白溶酶(α2-ap)的抑制剂。在体内，致病性血栓被纤溶酶溶解为可溶性成分，该纤溶酶是源自纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶。plg与纤维蛋白和纤维蛋白原二者结合，由此并入其形成的血栓中。尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物都是将plg转化为plm的精巧而特定的丝氨酸蛋白酶。纤溶系统的激活可通过三种途径进行，即内部激活途径、外部激活途径和外源性激活途径。外源性激活途径主要通过内源凝血系统的相关因素启动并且它是继发性纤维蛋白溶解的理论基础。外部激活途径主要是通过组织型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物将纤溶酶原转化成纤溶酶的过程。同时，tpa和upa被纤溶酶原激活物抑制剂(pai-1/2/3)抑制，通过激活和抑制调节纤溶活性。该途径是原发性纤维蛋白溶解的理论基础。外源性激活途径主要通过将诸如链激酶、尿激酶和重组tpa的纤溶激活物注射到身体以激活纤溶系统从而实现血栓溶解的目标。该途径是血栓溶解治疗剂的理论基础。虽然有许多理论发展，即基于内部激活途径的针对plg激活和plm活性的调节以及当前基于外部激活途径使用诸如tpa的纤溶酶原激活物药物作为一线治疗，但是使用诸如基于plm的直接溶栓药物的外源溶栓药物的治疗并不成功。
3.纤溶酶原激活物(pa)是血栓溶解治疗剂的主要制剂，但其所导致的出血副作用是固有的并且还没有解决办法。除了基因缺陷，pa治疗期间的plg耗竭也是严重的医学问题，可降低或终止治疗疗效。不幸地是，当前没有用于诸如缺血性脑卒中、心肌梗死、外周动脉血栓、深静脉血栓形成的疾病和血栓栓塞导致的其他疾病的pa治疗的、fda批准的替换药
物。例如，在使用高剂量的tpa、upa或链激酶(sk)的血栓溶解治疗剂期间，普遍存在终止溶栓药物的效能的plg耗竭。另一方面，动物模型已经显示施用plg可恢复溶栓潜力。另外，几种临床病情已经显示出会降低plg或plm水平，这些病情包括散播性血管内凝血、脓毒症、白血病、透明膜病、肝病、肺纤维化、阿尔茨海默病等。
4.结果是，具有基于plg和plm所设计的蛋白质补充疗法治疗剂可以推进许多医疗领域中的治疗。plm和μplm不会导致所施用的剂量下远离灌注位点的额外血栓止血稳定栓子的出血。但是，tpa确实会导致额外血栓栓子位点下所有浓度的出血。另外，已经显示出缺少plm的环饼结构域由此不具有额外的纤维蛋白结合特异性的μplm与相似药理剂量的plm一样有效。但是，如上所述，在血清中，plm的活性立即被其主要抑制剂，即α2-抗纤维蛋白溶酶中和。因此，基于plm的直接溶栓治疗剂的应用的主要障碍之一是因α2-ap抑制导致的疗效降低，第二个障碍是本发明所发现的，由于体内半衰期长所导致的溶血副作用。所以，为了研发基于plm的治疗剂，期望设计出新的策略以避免或克服α2-ap的抑制，同时能有效溶解致病的血栓，并在达到治疗作用后迅速失去活性，从而避免出血副作用。


技术实现要素：

5.本公开提供体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中重组微纤溶酶在细菌宿主内表达、纯化，或在表达为不溶性包涵体的情况下可以复性和纯化，从而生成活性溶栓试剂。
6.在一些实施例中，重组微纤溶酶的体内半衰期是约2.75分钟至约28.5分钟。
7.在一些实施例中，体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶包括野生型、gly739al、arg582al、met585ala、lys607ala、phe587ala、ser608ala、arg610ala、glu641ala和pro642ala。
8.在一些实施例中，重组微纤溶酶包括野生型和突变型。
9.在一些实施例中，重组微纤溶酶包括人类和小鼠微纤溶酶。
10.在一些实施例中，重组微纤溶酶由大肠杆菌表达系统表达和纯化。
11.在一些实施例中，重组微纤溶酶在大肠杆菌中表达成不可溶的包涵体，并将包涵体复性和纯化。
12.在一些实施例中，重组微纤溶酶被选择为对切割和脱毒致病性多肽或不溶性纤维蛋白具有生物活性并且也抵抗α2-抗纤维蛋白溶酶抑制。
13.在其他方面，本公开提供药物组合物，其包含上述重组微纤溶酶作为溶栓试剂，或其药学上可接受的剂型，或化合物或剂型的药学上可接受的溶剂化物，并且包括药学上可接受的赋形剂。
14.在一些实施例中，大肠杆菌表达的不溶性重组微纤溶酶被复性和纯化为激活型以用于溶栓应用。
15.在另外的方面，本公开提供治疗血栓栓塞导致的相关疾病的方法，该血栓栓塞导致的相关疾病包括缺血性脑卒中、心肌梗死、深静脉血栓栓塞、外周动脉栓塞、肺栓塞和诸如sars-cov2感染和败血症的各种疾病导致的系统性血栓形成，其中该方法包括向遭受这些疾病的患者施用治疗有效剂量的上述药物组合物，或其药学上可接受的剂型，或所述化合物或剂型的药学上可接受的溶剂化物。
16.在一些实施例中，药物组合物可以静脉给药、通过导管的动脉或静脉靶向给药、皮下、肌肉下和气溶胶途径给药等。定义
17.本文使用的术语“体内半衰期”意为血液中药物有效浓度或体内药物总量减少到其初始一半所用的时间。体内半衰期(示出为t
1/2
)的计算公式是：t
1/2
＝0.693/k，其中k是消除速率常数。只要药物的k值计算出，药物的体内半衰期就能根据上述公式计算出。例如，如果给药2小时后药物的血液浓度是25％并且给药5小时后血液浓度是19％，则该药物的消除速率常数，即k＝(inco-inc)/t＝(in25-in19)/(5-2)＝0.091小时。该药物半衰期，即t
1/2
＝0.693/k＝7.6小时。
18.在本公开中，用于基于纤溶酶的治疗剂的“体内半衰期”具有两种不同的定义。第一种定义是体内酶活性半衰期。一旦进入血液，在低浓度(《1μm，其是α2-ap在的血清内的平均浓度)，plm立即被其主要抑制剂α2-ap中和，且活性半衰期仅为0.2秒，而μplm具有相对长的活性血浆半衰期，约4秒。第二种定义是自身蛋白质在血液中的固有结构稳定性。例如，由大肠杆菌内涵体复性得到的重组μplm在体外(实验室)缓冲液中和特定实验条件的温度下稳定，但是蛋白质自身一旦注射到活小鼠的血液中就变得不稳定，其结构半衰期可以短至2.75分钟；另一方面，天然的plg和plm的体内结构半衰期可以长达2-4天。在“命中和消亡”策略中，当描述体内稳定性和半衰期时，本公开的发明人使用第二种定义。本公开中，μplm治疗剂的“快速消亡”并非由血清内的蛋白酶抑制剂导致，而是如下情况：在高浓度(》1μm，或高于α2-ap在特定时间的体内有效浓度)下，中和所有α2-ap抑制剂活性后，重组酶自身的结构衰变导致的剩余酶活性损失。
19.本文使用的术语“体内不稳定”意为多肽或蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成新的“失活”化学个体，或因高级结构天然构象的衰变而导致的无共价键改变的失活(变性)。
20.本文使用的术语“重组”意为能够由设计的基因翻译为蛋白质片段且由基因重组技术得到的重组载体。
21.本文使用的术语“细菌宿主”意为外源性蛋白质生成的细菌表达系统。许多细菌表达系统能用于生成外源蛋白质。影响选择表达系统的因素包括所表达的蛋白质的天然本质、使用者的经验和产品的预期用途。大肠杆菌是用于表达外源蛋白质的最常用的细菌表达系统。
22.本文使用的术语“复性”意为将变性的蛋白质通过人工改变而获得其功能性结构和构象的过程。通过该物理过程，该蛋白质由无规卷曲形式复性为特异性的有功能的三维结构。当由mrna序列翻译为线性肽链时，蛋白质最初以非复性的多肽或无规卷曲的形式存在，此形式可通过“天然”或“人工”手段复性为天然构象。
23.本文使用的术语“包涵体”意为由膜包裹的高密度(1.3mg/ml)不溶性蛋白质颗粒(内涵体)，该颗粒在外源性基因在原核细胞中表达时，特别是大肠杆菌过量表达时形成。当在显微镜下观察时，其呈现为高折光区并且与细胞质中其他成分明显不同。内涵体通常包含多于50％的重组蛋白质，其中剩余的是核醣体成分、rna聚合酶、内毒素、外膜蛋白质、脂质体、脂多糖等，且仅在诸如尿素、盐酸胍等的变性试剂中可溶。内涵体的尺寸是约0.5-1μ
m，而大肠杆菌中内涵体的直径通常在0.2μm与1.5μm之间。
24.本文使用的术语“野生型”意为来自天然来源的天然原始蛋白质，例如人类和小鼠；或如果是重组蛋白质，则该蛋白质表达为其原始天然序列而无突变。
25.本文使用的术语“突变型”意为使用基因工程方法(例如pcr)在天然的或“野生型”的蛋白质序列中，通过基因工程改变氨基酸序列所产生的突变体。缩略语
[0026]“ami”代表急性心肌梗塞；
[0027]“ad”代表阿尔茨海默病；
[0028]“α2-ap”代表α2-抗纤维蛋白溶酶；
[0029]“aha”代表美国心脏协会；
[0030]“aβ”代表β-淀粉样蛋白；
[0031]“app”代表β-淀粉样前体蛋白；
[0032]“cdt”代表导管导向溶栓；
[0033]“ipf”代表特发性肺纤维化；
[0034]“μplm”代表微纤溶酶；
[0035]“pad”代表外周动脉疾病；
[0036]“pao”代表周围动脉血栓疾病；
[0037]“plm”代表纤溶酶；
[0038]“plg”代表纤溶酶原；
[0039]“pai”代表纤溶酶原激活物抑制剂；
[0040]“tpa”代表组织型纤溶酶原激活物；
[0041]“μpa”代表尿激酶型纤溶酶原激活物；
[0042]“mplg”代表miniplg或小纤溶酶原；
[0043]“μplg”代表microplg或微纤溶酶原；
[0044]“mplm”代表miniplm或小纤溶酶；
[0045]“μplm”代表microplm或微纤溶酶；
[0046]“pa”代表纤溶酶原激活物；
[0047]“α2-ap”代表α2-抗纤维蛋白溶酶；
[0048]“fdp”代表纤维蛋白降解产物；
[0049]“rmsd”代表均方根偏差；
[0050]“kr”代表环饼结构；
[0051]“ctt”代表c-端尾部；
[0052]“pe”代表肺栓塞；
[0053]“pdb”代表蛋白质数据库；
[0054]“md”代表分子动力学；
[0055]“sars-cov-2”代表呼吸综合征冠状病毒2型；
[0056]“covid-19”代表2019冠状病毒病；
附图说明
[0057]
图1示出plg的结构和全部蛋白质序列，其中pd代表蛋白酶结构域(残基ala542-asn791)；环饼结构1-5代表环饼结构域；ntp代表n-端肽(残基1-77)；代表糖基化作用位点(asn289、thr346)；代表磷酸化作用位点(phe578)；标记为pa的大箭头指示被纤溶酶原激活物切割的arg561-val562键；小箭头是其他蛋白酶的切割位点；代表形成k2和k3之间的s-s键的半胱氨酸残基；代表活性位点残基(his60、asp64、ser741)。
[0058]
图2示出μplm的整体构造：α2-ap络合物，其通过叠加到模板胰蛋白酶模拟：α1pi(突出为白色)晶体结构。
[0059]
图3示出了μplm和胰蛋白酶的结构重叠，rmsd为并说明了残基ser741、his603和asp646的催化三联体。
[0060]
图4示出活性位点中相互作用剖面的详细视图，其中催化三联体启动与α2-ap的arg403和met404之间的主链酰胺的共价反应，其中活性位点通过关键残基为arg403的侧链大量氢键稳定。
[0061]
图5示出具有plm自体溶解的环的α2-ap的无序c-端尾部与plm的70-80环结构之间的潜在继发性相互作用，目的在于解释这两个环结构的突变效果，其中关键突变示出为红色棍状物且为此做出标记。
[0062]
图6示出界面环结构和它们围绕反应位点的突变效果的图解，其中环1-3上的突变对活性位点施加中等扰动，phe587是例外。环4-5上的突变使得蛋白质失活，且其他较远的环上的突变产生期望的扰动。
[0063]
图7示出plm分解血栓的示意图。
[0064]
图8示出当施用于局部凝血时μplm和plm的两种潜在作用的示意图表示，其中在天然的plm治疗剂中，例如在外周动脉栓塞的情况下溶解收缩的血块后，如果施用的plm能中和α2-ap且具有更长的体内半衰期，则多余的plm仍旧能有活力溶解更远的收缩止血栓子，导致出血副作用。
[0065]
图9示出当应用到系统性凝血时μplm和plm的两种潜在作用的示意图。图中中显示在急性系统性血栓中，新形成的血栓是非收缩(不收缩)或“松弛”的，但被形成以保护血管壁免于出血的止血栓子确经常是收缩(回缩)的和“更稠密”的。中和血清中的α2-ap后，过量施用的突变体μplm可快速溶解血清中的松弛血块，但是因体内半衰期短不能溶解收缩的止血栓子。众所周知的是，“松弛血块”比稠密、收缩的血块更容易溶解。在该图中，代表μplm/plm；代表rbc；代表platelet；代表纤维蛋白。
[0066]
图10示出在对小鼠上施加致死和“治疗”试验在以观察其死亡和解剖后，通过在不同时间尾部静脉注射和眼部血液采样进行半衰期实验的示意图表示。
[0067]
图11示出通过superdex 200sec和spxl阳离子交换层析进行的μplg和μplm纯化。(a)通过superdex 200进行的h-wtμplg纯化；(b)通过superdex 200进行的m-wtμplg纯化；(c)通过superdex200进行的h-phe587alaμplg纯化；(d)通过spxl进行的h-wtμplg纯化；(e)通过sp xl进行的m-wtμplg纯化；(f)通过sp xl进行的h-phe587alaμplg纯化；(g)通过sp xl进行的h-wtμplm纯化；(h)通过sp xl进行的m-wtμplm纯化；(i)通过sp xl进行的h-phe587alaμplm纯化，h-wt意为人源野生型；m-wt意为小鼠野生型；phe587ala意为人源phe587ala突变体。
id no:6，由ala542开始。
[0080]
图24示出现有技术中已知的突变人类μplg中的环的核苷酸和氨基酸序列，各个序列能描述为：
[0081]
突变人源μplg中环1的cdna序列能参考seq id no:7，其中cdna由g298开始到a312；突变人源μplg中环1的氨基酸序列能参考seq id no:8，其中氨基酸由glu1开始到lys5；
[0082]
天然人源μplg中环2的cdna序列能参考seq id no:9，其中cdna由t190开始到a213；突变人类μplg中环2的氨基酸序列能参考seq id no:10，其中氨基酸由leu1开始到pro8；
[0083]
突变人类μplg中环3的cdna序列能参考seq id no:11，其中cdna由a118开始到g132；突变人类μplg中环3的氨基酸序列能参考seq id no:12，其中氨基酸由thr1开始到met5；
[0084]
突变人类μplg中环4的cdna序列是cagggtgac；突变人类μplg中环4的氨基酸序列是qgd；
[0085]
突变人类μplg中环5的cdna序列能参考seq id no:13，其中cdna由t655开始到t669；突变人类μplg中环5的能氨基酸序列参考seq id no:14，其中氨基酸由ser1开始到gly5；
[0086]
突变人类μplg中环6的cdna序列能参考seq id no:15，其中cdna由a526开始到a549；突变人类μplg中环6的氨基酸序列能参考seq id no:16，其中氨基酸由asn1开始到glu8。发明的详细说明
[0087]
如前所述，本发明说明研发基于plm的治疗剂，例如基于μplm的溶栓的治疗剂的思想和产品，期望设计重组μplm类溶栓治疗剂以通过α2-ap抑制逃避或克服抑制同时有效溶解致病的血块，但在治疗作用后快速丧失活性。由于所设计的μplm类治疗剂体内不稳定性和体内半衰期短，达到治疗作用后不能溶解保护血管的血栓栓子，从而避免出血副作用。该设计的理论依据(命中和消亡理论)是颠覆性的，其概念和产品是“新颖”的，这是因为现今常规观念的研究方法是研发体内更稳定和更长体内半衰期的蛋白药，包括溶栓剂的蛋白质治疗剂。
[0088]
所以，发明的第一方面提供包括野生型和突变型的体内半衰期短且体内不稳定的重组μplm，其能以有效活性在体内具有足够长的半衰期以溶解致病的血栓，但溶解血栓后迅速失活，避免了溶解防护血管的止血栓子，从而避免了溶血副作用。其中本公开也公开了一些突变型μplm，其表征为比野生型更好或与野生型几乎相同。在血清中，plm的活性通过其主要抑制剂即α2-ap中和，并且其血浆半衰期仅为0.2秒。体内，α2-ap首先与位于kr5和其他kr结构域的特定赖氨酸残基结合，然后与位于催化结构域的特定赖氨酸残基结合。通过活性位点口袋周围的蛋白质表面识别，α2-ap也能直接与μplm结合，其比纤溶酶具有相对更长-血浆半衰期约4秒。上述半衰期是在低于α2-ap的体内有效浓度(约1μm)的活性半衰期。但如果μplm的治疗浓度高于1μm，则中和了α2-ap后，μplm可以有效溶解血栓。为了有效溶解血栓但同时避免产生溶血副作用，本公开所设计的重组μplm的体内半衰期为约2.75到约28.5分钟的范围。实验证明这个半衰期范围足够长以溶解致病的血栓，但足够短以在治疗
作用后丧失活性，由此避免出血副作用。
[0089]
为了生产这种重组μplm，本公开的发明人已使用基于结构的蛋白质工程策略，其目标是增加μplm的催化活性并且同时抵抗α2-ap抑制。且该策略提供新的方法，即利用基于μplm的治疗剂药物研发的“基于结构的定向蛋白质工程”。另外且更重要的，本发明的新颖性是公开了发明人所创建的新的“命中和消亡”理论。这个新的理论可描述为：与研发体内更稳定的、更长半衰期的蛋白质或酶治疗剂的常规方法相反，本理论提出了研发体内不稳定，半衰期短的纤溶酶类溶栓药。本理论所描述的“理想溶栓药”在命中目标血栓，溶解血栓后迅速消亡，避免了现今市场上的溶栓药物因持续的溶栓活性而导致的出血副作用。
[0090]
一、plg的原发性结构和其脱环饼结构衍生物
[0091]
为了说明“基于定向结构的蛋白质工程”，本文简要地引入plg的原发性结构和其脱环饼结构衍生物。
[0092]
plg(cdna序列参见seq id no:1且氨基酸序列参见seq id no:2)，其结构在图1示出，是单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，其在血液中的浓度约为200mg/l，在新形成的血栓内与纤维蛋白结合。在体内，plg的激活是由tpa或upa切断arg561与val562之间(通过具有pa的箭头示出的位点)的肽键实现。tpa或upa都通过直接切断arg561-val562(参见图1)之间的肽键将plg激活为plm。新形成的plm随后有效的消化血栓中的纤维蛋白，由此将血栓溶解。
[0093]
激活的plg被转化为2个单独的亚单元，但是它们通过2个二硫键保持相互链接以形成plm多肽，该多肽由称为a链的更长亚单元和称为b链的更短成分组成。a链由5个三元环二硫化物kr结构域(每个约78-80个氨基酸)组成。b链包含约20个氨基酸的“连接肽”区和丝氨酸蛋白酶结构域(约228个氨基酸，参见图1)。
[0094]
mplg(cdna序列参见seq id no:3且氨基酸序列参见seq id no:4)和μplg(cdna序列参见seq id no:5且氨基酸序列参见seq id no:6)是plg的2个脱环饼结构突变体，其中mplg是plg的迷你版本，仅由kr5、连接肽和丝氨酸蛋白酶结构域组成，而μplg仅由连接肽和其自身丝氨酸蛋白酶结构域组成。最初，mplg通过ala440与ser441之间的在图1示出的中性白细胞弹性蛋白酶分解生成，而μplg通过ph11下碱介导的切割生成且在cys541与ala542之间开始。与plg激活相似，通过利用tpa、upa或其他pa在arg561与val562之间的肽键处进行切割，mplg与μplg都可分别被激活为mplm与μplm，再次形成通过相同的2个二硫键相互连接的2个单独亚单位。通过诱变移除这些二硫键的一个或两个使得激活的丝氨酸蛋白酶结构域丧失功能。
[0095]
在plm、mplm和μplm之间具有一些有趣的功能性差异。在功能性方面，μplm因不能与纤维蛋白特异性结合而与mplm和plm不同；μplm缺少与纤维蛋白结合的kr1-kr3和kr5结构域中的残基。虽然plm和mplm具有相似的消化纤维蛋白催化速率，但μplm比mplm慢6倍且比plm慢12倍。在体内半衰期方面，估计与纤维蛋白界面结合的纤溶酶的半衰期比游离循环的激活纤溶酶长2-3个数量级。一旦与纤维蛋白结合的plm与血块脱离，其立刻被其主要抑制剂α2-ap抑制，其血浆半衰期仅为0.2秒。在体内，α2-ap首先与位于kr5和其他kr结构域的特定赖氨酸残基结合，然后与催化结构域结合。通过活性位点口袋(参见用于结构模拟的图2-6)周围的蛋白质表面识别，α2-ap也能与μplm直接结合；但与plm相比，其具有相对长的血浆活性半衰期，约4秒。
[0096]
关于纤维蛋白特异性，应该理解因plg激活被捕捉到血块的plm与注射到血液中的plm类的溶栓药不同。如上所述，被捕捉的plm与纤维蛋白网络内部结合且活性半衰期比游离的plm大2-3个数量级。如果给药，则需要施用基于plm的药物的大治疗剂量以治疗急性血栓堵塞所导致的危及生命的急症，例如缺血性卒中和心肌梗死。这个治疗量往往远高于血液中纤维蛋白的量，不太可能也没有必要达到化学平衡以利用纤维蛋白特异性从而“靶向”致病血栓同时避免α2-ap抑制。实际上，当前导管定向给药是溶栓药对血栓中的纤维蛋白靶向的主要方法。本公开的发明人推测，在人工应急情况下，溶栓药物的纤维蛋白特异性没有根据药物疗效给药治疗剂的时间和用量重要。作为示例，在兔体外循环溶栓模型中血栓的溶解的疗效方面，对源自血清的plm、从甲醇营养型酵母分离的重组人类μplm和重组tpa的局部导管介导给药进行了比较。以取决于剂量的方式，所有三个分子溶解血栓都有效，具有相似摩尔剂量的纤溶酶和μplm显示血栓溶解的相似疗效。所施用的剂量的plm和μplm不会导致在远离灌注位点的额外血栓止血稳定栓子的出血。但是tpa确实在额外血栓栓子位点以所有浓度导致出血。因此，缺少plm的环饼结构域由此不会具有额外纤维蛋白结合特异性的μplm与相似药理剂量的plm一样有效。
[0097]
二、“基于结构的定向蛋白质工程”的原理
[0098]
首先，引入对plg多肽的氨基酸点突变的说明，其构成“基于结构的定向蛋白质工程”的第一部分，其原理在图1示出。
[0099]
图1示出人类的三个主要翻译后修饰位点，它们影响体内活性、稳定性和对纤维蛋白原的结合亲和力。如全长plg的晶体结构清晰显示出，o-糖基化作用位点(thr346，参见图1)出现在所有形式的循环plg且保护酶原不受“偶然”或不需要的激活，而n-糖基化作用位点(asn289，参见图1)仅出现在i类plg，其有利于活性更高的开放构象。另外，ser578位置的磷酸化作用位点也已经被鉴别出来，其可能影响分子的稳定性。plg的体内激活酶是tpa和upa，它们都通过切断arg561-val562(参见图1)肽键直接将plg激活为plm。
[0100]
其次，引入对plg多肽的同源模建和子动力学模拟的说明，其构成“基于结构的定向蛋白质工程”的第二部分，其原理在图2-4示出。
[0101]
如图2所示，本公开的发明人根据胰蛋白酶-抗胰蛋白酶络合物的同源结构构造了络合物结构模型，从而使用μplm(pdb号：1bml)和α2-ap(pdb号：2r9y)的晶体结构来设计能逃避抑制的突变体。然后这两个结构被叠加到胰蛋白酶：抗胰蛋白酶络合物(pdbid:1oph)的晶体结构。
[0102]
图3示出μplm和胰蛋白酶的活性位点结构叠加物的展开图，突出显示plm的催化三联体，即残基ser741、his603和asp646，主链rmsd是该图示出两个丝氨酸蛋白酶的高度相似的活性中心结构。
[0103]
图4示出催化反应(“自发失活反应”)的初始位置的详细视图，其中μplm的活性位点丝氨酸(ser741)呈现对a2-ap的arg403与met404之间的主链酰胺的预攻击姿势。
[0104]
μplm与α2-ap之间的相互作用的模拟在图5-6示出。
[0105]
图5示出μplm与α2-ap之间的分子接触区。由于α2-ap(2r9y)的晶体结构缺失c-端残基，本公开的发明人使用i-tasser服务器以构建缺失的残基465-491(在图6示出的
ctt)。
[0106]
除了自体溶解和可能与模拟的ctt结构直接接触的70-80环，图6还示出μplm的接触界面中的6个环(其cdna序列和氨基酸序列参考seq id no:7到seq id no:16)。
[0107]
与天然的plg和plm作为溶栓治疗剂用于血栓栓塞疾病的治疗的机制对比，以下所描述的是如下机制：本公开中细菌表达和复性的重组μplm作为溶栓治疗剂发挥功能以溶解致病的血栓，但使得防护血管壁的止血栓子完整，由此避免出血副作用。
[0108]
图7示出通过血栓中tpa激活plg和通过plm降解纤维蛋白血栓，但当plm释放到血液，活性立刻被纤溶酶抑制剂(α2-ap)抑制。在体内，致病性血栓被酶plm溶解为可溶性成分，该酶plm是源自酶原plg的丝氨酸蛋白酶。plg与纤维蛋白和纤维蛋白原二者结合，由此并入其形成的血块。upa和tpa都是将plg转换为plm的精巧而特定丝氨酸蛋白酶。血液复杂纤溶网络的其他主要部分包括诸如pai和α2-ap这样的抑制剂，pai与tpa和upa结合且抑制tpa和upa，α2-ap与plm结合且抑制plm。plm的关键生理功能在先天plm缺乏的患者中显示，这类先天缺乏导致引发血管外纤维蛋白溶解不足的多系统性紊乱。临床结果是，粘液性膜的伤口愈合能力显著受损，导致木样结膜炎和几种其他临床表现。
[0109]
首先，pa不会自行溶解血块，但其由plg生成活性plm来溶解血块。虽然pa能有效溶解小的心肌动脉中血栓，但由于血块长且收缩，pa在溶解外周动脉和静脉中更大血栓时失去功能。原因之一是血块附近的血液循环缓慢，造成plg底物的供给不充足。结果，系统性给药的pa不仅难以溶解血栓，而且plg底物也不够实现血栓的高效溶解。另一方面，基于plm的直接溶栓试剂自身能有效溶解血栓，从而避免了使用pa的治疗遇到的plg底物耗竭问题。另外，一旦分散到血清，plm活性会立即被α2-ap中和，如果活性plm浓度低于血清中的α2-ap，则可能会避免出血副作用。
[0110]
图8示出“药量过多”plm可能到达远离的止血栓子并且溶解它们，导致系统性出血。另一方面，如果施用足够活性的药物，体内半衰期短的突变体μplm能够溶解靶向血栓，但分散到血液后快速消失或丧失活性，则可避免出血副作用。如已经在背景技术部分说明的，本公开的发明人再次强调本文中体内半衰期的定义是血液中酶结构的完整性。
[0111]
图9示出施用的μplm的浓度“药量过多”以中和所有蛋白酶抑制剂，且因非常短的体内半衰期短而“快速失活”。如图9示出的，本公开的发明人提出可能的“命中和消亡”策略，其以溶解急性系统性血栓中新形成的“松弛”血块后，突变体μplm可以快速消失或丧失活性而不能溶解收缩或致密止血栓子的方式设计溶栓剂(例如大肠杆菌表达的突变体μplm)体内半衰期短的版本，避免由现有溶栓药物的持续活性导致的出血副作用。
[0112]
本发明的第二个方面提供药物组合物，其包含上述重组微纤溶酶作为溶栓试剂，或其药学上可接受的剂型，或所述化合物或剂型的药学上可接受的溶剂化物，且包括药学上可接受的赋形剂。
[0113]
通常，根据本公开的重组微纤溶酶并入适于对受试者给药的药物组合物，其中药物组合物包含重组微纤溶酶和药学上可接受的赋形剂。如本文中使用的，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟等渗和吸收延迟试剂以及生理性亲和的类似物。药学上可接受的赋形剂的示例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇和类似物以及它们的组合中的一种或多种。
[0114]
在很多情况下，优选在组合物中包括等渗压试剂，例如糖、诸如甘露醇、山梨醇的
多元醇、或组合物中的氯化钠。药学上可接受的赋形剂还可包含微量的诸如润湿剂或乳化试剂、防腐剂或缓冲液的辅助物质，以增强药物组合物的保存期限或效力。
[0115]
本公开的组合物可以是各种剂型。它们包括，例如液体、半固体和固体剂型，例如液态溶液(例如，可注射和可溶性溶液)、分散体或悬液、片剂、药片、粉末、脂质体和栓剂。优选剂型取决于给药和治疗用途的计划方式。通常优选的组合物可为可注射或难溶性溶液的剂型，例如与用于静脉注射或导管定向静脉给药的相似的组合物。
[0116]
药物组合物通常必须经过灭菌处理且其在生产和保存条件下是稳定的。组合物能制成溶液、微乳液、分散体、冻干粉或适合高药物浓度的其他剂型。如要求地，经过灭菌的可注射溶液能如下制备：以要求剂量将活性化合物(即，药物组合物)加入具有一种以上的配料或其组成的合适溶剂，然后进行过滤灭菌。一般地，分散体是通过将活性化合物加入包含基本分散介质和以上剂型的其他要求的配料的经过灭菌的装置而制备的。在用于制备经灭菌的可注射溶液的经灭菌的粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，冷冻干燥由其之前经过灭菌-过滤的溶液产生活性配料和和任何另外期望配料的粉末。例如，通过使用诸如卵磷脂的配料、如果是分散体通过保持要求的粒径和通过使用表面活性剂，可维持溶液的适当流动性。通过在组合物包括诸如单硬脂酸盐和明胶这样的延长吸收的试剂，可延长可注射组合物的吸收。
[0117]
三、剂量和给药
[0118]
对于体内应用，以有效剂量提供或施用重组微纤溶酶。本文使用的词组“有效剂量”或“有效用量”是指直接或间接获得一种或多种有益或期望治疗结果所必要的药物、化合物或药物组合物的用量。例如，当对肺栓塞受试者给药，有效剂量包括足够溶解致病血栓的用量。本发明的药物组合物的“治疗有效用量”是指就剂量和持续时间而言获得期望治疗结果的有效剂量。这种治疗有效剂量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体的体重以及药物组合物引出个体的期望应答的能力这样的因素而改变。治疗有效剂量也是药物组合物的治疗有益效果超过任何有毒或有害效果的剂量。
[0119]
可在一次或多次给药施用有效剂量。药物、化合物或药物组合物的有效剂量可或可不与其他药物、化合物或药物组合物结合使用而得到。因此，在施用一种或多种治疗试剂的背景下可考虑有效剂量，且如果与一种或多种其他试剂结合，可考虑以有效用量施用单个试剂，可获得或获得了期望结果。
[0120]
可通过任何合适路径对个体递送重组微纤溶酶。本领域的技术人员可理解的是本文描述的示例并非旨在限制而是解释可获得的技术。因此，在本发明的一些方面，根据已知方法对个体给药重组微纤溶酶，例如静脉内给药，例如，丸剂或一段时间内持续灌注，通过肌肉注射、腹腔注射、脑脊髓注射、颅内注射、透皮注射、皮下注射、关节内注射、舌下注射、神经膜内注射、鞘内口服、吸入或局部途径。给药必须是系统性的，例如，静脉内给药或局部化，例如，导管定向施加于阻塞血栓。用于液体配方的可商购的喷雾器，包括用于给药的喷气喷雾器和超声喷雾器，对于给药是有用的。液体配方能直接喷雾且冻干粉末可用气体喷雾。或者，重组微纤溶酶能使用碳氟化合物配方和定量吸入器而被雾化，或作为冻干和磨碎的粉末被吸入。给药的优选方式是静脉内、皮下、肌肉下及气雾剂途径。在优选的实施例中，药物组合物通过静脉内灌注或注射给药。在另一个优选的实施例中，药物组合物通过导管定向施加来给药，以直接溶解阻塞血栓。
[0121]
在本发明的一些方面，重组微纤溶酶经由位点-特异性或靶向局部施用技术而给药。位点-特异性或靶向局部施用技术的示例包括重组微纤溶酶的各种植入式补给源或局部施用导管，例如灌注导管、留置导管或针导管，合成移植物、外膜、分流和支架或其他植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接施加。
[0122]
为了实现本发明的目标，重组微纤溶酶的合适剂量将取决于使用的特殊adc(抗体药物偶联物)(或其组合物)、待治疗症状的类型和严重度、试剂是否为治疗目而给药、之前的治疗、患者的临床病史和试剂应答、患者对给药试剂的消除率和主治医师的考量。临床医生可给药重组微纤溶酶直到剂量达到以及超出期望结果。剂量和/或频率可在治疗过程中改变，但也能恒定。经验性考量，例如半衰期，一般有利于确定剂量。例如，重组微纤溶酶能有效溶解致病的血栓但使得保护止血栓子完整，避免出血副作用。给药频率可在治疗过程中确定和调节，且其通常但非必要地基于症状的治疗和/或抑制和/或改善，例如，肿瘤生长抑制或延迟等而确定和调节。或者，重组微纤溶酶的持续连续释放配方可能是合适的。获得持续释放的各种配方和装置是本领域公知的。
[0123]
为了实现本发明的目标，常规日常剂量可约由任意的3μg/kg到30μg/kg到300μg/kg到3mg/kg，到30mg/kg，到100mg/kg或更多。例如，可使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg和约25mg/kg的剂量。对于在几天或更长时间重复给药，根据血栓栓塞，维持治疗直到症状被期望地抑制或直到，例如对于溶解致病的血块获得足够治疗水平。示例性的给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，然后维持每个星期约1mg/kg的重组微纤溶酶，或然后维持每隔一个星期约1mg/kg的剂量。其他示例性的给药方案包括给药逐步增加的剂量(例如，1mg/kg的初始剂量然后每个星期或更长期限逐渐增加到一种或多种更高剂量)。根据从业人员期望获得的药学动力学衰变模式，其他给药方案也有效。例如，在本发明的一些方面，考虑每星期给药一到四次。在其他方面，考虑每个月或每隔一月或每三个月，以及每个星期、两个星期和每三个星期给药一次。该治疗的进展可通过常规技术和试验容易地监测。
[0124]
所公开的药物组合物可引发协同治疗效果，即，大于其个体效果或治疗结果之和的效果。例如，协同治疗效果可以是比单一药剂引起的治疗效果或给定组合的单一药剂引起治疗效果的总和大至少约两倍的效果，或比其治疗效果大至少约五倍，或至少大十倍，或至少大二十倍，或至少大五十倍，或至少大一百倍。与由单一药剂引起的治疗效果或由给定组合的单一药剂引起治疗效果的总和相比，可观察到协同治疗效果的治疗效果增加至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少90％或至少100％或更高。协同效应也是当治疗剂组合使用时允许减少治疗剂的效应。
[0125]
在某些实施方案中，本公开中的药物组合物的治疗或预防性有效量为约0.0001至50mg/kg、约0.001至50mg/kg，约0.001至5mg/kg、约0.001至0.5mg/kg、约0.001至0.05mg/kg，约0.01至5mg/kg或约0.01至0.5mg/kg。在其他实施方案中，本公开中的药物组合物的治疗或预防性有效血液或血浆浓度为约0.0003至300nm、约0.003至300nm、约0.03至300nm，约0.003到30nm，约0.03至30nm或约0.3至3nm。其他剂量或血液或血浆浓度也是可能的。药物组合物的浓度，例如血液或血浆中的浓度，可以通过本领域已知的任何方法测量。
[0126]
药物组合物可以例如以包含这种突变体的组合物来给对象给药一次或多次，直到
达到足够的治疗或预防效果。在使用多次给药的情况下，可以每小时、每天或以任何其他适当的间隔给药，包括例如每天多次给药。可以按照诸如每10分钟、每15分钟、每20分钟、每30分钟、每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每天3次、每天2次、每1天1次、每2天1次、每天3天1次或每周1次的时间表或其他时间表施用多种剂量。药物组合物也可以连续给药。药物组合物可以例如经由肠外途径(例如，静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内)给药。药物组合物通常作为本文所述药物组合物的一部分给药。
[0127]
本公开的第三方面提供了一种治疗血栓栓塞相关疾病的方法，血栓栓塞相关疾病包括缺血性中风、心肌梗死、深静脉血栓、外周动脉阻塞、肺栓塞和由诸如sars-cov2感染和败血症引起的各种病症导致的全身凝血，其中该方法包括对患有血栓栓塞相关疾病的受试者给药治疗有效量的上述药物组合物，或药学上可接受的剂型，或所述化合物或剂型的药学上可接受的溶剂化物。
[0128]
四、心血管疾病的治疗
[0129]
无论是单独应用还是与pa联合应用，基于plg和plm的治疗剂的应用之一是用于外周动脉闭塞(pao)。pao发生在血栓阻塞动脉血液流向身体远端部位如腿、手臂、脚或手时。pao的典型早期特征是“间歇性跛行”或持续活动期间且休息后会消退的腿痛。持续的血液流动限制最终会导致腿部或四肢持续疼痛，甚至在休息时也会出现溃疡、组织死亡和坏疽。最终可能导致截肢。pao是pad的结果，在pad中，动脉壁上的动脉粥样硬化斑块积聚导致血液流动受阻，导致身体血液匮乏的肢体缺血。
[0130]
ami的治疗与pao有根本差异。首先，pa不会自行溶解血栓，但其由plg生成活性plm来溶解血栓。虽然这能有效溶解小的心肌动脉中的血栓，但由于血块长且收缩，溶解外周动脉和静脉中更大血栓产生困难。血块附近的循环较弱，因此plg底物的供给不充足。结果，系统性给药的pa不仅难以浸润血栓，而且plg底物也不够实现血栓的高效溶解。另一方面，基于plm的直接溶栓试剂自身能有效溶解血栓，可避免使用pa的治疗遇到的plg底物耗竭问题。另外，本发明公开的体内半衰期短的版本的微纤溶酶在溶解血栓后快速丧失活性，因此可避免出血副作用。
[0131]
五、阿尔兹海默病的治疗
[0132]
阿尔茨海默病的主要特征是细胞外斑块和细胞内神经纤维缠结。细胞外斑块主要由aβ肽组成，细胞内神经纤维缠结由细胞骨架蛋白tau组成。aβ是由38至43个氨基酸残基组成的多肽的混合物，该残基通过两种蛋白酶即β-分泌酶(bace-1)和γ-分泌酶的作用由app生成。过去的研究结果已支持了淀粉样蛋白斑块假说。这一假说提出，aβ肽的过度产生(主要来自遗传缺陷)或未能有效清除该肽(大多数偶发性ad病例)，因aβ毒性和淀粉样蛋白斑块沉积导致ad，这也被认为与神经原纤维缠结的形成有关。因此，针对ad治疗的治疗剂研究主要旨在阻断aβ肽的产生、阻碍其聚集或增强其清除。最早的基于aβ的治疗应用之一是使用aβ肽作为疫苗的免疫治疗，但临床毒性阻止了该策略的进一步发展。在许多临床试验中也使用aβ肽抗体作为治疗试剂。
[0133]
在正常生理条件下，aβ的产生通过多种相互关联的过程将其消除来抵消，该过程包括蛋白酶降解、细胞介导的清除、主动和被动运输出脑部、以及沉积成不溶性聚集体。尽管这些过程中的每一个都有助于aβ分解代谢，但已出现的研究结果表明，蛋白水解降解是脑部aβ水平的一个特别重要的调节因子，且降低降解为ad发病机制之一。saido和同事首次
研究了活体动物中的aβ降解。随后的工作鉴别了许多不同种类的参与aβ分解代谢的蛋白水解酶，包括锌金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。所有这些酶都具有潜在的对ad的治疗价值。然而，在所有直接参与体内降解aβ的蛋白酶中，只有μplm作为治疗药物被广泛研究。因此，目前，开发基于plm的治疗剂是aβ降解酶中的一个实际选择。
[0134]
对培养细胞的研究表明，纯化的plm显著降低了聚集aβ诱发的神经元损伤水平。在单独的研究中，ledesma等人不仅表明plm降解aβ，将其从淀粉样转换为非淀粉样变，而且还一致表明ad患者脑组织中plm水平降低。已发表的结果还表明，外周应用含aβ的接种物可诱导脑部β-淀粉样病变，进一步表明清除外周aβ与清除脑部一样重要。
[0135]
如上所述，基于天然纤溶酶的治疗剂对于治疗应用可能不够有效。然而，可以选择基于plm的逃逸突变体，使其能够特异性切割和脱毒β-淀粉样肽，但同时，除了抵抗α2-ap抑制外，对例如纤维蛋白这样的其他常见底物，具有低催化活性。因此，定制选择的基于突变plm的治疗剂可能对治疗ad具有更高的疗效，但副作用减小。
[0136]
六、肺纤维化的治疗
[0137]
plm下调导致的纤维蛋白溶解减少与肺纤维化(ipf)关。已经表明，plg基因靶向缺失的小鼠在肺纤维化条件下预后较差。还表明，pai-1过表达的小鼠使plg激活为plm系统性受损，导致博莱霉素损伤后肺纤维化反应比同窝对照组更严重，而增加plg激活具有抗纤维化作用。另一方面，plg激活系统在ipf中受损，进一步证明plg激活系统对于预防ipf疾病至关重要。
[0138]
七、covid-19导致的系统性血栓症的治疗
[0139]
新冠肺炎(covid-19)患者的凝血病通常表现为纤维蛋白降解产物(d-二聚体)和纤维蛋白原水平增加，但血小板计数和凝血酶原时间最初正常。新冠肺炎治疗指南文件中已阐述了静脉血栓栓塞的高发病率和利用抗凝血栓预防进行治疗的重要性。利用肝素的抗凝治疗显示，入住重症监护室的患者预后有所改善。在另一份报告中，icu患者中也观察到高水平的d-二聚体和延长的凝血酶原时间。
[0140]
在高致病性人类冠状病毒(hcov)的晚期临床阶段，合并症是经常导致死亡的疾病并发症发生的重要因素。据报道，严重新冠肺炎患者最常见的合并症是糖尿病、高血压、恶性肿瘤、肾功能不全和慢性阻塞性肺病(copd)，所有这些疾病都以慢性炎症为特征。缺氧、高凝和免疫反应引起的血流异常、内皮功能障碍、高粘度和血小板激活是导致血栓形成的主要因素，大剂量肝素治疗通常用于治疗新冠肺炎诱导的血栓形成。
[0141]
具有基础疾病的患者的一个共同特征是血液plg水平升高。旨在探索早期检测和治疗严重新冠肺炎患者的新方法的研究能对防治该疾病产生重大影响。在此，本公开的发明人强调了支持纤溶酶原激活物/纤溶酶源激活物受体(pa/par)系统在新冠肺炎相关肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ards)发病机制中的潜在作用的证据。upar的可溶性剂型可能是疾病进展的潜在生物标志物，其水平与新冠肺炎患者死亡相关的合并症相关。在一项涉及118名住院新冠肺炎患者的研究中，发现新冠肺炎患者的tpa和pai-1水平升高，且其与更严重的呼吸道疾病相关。
[0142]
对失调的pa/par系统靶向可能是治疗sars-cov-2感染引起的严重肺损伤的治疗方法。一些动物模型研究和一期临床试验支持使用pa来限制急性呼吸窘迫综合征(ards)的进展并减少ards引起的死亡。新冠肺炎诱发的ards可能是由微血栓的存在引起的，而微血
栓可以通过溶栓酶治疗剂进行治疗。在一项对13名新冠肺炎患者的研究中，有报道称吸入plg治疗可改善肺部病变和低氧血症。另外三个病例系列共有八例由新冠肺炎引起的ards患者被发现受益于tpa给药。有证据表明，溶栓剂对治疗新冠肺炎相关的全身凝血有积极的疗效。以下章节中描述的基于plm的溶栓治疗剂可以提供比基于pa的治疗剂的替代或更好的选择。相比之下，sars冠状病毒感染导致重症患者晚期肺纤维化。毫不奇怪，ipf是新冠肺炎的一个主要危险因素，其在许多情况下可能导致长期肺纤维化。所导致的肺纤维化与病毒诱发的凝血有关或可能是其结果，这是因为已暗示sars-cov-2引起的肺损伤可导致间质空间的血管外凝血和肺纤维化。纤维化至少在最初阶段可以用基于plm的直接溶栓治疗剂来治疗。事实上，动物模型和初步临床试验都表明，补充plg可能是ipf治疗的有希望的治疗剂。
[0143]
示例
[0144]
以下示例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从上述描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
[0145]
在已经发表的论文中，本公开的发明人描述了总共71个μplm突变体克隆的筛选和表征，以选择能够逃避α2-ap抑制并且也具有良好酶活性的μplm突变体。基于先前的结果，在这项研究中，本公开的发明人专注于三种重组μplg的大肠杆菌表达、包涵体复性和纯化，其包括野生型人μplg(h-μplg)、野生型小鼠μplg(m-μplg)和h-μplg-phe587ala的α2-ap逃逸突变体。此外，为了比较大肠杆菌和酵母表达的μplg和μplm的生物化学和动力学性质，本公开的发明人将h-μplg和m-μplg两者克隆到酵母表达载体中，并表达和纯化酵母表达的重组蛋白(hy-μplg与my-μplg)。
[0146]
示例一、μplm的克隆、表达、包涵体复性和纯化
[0147]
将一个针对大肠杆菌表达优化的人和小鼠μplg合成基因克隆到大肠杆菌表达的pet-11表达载体中。将序列验证的野生型和突变质粒转化到大肠杆菌菌株bl21(de3)中，按照与先前描述的相同程序进行表达、复性和纯化(dan m,tuan m,liu w,wu s,lin x(2007)refolding,purification and activation of mplm andμplm isolated from e.coli inclusion bodies.protein expression&purification 52,0-402)。简言之，含有表达质粒的大肠杆菌在高密度摇瓶自动诱导系统中表达(studier fw(2005)protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.protein expression and purification 41,207-234)。然后将液体培养基离心收集细菌，并用溶菌酶进行冻融循环，以纯化包涵体。将纯化的包涵体溶于8m尿素缓冲液(8m尿素、0.1m三异丙基乙磺酰、1mm甘氨酸、1mmedta、10mm乙硫醇、10mm二硫苏糖醇(dtt)、1mm还原型谷胱甘肽(gsh)、0.1mm氧化型谷胱甘肽(gssg)、ph10.5，最终浓度为2mg/ml)中。将溶液快速稀释成20体积的20mm三异丙基乙磺酰、0.2ml-精氨酸、ph10.5。如(lin x,umetsu t(2010)by using the high ph and ph-shift refolding technology.current pharmaceutical biotechnology 11,293-299)所述，将溶液的ph用6m hcl缓慢调节为ph8。然后通过超滤浓缩复性的蛋白质，并通过所述的各种类型的柱色谱纯化，如(dan m,tuan m,liu w,wu s,lin x(2007)refolding,purification and activation of mplm andμplm isolated from e.coli inclusion bodies.
protein expression&purification 52,0-402)所述。
[0148]
将大肠杆菌表达的不溶性重组包涵体蛋白复性并纯化成用于溶栓应用的活性形式。
[0149]
为了通过实验测定单个残基对复合物形成的贡献，本公开的发明人将μplm环中的每个氨基酸残基改变为丙氨酸(通过丙氨酸扫描诱变)，并产生54个丙氨酸突变，其中52个在大肠杆菌中表达为包涵体、复性和纯化。根据突变蛋白的动力学数据，本公开的发明人将phe587ala鉴定为最理想的突变体，并对phe587位置进行饱和突变。有趣的是，抗α2-ap的phe587ala突变体与已发表的结果一致，这表明同一突变体对某些活性位点小分子抑制剂具有抗性。经过扫描突变和饱和突变，本公开的发明人总共合成了73个突变克隆，其中71个可以表达和纯化。表1列出了从我们的诱变结果中选出的9个最有前途的突变体的动力学参数。该表总结了从参考文献的丙氨酸扫描诱变数据中获得的最佳突变体。突变体的所有动力学值均表示为相对于μplm野生型酶(wt，设为1)，其kcat＝442(分钟-1
)且km＝204μm。kcat/km是催化效率，ic50是通过α2-ap抑制μplm到最大活性的一半。在最后一列中，kcat/km
×
ic50表示定义“逃逸效率指数”的人为值。∞表示α2-ap完全无抑制。
[0150][0151]
在该表中，列出了名为kcat/km
×
ic50的列，本公开的发明人将其定义为突变体“逃逸效率指数”——该指数越高，突变体越好。phe587ala的指数是11.3，比除了gly739ala的任何其他突变体都高。gly739ala超出了规模，需要更详细的研究。图3的结构中标记了每个突变体残基，这表明3个突变体与模型ctt结构(arg582ala、met585ala、lys607ala)接触，5个突变体与α2-ap的反应中心环结构(lys607ala、ser608ala、arg610ala、glu641ala、pro642ala)接触。phe587ala是所选择的最有前途的逃逸突变体，具有比wt更好的催化活性和效率，但对α2-ap抑制具有高度抗性。gly739位置非常接近活性位点ser741，gly739ala对合成底物的催化效率较野生型更低，但动力学数据表明，该突变体完全避免了由α2-ap导致的抑制。这些结果为进一步研究基于plm的药物的治疗开发创造了新的机会。最终目标是通过酶的基于结构的“定向工程”，发现对降解靶向致病性肽底物具有特异性，但对其他非靶向底物没有活性或活性低得多的设计的μplm治疗剂。
[0152]
图11显示了使用superdex 200sec柱色谱和sp-sepharose阳离子交换色谱对重组μplg进行的纯化概况。如前所述，大肠杆菌表达的包涵体被纯化、复性，复性的蛋白质首先
constraint solver for molecular simulations.j.comput.chem.18,1463-1472)处理，实际空间截止值为同时执行并行模拟。
[0157]
示例三、大肠杆菌和酵母表达的μplg的热稳定性的测量
[0158]
基于荧光的热变性测量(差示扫描荧光法，dsf)用于测量热稳定性(https://doi.org/10.1038/nprot.2007.321)。通过使用bio-radcfx96实时pcr系统(美国)中的pcr管来进行测量。典型的40μl反应混合物在ph7.5的20mm hepes缓冲液中含有sypro orange5x染料(来自thermo fisher scientific)，并分别含有为2.5μm、5μm和10μm的μplg。将反应板在25℃孵育30分钟，然后以0.5℃的间隔加热至100℃，沉降时间为30秒。将“扫描模式”设置为“fret”，并绘制对温度的荧光计数。在470nm通过激发和在570nm通过发射测量荧光。图15显示了大肠杆菌和酵母表达的μplg的热稳定性。图中显示，大肠杆菌复性的μplg的熔化温度为53℃，酵母表达的μplg的熔化温度是69℃。16℃的差异表明，酵母表达的“天然复性”y-μplg比大肠杆菌包涵体表达和复性的e-μplg稳定得多。结果支持，大肠杆菌表达并复性的μplg更接近于“理想溶栓药”。
[0159]
示例四、大肠杆菌和酵母表达的μplg的激活和动力学测量
[0160]
动力学测量基本上与前面描述的相同。使用显色底物pglu-phe-lys-pna(s-2403)监测蛋白水解活性，用4-硝基苯基-4-胍苯甲酸盐酸盐(pnpgb)滴定μplm的活性位点。简言之，在含有25mmtris-hcl、ph7.4、50mm nacl的反应混合物中，用纤溶酶原激活剂如sk(20:1)在37℃下激活重组μplg酶原(35.5μm)10分钟。被激活的μplm的活性位点使用描述的pnpgb来滴定。将激活的酶原滴定至5.5μm，然后将10μl与100μl的0.0625mm、0.125mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1.0mm、1.5mm或2.0mm底物s-2403在测量缓冲液(25mm tris-hcl、50mm nacl、ph7.4)中混合。使用thermo fisher的微板读数仪在37℃下以10秒的间隔监测(在405nm)酰胺水解活性的产生。使用grafit版本7(erithacus软件)将数据绘制为速度与底物的关系，并确定野生型和每个突变体μplm的vmax和km。根据活性酶浓度(kcat/km)计算催化效率。本公开的发明人对大肠杆菌和酵母中表达的人和小鼠μplm进行了标准michaelis-menten动力学测量并显示于图16中。该图显示，酵母表达的y-μplg和y-μplm的动力学参数不同于大肠杆菌表达的e-μplg和e-μplm。结合图15所示的结果，大肠杆菌表达μplm更适合于溶栓药物的开发。
[0161]
示例五、动物试验
[0162]
我们对几种版本的μplm的动物研究表明，重组酶不仅可以在肺栓塞模型的小鼠模型中解决由血栓引起的致命疾病，而且在治疗浓度下具有最小的出血副作用。结果表明，使用本公开中描述的重组e-μplm可以避免溶栓药物开发面临的长期问题，即通常致命的出血副作用。与开发更稳定、更长的体内半衰期溶栓治疗剂的传统方法相反，本公开结果支持本发明人所提出的一个新的“命中和消亡”理论。此理论中所描述的“理想溶栓药”在将靶向致病血栓溶解后自身迅速消亡，避免了现在的溶栓药物因持续活性而导致的出血副作用。
[0163]
本公开的发明人设计了用于肺栓塞的小鼠模型，其包括对照组、假手术组和模型组。km小鼠(每组4-6周龄，体重约36-47g，雄性(m)和雌性(f)1∶1，n＝8)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买。所有实验程序均经动物伦理委员会批准，并遵循中国湖北中南民族大学生命科学学院实验动物护理和使用指南。
[0164]
血液中α2-ap的正常浓度约为1μm，以中和血液中的活性plm从而避免酶的毒性作
用。在动物试验中，本公开的发明人使用5-20μm的e-μplm拯救小鼠肺栓塞模型中的小鼠。在e-μplm的此浓度下，所有的α2-ap将被中和，血液中的活性e-μplm浓度为4-19μm，这个浓度可能通过溶解止血栓子，导致过度出血而杀死动物。但本发明的实验结果表明，在小鼠模型中，未经e-μplm治疗的动物因凝血死亡，但经过e-μplm治疗的动物均存活下来且没有严重的出血副作用。这些结果使得本公开的发明人认为，在溶解血液中新形成的血栓后，重组e-μplm由于体内不稳定和半衰期短而失去活性，从而避免了致命的出血副作用。
[0165]
下面本技术的发明人提供通过以下步骤从每个动物模型制备小鼠组织石蜡切片的方法：
[0166]
固定：用多聚甲醛固定24小时。
[0167]
洗涤和脱水：从低到高乙醇浓度：50％、70％、85％、95％、100％，在每种浓度孵育1小时。
[0168]
透明：在正丁醇∶乙醇＝1∶1中浸泡持续1小时，然后转移至纯正丁醇中持续1小时。
[0169]
上蜡和包埋：在温度比石蜡高3℃的培养箱中，将小鼠肺叶放入熔融的蜡/二甲苯(1∶1)中，且孵育持续1小时，然后移至熔融的石蜡中，再孵育持续3小时，进行两次。将熔融的石蜡倒入石蜡块模具中。将组织放入模具中，等待其冷却(15-20分钟)。
[0170]
切片：在切片机上切片4-10μm厚的石蜡包埋组织块，并将其漂浮在含有去离子水的37℃水浴中。
[0171]
粘贴和烘烤：将切片浮置在干净的玻片上，并在45℃下微波加热持续15分钟，然后组织与玻璃结合，然后在45℃的培养箱中培养至干燥。
[0172]
载玻片脱蜡和水合：在二甲苯中脱蜡，然后逐步改为纯乙醇和纯水。
[0173]
染色：苏木精和伊红染色法是组织学标本染色的常用方法，被称为he染色。he染色后，细胞核被染成紫蓝色，大部分细胞质和非细胞成分被染成玫瑰色。
[0174]
如图10所示，本公开的发明人提供了关于小鼠肺栓塞模型的详细信息(https://doi.org/10.1016/j.ddmod.2011.03.006)。用1.5g/kg的20％脲烷腹腔注射麻醉动物，并通过颈内静脉注射凝血酶(20u/kg)。颈部切口缝合后，未经治疗的小鼠将在10-20分钟内因凝血酶诱导的肺和心脏快速凝血而死亡。μplm酶样品(每次注射100μl)在施加凝血酶后5分钟注入尾静脉。在24小时内处死存活的小鼠，用4％聚甲醛溶液固定肺和心脏组织并石蜡包埋。组织切片由专业生物技术公司biofavor biotech service co.,ltd.制备。为了测量体内半衰期，本公开的发明人将100μl用pbs稀释的每种μplm酶注射到尾静脉中。在指定的时间采集眼部血液，将样品收集到装有抗凝剂的1ml离心管中，所得血浆用于测量μplm酶活性。
[0175]
本公开进一步提供了图17中治疗的死于肺栓塞的小鼠的问题部分，以及表2和表3中治疗的死于肺栓塞小鼠的实验数据。
[0176]
表2、10-17分钟后死于凝血酶的对照组试验小鼠的实验数据。
[0177][0178]
表3、凝血酶处理5分钟后试验组的试验小鼠的试验数据，其中μplm注射拯救了试验小鼠的生命。
[0179][0180]
动物试验可得出以下结论：
[0181]
e-μplm(野生型和phe587ala)可挽救小鼠免于肺栓塞。
[0182]
高浓度e-μplm(野生型和phe587ala)不会导致致命出血。e-μplm治疗后，动物存活良好，而未经治疗的动物在凝血酶处理后约10-20分钟内死亡，原因是凝血酶诱导的肺栓塞。
[0183]
e-μplm的体内半衰期：约3-29分钟，比其他溶栓试剂公开的半衰期短得多(7小时到2-3天，collen,d.,e.b.ong,and a.j.johnson,human plasminogen:in vitro and in vivo evidence for the biological integrity of nh2-terminal glutamic acid plasminogen.thrombosis research.1975；7(4):515-529.)。
[0184]
示例六、来自小鼠血浆试样的e-μplm的半衰期计算
[0185]
根据制造商的说明，使用血浆蛋白活性测量试剂盒(biovision荧光测量)进行所有的活性测量。
[0186]
标准曲线制备：将198μl血浆蛋白稀释缓冲液添加到2μl纤溶酶标准工作溶液中，
制备10ng/ml纤溶酶工作溶液。通过上下吸移混合均匀。将0、5、10、15、20和25μl的纤溶酶工作溶液(10ng/μl)加入96孔板中的一系列孔中，以制备50、100、150、200和250ng/孔的纤溶酶标准溶液。接下来，用纤溶酶测量缓冲液将体积调节至50μl/孔，并用荧光底物进行酶测量，以获得标准曲线。对于μplm酶测量，分别执行标准曲线计算，以获得h-phe587ala模拟曲线，即y＝-0.5575x+32.272，其中相关系数r2为0.9828；以及获得m-μplm male模拟曲线，即y＝-0.0632x+19.293，其中相关系数r2为0.995。
[0187]
测量：在37℃(ex/em＝360/450nm)下以动力学模式测量荧光持续10-20分钟。在曲线的线性范围内选择两个时间点(t1＝408秒和t2＝901秒)，并获得相应的荧光值(δrfu(相对荧光单位)＝rfu2-rfu1)，以制备δrfu对μplm的用量的h-phe587ala模拟标准曲线，即y＝109.09x，其中相关系数r2为0.9948。为了简化实验，m-μplm-male也采用了该模拟曲线，如图20所示，其中如果样本背景对照读数显著，则从样本读数中减去样本背景对照读数。
[0188]
计算：从所有读数中减去背景(或对照)读数。绘制纤溶酶的标准曲线。将样品的δrfu应用于血浆蛋白标准曲线，以获得相应的纤溶酶(b，单位：ng)，并计算样品中纤溶酶的活性如下：
[0189]
样品血浆蛋白活性＝b/v
×
稀释因子＝ng/ml＝μg/l
[0190]
其中b是标准曲线的μplm量(ng)，v是加入反应孔的样品体积(ml)
[0191]
体内半衰期测量系统：2μl血浆+2μl底物+96μl测量缓冲液
[0192]
模拟logc
t
与时间的标准曲线，如图21所示，以获得斜率，并最终获得f587a的体内半衰期：ht
1/2
＝28.52
±
1.05分钟。
[0193]
模拟logc
t
与时间的标准曲线，如图22所示，以获得斜率，并最终获得小鼠野生型μplm的体内半衰期：mt
1/2
＝2.75
±
0.09分钟。

技术特征：
1.一种体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述重组微纤溶酶在细菌宿主表达、纯化，或在表达为不溶性包涵体的情况下能够复性和纯化，生成活性溶栓试剂。2.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，所述重组微纤溶酶的所述体内半衰期是约2.75分钟到约28.5分钟。3.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶包括野生型，gly739ala、arg582ala、met585ala、lys607ala、phe587ala、ser608ala、arg610ala、glu641ala、pro642ala。4.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述重组微纤溶酶包括野生型和突变型。5.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述重组微纤溶酶包括人类微纤溶酶和老鼠微纤溶酶。6.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述重组微纤溶酶是由大肠杆菌表达系统表达和纯化。7.根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶，其中所述重组微纤溶酶选择为对切割和脱毒致病性多肽或不溶性纤维蛋白具有生物活性且也抵抗α2-抗纤维蛋白溶酶抑制。8.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤溶酶作为溶栓试剂，或其药学上可接受的剂型，或所述化合物或剂型的药学上可接受的溶剂化物，且包括药学上可接受的赋形剂。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述大肠杆菌表达的不溶性重组微纤溶酶为溶栓应用被复性和纯化为激活型。10.一种治疗血栓栓塞相关疾病的方法，所述血栓栓塞相关疾病包括缺血性卒中，心肌梗死，深静脉血栓症、外周动脉栓塞病、肺栓塞和导致诸如sars-cov2感染和败血症的各种疾病的系统性凝血，其中所述方法包括对遭受所述血栓栓塞相关疾病的患者施用治疗有效剂量的权利要求8所述的药物组合物，或其药学上可接受的剂型，或所述化合物或剂型药学上可接受的溶剂化物。11.根据权利要求10所述的治疗血栓栓塞相关疾病的方法，其中所述药物组合物通过静脉、导管、皮下、肌肉和气溶胶途径给药。

技术总结
本公开提供了体内半衰期短且体内不稳定的重组微纤维蛋白溶酶(微纤溶酶)，其中重组微纤溶酶可以是突变型和野生型，并且在细菌宿主中表达，能够纯化，或者在表达为不溶性包涵体的情况下可以复性和纯化，从而生成活性溶解血栓试剂。本公开还提供了包含重组微纤溶酶的药物组合物和包括施用该药物组合物的治疗血栓栓塞相关疾病的方法。栓塞相关疾病的方法。栓塞相关疾病的方法。


技术研发人员：蔺新力
受保护的技术使用者：深圳湾实验室
技术研发日：2023.01.04
技术公布日：2023/10/11