用于治疗和预防神经退行性疾病的凝集素蛋白的制作方法

1.本发明涉及一种用于治疗和预防神经退行性疾病的蛋白。


背景技术：

2.神经退行性疾病是一种对神经系统造成进行性不可逆转损害的病症。因此，神经退行性疾病会导致共济失调或痴呆。神经退行性疾病的发病机理的特征在于，细胞外和细胞内淀粉样β蛋白(amyloid beta，aβ)多肽的沉积和tau蛋白的过度磷酸化分别导致了瘟疫(plague)和神经纤维缠结，这导致氧化应激和导致神经炎症；α-突触核蛋白的翻译后修饰(诸如，磷酸化、泛素化和硝化)广泛参与导致路易体形成和多巴胺神经元死亡的α-突触核蛋白聚集过程。除此之外，导致神经退行性疾病的任一途径的任何异常包括：细胞内机理(例如，细胞凋亡、自体吞噬、线粒体功能障碍、氧化dna损伤和修复、泛素蛋白酶体系)；局部组织环境(诸如，细胞黏附、内吞作用、神经传递、朊病毒和传播因子)；全身环境(炎症和免疫功能障碍、脂质、代谢内分泌因子血管变化)以及发育和衰老(例如，表观遗传变化、神经营养因子、端粒)等。
3.痴呆被定义为在多于一个认知领域中的认知障碍，其特征在于，在没有严重意识模糊或运动参与的情况下，丧失足够严重的智能能力来干扰人的职业功能、日常社交活动或关系(sharma和singh等人的2010indian journal of pharmacology vol:42,issue:3；page 164-167)。痴呆涉及的认知领域包括语言(失语症)、运动(失用症)、失认(认知失败)&执行功能(抽象推理、判断和规划)(parris m.kidd；alternative medicine review.2008,vol.13issue 2,p85-115.31p)。痴呆存在许多的类型，包括：阿尔茨海默病，血管性痴呆，路易体痴呆，额颞叶痴呆，与帕金森病、亨廷顿病相关的痴呆，由于脑积水引起的痴呆，韦尼克-科萨科夫综合征和克雅氏病痴呆(husband,a.和worsley,a的2006,the pharmaceutical journal.,277(7426).pp.579-582)。
4.我们的老龄化社会面临着与年龄相关的神经退行性疾病发病率的显著增加(rasalan和kee的2013；genes&genomics volume 35,pages 425
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440)。治疗和非治疗方法(诸如，改变或干预生活方式或适当的饮食)(gurjit等人的2019front aging neurosci.2019；11:369)是治疗神经退行性疾病的可用资源。在治疗方法中，用于治疗或预防神经退行性疾病的常用和批准的治疗剂有胆碱酯酶抑制剂(加兰他敏、多奈哌齐、卡巴拉汀)、美金刚、伊曲茶碱、多巴胺激动剂(普拉克索、阿朴吗啡)、左旋多巴/卡比多巴、单克隆抗体(诸如，达克利珠单抗、那他珠单抗、阿伦单抗)和免疫调节剂(诸如，特立氟胺)。这些药物会导致严重的副作用，诸如抽搐、恶心、头晕、心动过缓、摔倒甚至死亡。
5.因此，迫切需要开发新的有效疗法，这些疗法具有减轻学习和记忆障碍的内在属性并恢复神经生长因子(nerve growth factor，ngf)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，ache)的正常表达水平、以对大脑发挥保护作用，防止诸如阿尔茨海默氏症和帕金森症等疾病。
6.凝集素是碳水化合物结合蛋白，该凝集素广泛存在于植物、动物和微生物中。凝集
素的凝集性提高了其在高级医学研究中的应用。凝集素在神经退行性疾病中的治疗潜力也得到了很好的研究。
7.美国申请20200017578公开了对唾液酸具有结合特异性的凝集素用于治疗神经退行性疾病(诸如，阿尔茨海默病)的用途，该唾液酸诸如是黄蛞蝓凝凝集素(limax flavus agglutinin，lfa)、美洲鲎凝集素(limulus polyphemus agglutinin，lpa)、日本拟青虫凝集素(paecilomyes japonica agglutinin，pja)、龙虾凝集素i(lobster agglutinin i)或单斑对虾凝集素(penaeus monodin lectin)。
8.美国专利8916387描述了一种用于预防、治疗和诊断阿尔茨海默病的方法，该方法基于体液和组织中淀粉样β多肽的糖基化模式。来自槲寄生、朝鲜槐(maackia amurensis)和圆柱竹草菌(agrocybe cylindracea)的凝集素被公开为可以作为药物或诊断剂用于预防和治疗皮质萎缩、神经元缺失、区域特异性淀粉样沉积、神经炎斑块和神经原纤维缠结。还公开了凝集素用于治疗或预防涉及淀粉样β斑块沉积的疾病，其中疾病选自由脑淀粉样血管病和阿尔茨海默病或hiv相关神经认知疾病构成的组。
9.四联素(tetranectin)是人类同源三聚体21kd蛋白，属于c型凝集素家族。研究发现，与正常对照受试者相比，帕金森病患者脑脊液中的四联素水平显著降低，并且四联素通过抑制1-甲基-4-苯基吡啶诱导的神经毒性中的细胞凋亡和自体吞噬而起到神经保护剂的作用(qiang xie等人的2018world neurosurgery volume 122,pages e375-e382)。
10.在现有技术中已很好地确立了使用诸如合成药物或多肽的药剂治疗神经退行性疾病，其中凝集素被用作细胞表面结合剂或递送剂。关于凝集素作为治疗剂用于治疗和预防神经退行性疾病的信息非常有限。在上述研究中，主要探索了用于治疗或预防神经系统疾病的以下凝集素：植物凝集素(诸如，朝鲜槐)、动物凝集素(诸如，单斑对虾-黄蛞蝓(园艺蛞蝓)、美洲鲎)和真菌凝集素(诸如，圆柱竹草菌)。
11.一些本土凝集素作为药物活性剂的结合剂或递送剂的用途是已知的，并且已被报道用于治疗神经退行性疾病(例如us20070243132)。然而，凝集素作为一种治疗剂在治疗或预防神经退行性疾病中的效力还没有被详细的研究。因此，有必要探索和识别有效的凝集素，它可以减轻脑认知障碍且恢复神经营养因子和胆碱酯酶的表达水平，并对神经退行性疾病具有高效的治疗效果。
12.齐整小核菌凝集素(sclerotium rolfsii lectin，srl)是从土传植物病原真菌齐整小核菌菌核体中分离得到的凝集素。srl对汤姆森-佛里奇(thomsen-friedenreich，tf)抗原和tn抗原具有特异性。tf抗原是在不同人类癌细胞表面过表达的二糖(galβ1
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3galnac-α-ser/thr)。tn抗原是单糖(galnac-α-ser/thr)。wo2010/095143公开了重组凝集素变体rec-2和rec-3，它们分别通过取代3或5个氨基酸而衍生自天然srl序列。这些变体的晶体结构已被报道(peppa等人的molecules.2015jun 12；20(6):10848-65)。wo2014/203261公开了一种通过取代12个氨基酸而衍生自天然srl序列的重组凝集素变体。
13.发明目的
14.本发明的目的是开发一种用于预防和治疗神经退行性疾病的新方法。这一新方法标志着一种包括用于预防和治疗神经退行性疾病的新的治疗有效剂的方法。因此，目的是确定新的治疗剂在治疗和预防神经退行性疾病的方法中的用途，其中新的治疗剂是重组凝集素。
15.本发明的另一目的是提供一种用于治疗和预防神经退行性疾病的重组凝集素。因此，目的是提供用于治疗和预防导致痴呆的疾病的重组凝集素。本发明的目的还尤其提供一种用于治疗和预防阿尔茨海默病和帕金森病的重组凝集素。
16.本发明的另一个目的是提供包含用于治疗和预防神经退行性疾病的重组凝集素的组合物。包含用于治疗和预防神经退行性疾病的重组凝集素的组合物也是本发明的目的。


技术实现要素：

17.本发明涉及一种用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌(sclerotium rolfsii)凝集素。
18.本发明还涉及一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
19.本发明还涉及一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
20.本发明涉及重组凝集素蛋白用于治疗或预防神经退行性疾病的用途，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
21.在又一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中该神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。
22.在又一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中神经退行性疾病选自亨廷顿病、诸如克雅氏病(creutzfeld-jacob disease)的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(diffuse lewy body disease，dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(spinal and bulbar muscular atrophy，sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pantothenate kinase-associated neurodegeneration，pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、贝敦氏症。
23.在又一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中该神经退行性疾病选自运动神经元疾病，诸如肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als，也称为卢伽雷病(lou gehrig's disease))、原发性侧索硬化症(primary lateral sclerosis，pls)、进行性球麻痹(progressive bulbar palsy，pbp，als的变型)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫。
24.根据又一个方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。
25.在又一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方
法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中神经退行性疾病选自亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症。
26.在又一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中，神经退行性疾病选自运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症(als，也称为卢伽雷病)、原发性侧索硬化症(pls)、进行性球麻痹(pbp，als的变型)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫。
27.根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中，神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆有关的症状。
28.在又一方面，本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中神经退行性疾病选自亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症。
29.在又一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，其中神经退行性疾病选自运动神经元疾病，诸如肌萎缩侧索硬化症(als，也称为卢伽雷病)、原发性侧索硬化症(pls)、进行性球麻痹(pbp，als的变种)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫。
30.根据本发明的另一方面，提供了重组凝集素蛋白用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的用途，其中重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。
31.在又一方面，提供重组凝集素蛋白用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的用途，其中，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中神经退行性疾病选自亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症。
32.在又一个方面，提供了重组凝集素蛋白用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的用途，其中重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素，并且其中神经退行性疾病选自运动神经元疾病，诸如肌萎缩侧索硬化症(als，也称为卢伽雷病)、原发性侧索硬化症
(pls)、进行性球麻痹(pbp，als的变型)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫，
33.根据本发明的一个方面，提供了一种用于诱导神经元生长物(neuronal outgrowth)的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
34.根据本发明的前述方面，重组凝集素蛋白包括选自
35.i)seq id no.4的氨基酸序列，或
36.ii)与seq id no 4具有至少70％同源性的氨基酸序列。
37.根据本发明的前述方面，重组凝集素蛋白包括与seq id no.4至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列。
38.根据本发明的前述方面，用于治疗或预防神经退行性疾病施用的重组凝集素蛋白的有效量为0.01mg/kg至1000mg/kg受试者体重的范围内。
39.根据本发明的一个特定方面，提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列。
40.根据本发明的另一特定方面，提供了一种治疗或预防神经退行性疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列。
41.根据本发明的又一特定方面，提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的组合物，其中该组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列
42.根据本发明的另一特定方面，提供了重组凝集素蛋白用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的用途，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列。
43.根据本发明的再一特定方面，提供了包含治疗有效量的重组凝集素蛋白的组合物的用途，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列。
44.在本发明的特定方面，提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列，其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏症、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆有关的症状。
45.在本发明的另一特定方面，提供了一种用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列，其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。
46.在本发明的再一特定方面，提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药物上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列，其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆有关的症状。
47.在本发明的再一特定方面，提供了重组凝集素蛋白用于治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的用途，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列，其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏症、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆有关的症状。
48.在本发明的方面，提供了一种用于诱导神经元生长物的方法，其中该方法包括施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的序列。
49.定义
50.本文中使用的术语“凝集素”是指碳水化合物结合蛋白。
51.本文中使用的术语“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。
52.本文所使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基酸相似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸并且包括蛋白氨基酸。天然存在的氨基酸也包括在细胞内翻译后修饰的氨基酸。合成氨基酸包括非标准氨基酸，诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。典型地，合成氨基酸不是蛋白氨基酸。
53.术语“神经”或“神经细胞”是指存在于大脑、中枢和周围神经系统的细胞，包括但不限于神经细胞、胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经干细胞。
54.除非另有说明，否则术语疾病或紊乱可互换使用。“疾病”是其中动物不能保持体内平衡的动物健康状态，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康就会继续恶化。动物中的“紊乱”是其中动物能够保持体内平衡的健康状态，但在该状态下动物的健康状态与在没有紊乱的情况下相比较为不利。术语“疾病”或“紊乱”可互换使用，也可指受折磨的人或与人接触的人的身体或某些器官状态的任何变化、中断或干扰功能的执行、和/或导致症状，诸如不适、功能障碍、痛苦、甚至死亡。疾病或紊乱也可以与瘟热(distemper)、生病(ailing)、微恙(ailment)、痼疾(malady)、紊乱(disorder)、疾恙(sickness)、患病(illness)、病痛(complaint)、不适(inderdisposion)或假恙(affectation)有关。
55.术语“神经退行性疾病”包括神经退行性疾病或紊乱、并且定义为神经组织和/或神经组织功能的功能或结构的渐进性和进行性丧失。这会导致神经细胞损伤甚至死亡的增加。这种疾病或紊乱的可能原因可能是衰老、基因异常或暴露在毒素、化学品或病毒中。有时病因可能是医学状况，诸如酗酒、肿瘤或中风。神经退行性疾病通常会导致身体活动的问题，诸如运动(称为共济失调)、心理功能(称为痴呆)、平衡、说话和呼吸。在某些情况下，它还可能影响心脏功能。根据本发明的神经退行性疾病可以包括但不限于神经元功能失调和/或退化的情况。这些疾病的非限制性示例为：阿尔茨海默病(ad)，帕金森病(pd)，亨廷顿病，痴呆或导致本文列出的多于一种神经退行性疾病的痴呆症状，额颞叶痴呆(frontotemporal dementia，ftd)，由颗粒蛋白前体或tau蛋白中的突变引起的ftd(例如，颗粒蛋白前体缺乏ftld)、额颞叶痴呆的包涵体肌病(frontotemporal dementia with inclusion body myopathy，ibmpfd)，额颞叶痴呆合并运动神经元疾病，肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als，又称卢伽雷病)，肌萎缩侧索硬化症伴痴呆(amyotrophic lateral sclerosis with dementia，alsd)，原发性侧索硬化症(primary lateral sclerosis，pls)，脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)，多发性硬化
症(multiple sclerosis，ms)，诸如克雅氏病(creutzfeld-jacob disease)的朊病毒病，路易体病，弥漫性路易体病(diffuse lewy body disease，dlbd)，聚谷氨酰胺(polyq)-重复病，三核苷酸重复病，脑退行性疾病，早老性痴呆，老年性痴呆，与17号染色体相关的帕金森病(ftdp-17)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy、psp)，进行性延髓性麻痹(progressive bulbar palsy、pbp)，假性麻痹，脊髓和延髓肌肉萎缩(spinal and bulbar muscular atrophy，sbma)，弗里德希氏共济失调(friedreich'sataxia)，小脑共济失调，皮克病，原发性进行性失语症，皮质基底节变性痴呆，hiv相关的痴呆，帕金森病合并痴呆，路易体痴呆，多系统萎缩症，诸如沃德尼格
·
霍夫曼病(werdnig-hoffmann disease)、库格尔伯格韦兰德病(kugelberg-welander disease)或先天性sma合并关节弯曲的脊髓性肌萎缩症，诸如肯尼迪病(kennedy disease)的进行性脊髓球肌萎缩症，脊髓小脑共济失调，泛酸激酶相关的神经退行性疾病(pantothenate kinase-associated neurodegeneration，pank)，脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病，上运动神经元紊乱，下运动神经元紊乱，哈勒沃登-施帕茨综合征(hallervorden-spatz syndrome)，肌萎缩侧索硬化-帕金森综合征-痴呆，关岛型帕金森痴呆，海马硬化，皮质基底节变性，亚历山大病，阿尔珀斯病(apler'sdisease)，克拉伯病(krabbe's disease)，神经性莱姆病(neuroborreliosis)，神经梅毒(neurosyphilis)，桑霍夫病，希尔德氏病(schilder's disease)，贝敦氏症，科凯恩综合症，卡恩斯-赛尔综合征(kearns-sayre syndrome)，吉斯特曼-施特劳斯综合征(gerstmann-straussler-scheinker syndrome)，遗传性痉挛性截瘫，利氏综合征，脱髓鞘病，诸如双相情感紊乱、癫痫、精神分裂症、抑郁症、躁狂症、自闭症、adhd、脑外伤和中风的其他大脑紊乱。
56.本领域技术人员很好地理解，上述所列的“神经退行性疾病”，在非常广泛的意义上可以被归类为“痴呆”，例如包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(皮克病)、路易体痴呆、神经纤维缠绕痴呆等疾病，以及与痴呆、克雅氏病(其临床表现与阿尔茨海默病的临床表现相似)、海马硬化症、希尔德病、血管性(多梗死性)痴呆、亨廷顿病、帕金森氏病合并ad、弥漫性路易体病(dlbd)等相关的病症；“帕金森病和帕金森样疾病”，诸如进行性核上性麻痹(psp)、多系统萎缩(msa)和皮质基底节变性(cbd)；“运动神经元病”可以包括影响上/下运动神经元区域的疾病，例如，肌萎缩侧索硬化症(als)、原发性侧索硬化症(pls)和进行性延髓麻痹(pbp)(als的变型)、假性延髓麻痹和遗传性痉挛性截瘫。这些分类可以基于这些疾病所影响的疾病、器官或身体部位或身体功能的病因或机理，或两种疾病之间的关系。
57.术语“神经保护性”或“细胞保护性”可互换使用，是指保护或防止神经细胞因老化、遗传异常和外部因素(诸如，神经毒素)而引起的异常并恢复神经元的惯常或正常功能。
58.本文可互换使用的治疗剂或治疗有效剂是指向受试者施用、以用于降低或消除疾病或紊乱的一个或多个症状的药剂，其中根据本发明的药剂是重组凝集素、并且疾病或紊乱是神经退行性疾病。
59.本文可互换使用的“神经元生长物”或“神经突”是指神经元细胞体的突起，例如包括轴突或树突。
60.本文使用的术语“调节”是指改变或调节细胞器的生理机制(例如：膜电位)。
61.本文使用的术语“治疗有效量”是足以实现期望的治疗效果的量，其中，治疗益处意味着在治疗或预防一种或多种神经退行性疾病方面的效果。效果是使得受试者免于一种
或多种疾病，或一种或多种疾病的症状得到控制或减轻，或一种或多种疾病的发作或进展得到延缓。治疗有效量可以在一次或多次给药中施用。为了本发明的目的，重组蛋白的治疗有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转、预防、减缓或延缓疾病状态进展的量。
62.本文使用的术语“同源性”或“同源”是指在给定区域或部分上共享至少部分同一性的两个或更多个参考实体。同源性或同一性的区、区域或结构域是指共享同源性或相同的两个或更多个参考实体的部分。因此，当两个序列在一个或多个序列区域上为同一的时，它们在这些区域中共享同一性。实质上的同源性是指在结构上或功能上保守的分子，使得它具有或预计具有参考分子的一个或多个结构或功能(例如，生物功能或活性)的至少部分结构或功能，或具有与其共享同源性的参考分子的相关/对应区域或部分。
63.在一实施方案中，使用具有默认参数的blastp算法来确定两个序列之间的“同源性”百分比(altschul等人的nucleic acids res.1997sep1；25(17):3389-402)。具体地，blast算法可以在互联网上使用网址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi进行访问。在替代实施方案中，对于全局序列比对，使用默认参数、采用emboss needle算法来确定两个序列之间的同源性百分比。具体地，emboss needle算法可以在互联网上使用网址：https://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/进行访问。
64.除非另有说明，否则在本说明书中，术语“同源性”可与术语“序列同一性”互换使用。
65.附图和表的描述
66.图1.在基础模型中seq id no:1对神经元细胞(pc12)中神经突形成的作用的图示
67.图2.针对mpp+诱导损伤seq id no:1对神经元细胞(pc12)中的神经突形成的作用的图示
68.图3：组织病理学图像(h&e染色；100x)
69.表1-针对神经毒素(mpp+)诱导损伤seq id no:1在神经元细胞(sh-sy5y)中的细胞保护作用
70.表2-针对mpp+碘化物损伤seq id no:1在神经元细胞(sh-sy5y)中通过线粒体膜电位的恢复的抗凋亡作用
71.表3-针对mpp+碘化物损伤seq id no:1在神经细胞(sh-sy5y)中通过膜联蛋白阳性细胞群数量的减少的抗细胞凋亡作用
72.表4-针对mpp+碘化物诱导损伤seq id no:1在神经细胞(sh-sy5y)中通过亚(g0/g1)细胞群数量的减少的抗细胞凋亡作用
73.表5：在基础模型中seq id no:1对神经元细胞(pc12)中神经突形成的作用
74.表6：针对mpp+诱导损伤seq id no:1对神经元细胞(pc12)中神经突形成的保护作用
75.表7：seq id no:1对神经元细胞系(sh-sy5y)中阿尔茨海默病相关生物标志物表达的影响
76.表8：seq id no:1对神经元细胞系(sh-sy5y)中帕金森病相关生物标志物表达的影响
77.表9：动物的分配
78.表10：平均传输延迟时间(秒)
79.表11：seq id no:1对脑神经生长因子(ngf)(pg/ml)的影响
80.表12：seq id no:1对脑乙酰胆碱酯酶(mu/ml)的影响
81.表13：seq id no:1对脑部肿瘤坏死因子-α(pg/ml)的影响
82.表14：组织病理学(平均分)
83.序列表征
84.seq id no 4：表示天然的齐整小核菌凝集素氨基酸序列(在wo2010/095143中作为seq id no:1报道)，具有以下序列：
85.tykitvrvyqtnpnaffhpvektvwkyanggtwtitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhnykrwcdivtnlaadetgmvinqqyysqknreearerqlsnyevknakgrnfeivyteaegndlhanliig
86.seq id no.1：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(在wo2010/095143中作为rec-2报道)，具有以下序列：
87.tykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyanggtwtitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhnykrwcdivtnlaadetgmvinqqyysqknreearerqlsnyqvknakgrnfqivyteaegndlhanliig
88.seq id no.2：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(在wo2010/095143中作为rec-3报道)，具有以下序列：
89.vykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyanggtwsitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhnykrwcdivtnlaadetgmvinqqyysqknreearerqlsnyqvknakgrnfqivyteaegndlhanliig
90.seq id no.3：表示齐整小核菌凝集素氨基酸序列的变体(在wo2014/203261中报道)，具有以下序列：
91.vykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyadggtwsitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhdykrwcdivtdlaadetgmvinqeyysekdreearerqnsnyevkdakgrnfeivyteaegndlhadliig
具体实施方式
92.在第一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素，其中该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
93.在本发明的实施方案中，凝集素衍生自包括但不限于真菌和植物的组。在一些实施方案中，凝集素衍生自土壤传播的植物病原真菌，例如齐整小核菌。
94.对于“衍生自”，可以理解的是，凝集素可以从其天然环境分离，或者凝集素包括与天然序列相同或相似的氨基酸序列。
95.该凝集素可以包括与天然序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。天然凝集素可能是从齐整小核菌中分离。
96.该凝集素可以包括与seq id no:4具有至少60％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，凝集素可以包括与seq id no:1、2或3具有至少60％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，该氨基酸序列与seq id no:1、2或3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
97.seq id no:1与seq id no.4具有98％的同源性。seq id no:2与seq id no:4具有96％的同源性。seq id no:3与seq id no:4具有91％的同源性。
98.根据前述任一方面，重组凝集素是如在wo2020/044296(其通过引用结合到本文
中)中定义的修饰凝集素蛋白(即，在分子(优选在碳水化合物结合部位)中具有至少一个氨基酸修饰的重组凝集素蛋白)。
99.根据本发明的一些具体实施方案，凝集素包括选自以下构成的组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3。
100.根据本发明实施方案的一个具体方面，优选使用重组技术合成本发明的凝集素蛋白。用于制备重组蛋白的方法将是本领域技术人员所熟知的。在一个实施方案中，克隆的核苷酸序列编码经修饰的凝集素蛋白，该经修饰的凝集素蛋白接近天然的凝集素氨基酸序列，但提供替代性质。替代地，编码重组凝集素蛋白的核苷酸序列可以用化学或重组方法合成，并在合适的宿主中表达以获得重组蛋白。适合的宿主细胞包括原核细胞以及低等真核细胞和高等真核细胞两者。可以使用本领域已知的方法可以实现将重组分子引入到宿主细胞中。在本发明的示例性实施方案中，合适的宿主是微生物细胞。在优选实施方案中，微生物细胞选自但不限于以下构成的组：酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系。此外，可以通过分离而获得重组蛋白，作为来自重组宿主的表达产物。在一个实施方案中，本发明的重组蛋白通过常规技术、典型地是层析方法来纯化。示例性地，本发明的重组凝集素蛋白可以通过申请人的先前申请wo/2020/074977中公开的方法来制备。
101.在本发明的另一实施方案中，通过sds-page和质谱仪测定的重组凝集素的分子质量为约16,000道尔顿。
102.根据实施方案，本发明提供了用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素，其中该治疗包括减少或消除或降低或减轻神经退行性疾病的体征和症状，并且该预防包括抑制、控制或延迟神经退行性疾病或与疾病相关的症状的发展或发作。
103.根据一些实施方案，神经退行性疾病包括由于大脑或中枢神经系统中及其周围的神经元或神经元细胞退化而引起的疾病或紊乱。
104.神经退行性疾病可能是由于生物标志物水平的增强或降低而引起的，该生物标志物诸如icam-1/cd54、多巴胺、5-羟色胺、s100b、park7/dj-1、钙结合蛋白d、b-ngf、rage、mpo、tau、gdnf、α-突触核蛋白、淀粉样β蛋白、乙酰胆碱酯酶、骨膜蛋白、血管抑素转换酶(angiostatin converting enzyme，ace)、凝血栓蛋白-1、血浆淀粉样β蛋白、ve-钙粘素、lgals3bp(lectin galactoside binding soluble 3binding protein，可溶性半乳糖凝集素3结合蛋白)、tnf-α(肿瘤坏死因子-α)。这些生物标志物的正常水平的增加或减少可能表明被检查的身体中神经退行性疾病的发作或存在。
105.例如，s100b是在帕金森病的发病机理中起着至关重要的作用的钙结合蛋白。在没有帕金森病的正常人中的s100b正常水平为10pg/ml至150pg/ml，而患有帕金森病的人的s100b水平表现出200pg/ml或更高的量。因此，患有帕金森氏症的人类受试者具有增加的s100b水平。
106.根据本发明的方面，重组凝集素蛋白能够降低s100b水平。
107.类似地，根据一方面，本发明的重组凝集素蛋白能够根据身体细胞的需要调节生物标志物的水平，从而治疗或预防疾病的进展。
108.在本发明的一方面，上述标志物可能是导致一种或多于一种神经退行性疾病的原因。本发明的重组凝集素蛋白能够调节这些生物标志物的水平，因此将有效地控制一种或多种疾病的进展或发作。
109.在本发明的一个实施方案中，具有seq id no:1的重组凝集素有助于使神经毒素受损细胞中生物标志物多巴胺和5-羟色胺的水平正常化，从而恢复大脑的认知健康。因为多巴胺和5-羟色胺激素能够向神经细胞传递信号，负责维持睡眠周期、肌肉收缩、情绪功能、运动和自主功能。认知健康是指整个大脑、组织和血液供应的健康、以及它在各种条件下正常运作的能力。良好的认知健康对于大脑执行统称为认知的所有心理过程至关重要，这些认知包括但不限于学习、直觉、判断、语言、注意力、警觉性、注意力和记忆(包括长期和短期)。由于衰老、疾病和/或其他认知损伤而导致的认知健康不良会降低大脑正常运作的能力，导致认知功能和执行的显著下降。一些与认知健康相关的紊乱为恐慌症(panic disorder)、强迫症(obsessive compulsive disorder，ocd)、注意力缺失过动症(attention deficit hyperactivity disorder，adhd)、季节性情感障碍(season effective disorder，sad)、睡眠障碍、记忆丧失或中断、压力和抑郁情绪。在帕金森病的发病机理中，5-羟色胺和多巴胺的正常合成受到很大影响，并导致认知健康紊乱。
110.在本发明的一些实施方案中，提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
111.受试者可能是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，受试者是人类。具体地，受试者可能是患有或试图预防神经退行性疾病的人类受试者。
112.在实施方案中，治疗或预防神经退行性疾病的方法包括施用治疗有效量的重组凝集素，该重组凝集素衍生自齐整小核菌凝集素，其中凝集素的治疗有效量可以在0.01mg/kg至1000mg/kg受试者体重的剂量范围内。在一些实施方案中，剂量范围可以为0.1mg/kg至500mg/kg、或0.5mg/kg至100mg/kg、或1mg/kg至50mg/kg。根据正在治疗的疾病和受试者的性质来确定待施用的凝集素的量将在技术人员的能力范围内。
113.在一些实施方案中，本发明的重组凝集素蛋白可以被这样施用或以药物组合物的形式施用。
114.因此，本发明还提供了一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。示例性赋形剂包括无菌水、生理盐水和/或药学上可接受的缓冲液。
115.该组合物还可以包括蛋白稳定剂、聚合物、增溶剂、冷冻保护剂、冻融保护剂、增稠剂/稀释剂、或它们的混合物。该组合物可以包括申请人共同待决的印度申请第201921027358号中列出的赋形剂，该申请通过引用的方式整体并入本技术中。
116.凝集素蛋白或组合物的施用可以是本领域技术人员所理解的任何合适的途径，包括但不限于：注射(包括静脉注射(推注(bolus)或输注)、动脉内、腹膜内、皮下(推注或输注)、心室内、肌肉内或蛛网膜下)；口服(例如片剂、凝胶、锭剂或液体)；吸入；外用；通过粘膜(诸如口腔、鼻腔或直肠粘膜)；以喷雾、片剂、经皮贴片、皮下植入的形式或以栓剂的形式递送。
117.在一些实施方案中，向受试者以肠内、肠外或外用施用如本文所描述的凝集素(诸如具有seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列的凝集素)或药物组合物。凝集素或药物组合物可以作为固体(诸如片剂或胶囊)、冻干粉、液体(诸如溶液或悬浮液)、半固体或本领域技术人员已知的任何其他形式的剂型施用。可以通过静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注
射或皮内注射、通过积存注射来注射溶液或悬浮液而向受试者施用凝集素或药物组合物，或者凝集素或药物组合物可以鞘内、经皮、舌下施用或通过口服、外用或吸入方法施用。
118.如本领域技术人员所理解的，组合物的适当形式可以由组合物的施用途径来确定。因此，组合物的合适形式可以包括但不限于：静脉(推注或输注)、动脉内、腹膜内、皮下(推注或输注)、心室内、肌肉内或蛛网膜下途径注射；用于口服的片剂、胶囊、凝胶、锭剂或液体；作为吸入喷雾剂的溶液、混悬剂或气雾剂；外用使用的凝胶、喷雾剂或乳膏；经口腔、鼻腔或直肠黏膜给药的经粘膜组合物；以透皮贴剂、皮下植入的形式或以栓剂的形式递送。凝集素蛋白也可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠。对于口腔给药，该组合物可以采取片剂或锭剂的形式。该组合物可以是囊泡药物递送系统(vesicular drug delivery system)，例如但不限于生物体、脂质体、非离子表面活性剂囊泡(niosome)、传递体(transferosome)、醇质体、鞘磷囊体(sphingosome)、药质体、多层脂质体囊泡、微球体等。
119.本发明的组合物可以根据本领域技术人员的理解和知识来配制。
120.在实施方案中，本发明提供了重组凝集素蛋白用于治疗或预防神经退行性疾病的用途，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
121.根据实施方案，可以使用重组凝集素蛋白本身或以包括凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂的组合物的形式使用。
122.在实施方案中，本发明提供了一种通过施用有效量的重组凝集素蛋白来诱导神经元生长物的方法，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。
123.根据本发明，“诱导神经元生长物”表示诱导神经突的生长，其中神经突是来自神经元细胞体的突起。在向需要的受试者施用凝集素蛋白时，本发明的凝集素蛋白能够在神经元中生长神经突。
124.在本发明的一个具体实施方案中，重组凝集素蛋白可以选自具有以下序列的凝集素：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、或seq id no:4。
125.在实施方案中，根据本发明治疗或预防的神经退行性疾病是上文列出的神经退行性疾病。
126.在特定实施方案中，神经退行性疾病可以是但不限于：痴呆，例如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(皮克病)、路易体痴呆、神经纤维缠绕痴呆；以及与痴呆、克雅氏病(其临床表现与阿尔茨海默病的临床表现相似)、海马硬化症、希尔德病相关的症状；帕金森病、帕金森样疾病，诸如进行性核上性麻痹(psp)、多系统萎缩(msa)和皮质基底节变性(cbd)；共济失调，认知障碍，运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症(als)、原发性侧索硬化症(pls)、进行性延髓麻痹(pbp)(als的变型)、假性延髓麻痹和遗传性痉挛性截瘫；动脉瘤、癫痫和亨廷顿病，泛酸激酶相关神经退行性疾病(pkan)卒中、贝敦氏病、吉斯特曼-施特劳斯综合征、cadasil(常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病)、小脑发育不良脑动脉硬化、脑组织缺氧、舞蹈病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病cidp、空洞脑(colpocephaly)、球状胶质细胞tau蛋白病(globular glial tauopathies)、原发性年龄相关tau蛋白病、慢性创伤性脑病(chronic traumatic encephalopathy，cte)、衰老相关的tau星形胶质细胞病、莱伦氏综合征、如弥漫性路易体病(dlbd)的路易体病、如脊髓性肌肉萎缩(sma)的导致神经元状况/丧失的遗传病、三核苷酸重复遗传病、先天性sma合并罕见形式sma的关节弯曲、脊髓-延髓性肌萎缩症(spinal-bulbar muscular atrophy，sbma)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、
原发性进行性失语症(ppa)、亚历山大病、阿尔珀斯病、克拉伯病、桑霍夫病、哈勒沃登-施帕茨综合征(hallervorden-spatz syndrome)和库格尔伯格韦兰德病。
127.在非常特定的实施方案中，神经退行性疾病可以选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状、肌萎缩侧索硬化症(als)、路易体病、脊髓性肌萎缩症和亨廷顿病。
128.在另一非常具体的实施方案中，神经退行性疾病可以选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。
129.本发明涉及使用具有seq id no:4序列的重组凝集素蛋白或其同系物来治疗或预防神经退行性疾病的方法。具有seq id no:1序列的重组凝集素的体外研究表明对存在神经毒素的神经细胞系有显著的积极作用。重组凝集素保护神经细胞免受神经毒素的伤害。类似地，当研究具有seq id no:1序列的重组凝集素对与神经退行性疾病相关的生物标志物的作用时，结果表明凝集素调控的生物标志物在疾病状态下由异常范围变为正常范围。
130.特别是，对帕金森症和阿尔茨海默症或痴呆的几个细胞系执行了体外研究。
131.具有seq id no:1的重组凝集素蛋白的细胞保护作用是通过测定存在神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(mpp+碘化物)的情况下、人神经细胞系sh-sy5y的细胞活力来说明的。测定针对神经毒素诱导的细胞毒性的细胞活力和细胞活力恢复。与浓度为1μm至100μm的丙炔苯丙胺表现出的41％至76％左右的细胞保护作用的阳性对照相比，浓度为0.001μg/ml至50μg/ml的seq id no:1表现出40％至86％的细胞保护作用。
132.通过首先用非细胞毒性浓度的重组凝集素蛋白(具有seq id no:1)处理sh-sy5y细胞系、且随后将细胞系暴露于神经毒素mpp+碘化物来研究细胞保护作用。丙炔苯丙胺作为阳性对照使用。与表现出在79.3％-91.3％之间的范围内的细胞活力的阳性对照丙炔苯丙胺相比，观察到经重组凝集素(具有seq id no:1)处理的帕金森诱导的sh-sy5y细胞的细胞活力增加至78.8％-94.9％之间。
133.评估seq id no:1的作用，以研究对人神经(sh-sy5y)细胞系的抗凋亡作用。1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(mpp+碘化物)用作神经毒素来诱导sh-sy5y细胞系中的帕金森病。分别用三种不同研究、膜联蛋白(annexin)v染色技术、pi染色的亚群g0/g1测定具有seq id no:1的重组凝集素的体外抗细胞凋亡作用。
134.针对mpp+碘化物诱导损伤、通过在sh-sy5y细胞中细胞线粒体膜电位的恢复来评估seq id no：1的重组凝集素蛋白的抗细胞凋亡作用。具有seq id no:1的重组凝集素蛋白在1μg/ml至50μg/ml浓度范围内表现出抗细胞凋亡作用，线粒体膜电位增加了22.7％-115.9％。阳性对照在1μm至100μm浓度范围内表现出线粒体膜电位增加了40％至95％。
135.使用针对神经毒素mpp+碘化物的膜联蛋白阳性染色确定了凋亡细胞的进一步减少。与未经凝集素处理且未暴露于神经毒素的细胞相比，重组凝集素蛋白在0.001μg/ml至1μg/ml的浓度范围内表现出凋亡细胞种群数量从23.5％至70.4％的下降。阳性对照丙炔苯丙胺在10μm至100μm浓度范围内表现出的种群数量从27.2％至38.3％的下降。
136.还通过评价针对神经毒素mpp+碘化物的人神经元(sh-sy5y)细胞系上的亚(g0/g1)细胞群数量来证实seq id no:1的抗细胞凋亡作用。研究表明，与未经凝集素处理且未暴露于神经毒素的细胞相比，浓度在0.001μg/ml至1μg/ml范围内的亚(g0/g1)细胞群数量的凋亡表现出从19％至35％的下降。阳性对照丙炔苯丙胺在10μm至100μm浓度范围内表现
出种群数量数量从13％至42％的下降。通过使用神经元细胞pc12(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)、借助于神经突生长物分析来评估认知健康，进一步验证了具有seq id no:1的重组凝集素的神经保护作用。用神经生长因子(nerve growth factor，ngf)、具有seq id no:1的重组凝集素和mpp+碘化物处理细胞，并检测其神经保护作用。研究表明，具有seq id no:1的重组凝集素具有强大的神经保护性质，因为它在0.0001μg/ml至5μg/ml浓度下帮助mpp+碘化物诱导的细胞损伤中恢复7.3％至78.2％的神经突生长。相反地，仅用ngf和mpp+碘化物处理的细胞在形成神经突方面显示出0％的保护作用。
137.以上研究表明，具有seq id no:1的重组凝集素蛋白具有细胞保护作用，这可以防止神经细胞受到神经毒素的影响，并显著减少细胞中的凋亡。因此，本发明的重组凝集素蛋白在暴露于神经毒素时通过协助神经细胞的活力来预防细胞并因此预防身体疾病的发作。
138.进行了进一步的研究以评估了具有seq id no:1的重组凝集素蛋白对神经突生长的效果。用浓度在0.001μg/ml至5μg/ml的范围内、具有seq id no:1的重组凝集素处理pc12细胞。与未经处理的细胞相比，凝集素表现出的神经突数量从19％增加至55％。本发明的重组凝集素显示出大量的神经突生长物、并且可以用于需要这种治疗的受试者的上述目的。
139.在帕金森病中具有seq id no:1的重组凝集素的作用机理通过多重分析和elisa确定，且评价了标志物的表达水平。测试样品是通过用0.001μg/ml至1μg/ml不同浓度的具有seq id no:1的重组凝集素蛋白处理人神经元(sh-sy5y)细胞24小时、并进一步用神经毒素mpp+碘化物处理以诱导神经元损伤来制备的。
140.研究表明，具有seq id no:1的重组凝集素通过激活神经递质和神经保护信号级联蛋白(诸如多巴胺、5-羟色胺和钙结合蛋白d)来恢复受帕金森病影响的神经细胞，与用mpp+碘化物处理的细胞相比，多巴胺从22.9％增加到82.5％，5-羟色胺从5.1％增加到23.5％，钙结合蛋白d的水平从1.7％增加到9.7％。从好的方面来看，具有seq id no:1的重组凝集素对炎性细胞黏附蛋白(诸如，icam-1/cd54)和钙结合蛋白s100b也有明显的抑制作用，与mpp+碘化物处理的细胞相比，icam-1/cd54水平从6.2％下降至41.3％，钙结合蛋白s100b从6.5％下降至11.4％。然而，在α-突触核蛋白的情况下没有观察到显著的调节。
141.在阿尔茨海默病中具有seq id no:1的重组凝集素的作用机理通过多重分析来说明的。被评估为描述作用机理的生物标志物有b-ngf、rage、mpo、tau。阿尔茨海默病的作用机理是通过用浓度为0.01μg/ml至25μg/ml的、具有seq id no:1的重组凝集素蛋白处理人神经元(sh-sy5y)细胞24小时且进一步用神经毒素处理以诱导神经元损伤来确定的。
142.抑制阿尔茨海默病的具有seq id no:1的重组凝集素蛋白的作用是通过激活和抑制某些生物标志物来评估的，例如与东莨菪碱处理的细胞相比、神经生长因子生物标志物b-ngf的水平从41％增加到89％；被seq id no:1抑制的mpo(metalloperoxidase，金属过氧化物酶)和rage(receptor for advanced glycation end products，晚期糖基化终产物受体)表现出它们的水平分别从46％下降至64％以及从3％下降至19％。对mpo(金属过氧化物酶)和rage(晚期糖基化终产物受体)的抑制表明了重组凝集素对阿尔茨海默病的治疗作用的重要性。由于rage是用作淀粉样β蛋白的受体的免疫球蛋白超家族的多配体表面分子，因此rage对阿尔茨海默病的预后起着至关重要的作用。由于遗传异常引起的rage表达增加导致神经炎症，产生导致氧化应激的活性氧物种。mpo是在诱导细胞因子中起着至关重要的作用的免疫调节蛋白，它主要催化过氧化氢在存在氯化物的情况下转化为次氯酸，从而通过
与生物物种反应而生成氧化加合物。mpo基因异常导致了大脑额叶皮质区域中mpo的过度表达，导致再生。
143.体外研究表明了重组凝集素蛋白对神经退行性疾病具有安全性和治疗有效性。通过在瑞士白化小鼠(swiss albino mice)中使用东莨菪碱诱导的痴呆来确定其体内抗痴呆活性，通过测量被动避免测试中的转移延迟时间、大脑生物标志物水平的变化和大脑海马区组织病理学来进一步验证重组凝集素蛋白的治疗作用。
144.使用被动避免测试确定具有seq id no 1的重组凝集素蛋白对东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤的认知增强作用。与正常对照组g1(即，135.70
±
5.11秒)相比，注射有东莨菪碱的动物组g2的转移延迟时间(即，56.93
±
5.12秒)表现出显著下降(p《0.001)，这表明小鼠的短期记忆障碍。与g2相比，用多奈哌齐(g3，2.5mg/kg)处理的动物的转移延迟时间表现出显著的增加(p《0.001)(即，110.61
±
7.02秒)，这表明通过胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐将东莨菪碱诱导的短期记忆障碍逆转为正常。用具有seq id no 1的重组凝集素蛋白以3个剂量水平处理动物，与g2相比，在记忆方面，组g4(0.5mg/kg)表现出显著的增加(p《0.0 5)(85.26
±
6.52)，组g5(0.25mg/kg)表现出80.58
±
9.08秒的增加，g6(0.125mg/kg)表现出75.81
±
7.75秒的改善。
145.与未处理的动物相比，用多奈哌齐处理的动物转移延迟时间的百分比增加为48.5％。与g2相比，用不同剂量的具有seq id no 1的重组凝集素蛋白处理的动物g4、g5和g6的转移延迟时间分别增加33.2％、29.4％和24.9％。
146.此外，通过elisa评估诸如脑ngf(神经生长因子)、tnfα、乙酰胆碱酯酶(ache)的大脑生物标志物的水平。
147.ngf(神经生长因子)通过抑制camp效应元件结合蛋白(creb，其中camp是环磷酸腺苷)的磷酸化作用而在神经元的可塑性和神经形成中发挥关键作用。受损的creb磷酸化作用是神经退行性疾病的已知病理因素，通过促凋亡过程触发海马区和皮质中的神经元丢失。creb的抑制会损害在各种记忆测试中的行为表现。相反地，creb的过度表达通过胆碱能系统促进神经元存活和改善认知损伤。与正常对照组观察到的水平相比，神经毒素、东莨菪碱处理显著(p《0.001)降低了大脑中ngf表达。然而，与东莨菪碱治疗痴呆组(34.5pg/ml)相比，具有10.5mg/kg和0.25mg/kg不同剂量的具有seq id no:1的重组凝集素蛋白治疗组表现出ngf水平的显著增加(p《0.001)(分别为71.6pg/ml和62pg/ml)。多奈哌齐(阳性对照)治疗组表现出57pg/ml的真假。研究结果表明，具有seq id no：1的重组凝集素蛋白通过激活神经营养因子和防止神经元凋亡来保护或改善学习记忆损伤。此外，评价了研究组中大脑的ache活性。研究表明，东莨菪碱组大脑中ache活性的显着增加(p《0.001)表明所观察到的认知损伤是由胆碱能功能障碍诱导的。然而，用0.5mg/kg具有seq id no:1的重组凝集素蛋白的预处理可以显著(p《0.001)减轻东莨菪碱诱导的这些损伤。ache是一种在学习和记忆中起着关键作用的众所周知的酶。胆碱乙酰转移酶(choline acetyltranferase，chat)是参与乙酰胆碱(acetylcholine，ach)合成的重要胆碱能标志物。ach的维持对于正常功能是必不可少的，而无序的ache活性导致大脑中ach水平的扰乱。乙酰胆碱信号最终导致camp(环磷酸腺苷)效应元件结合蛋白(creb)的磷酸化，creb随后易位到细胞核中以调节靶基因的转录。众所周知，creb在神经元的生长、增殖、分化和存活中起着至关重要的作用。许多研究也强调了creb转录活性与海马体依赖性记忆形成之间的相互关系。
148.用神经毒素东莨菪碱处理的动物的研究组表现出6.74mu/ml的ache水平，而阳性对照(用东莨菪碱和多奈哌齐处理的研究组)表现出4.39mu/ml的ache水平。用东莨菪碱和seq id no:1、在0.5mg/kg下处理的研究组表现出4.47mu/ml的ache水平，在0.25 0.05mg/kg下为6.27mu/m l，以及在0.125mg/kg下为6.59m u/ml。未处理组的ache水平为4.19mu/ml。
149.在进一步的研究中，东莨菪碱诱导的痴呆增加了脑tnf-α的水平，这表明存在轻度到中度的神经炎症。东莨菪碱组显示出脑tnf-α水平的显著(p《0.01)增加，同时具有seq id no:1的重组凝集素在0.5mg/kg(121.7pg/ml)、0.25mg/kg(67.65pg/ml)和0.125mg/kg(79.53pg/ml)剂量水平下显著降低脑tnf-α的含量，这表明抗炎活性。没有用东莨菪碱处理的正常组的tnf-α水平为61.02pg/ml，并且用多奈哌齐和东莨菪碱处理的阳性对照组的tnf-α水平为156pg/ml。
150.对大脑皮层和海马体(ca1、ca3和dg)区h&e(苏木精和曙红)染色的脑组织执行详细的组织学观察。结果显示，除了ca3区之外，所有处理组和东莨菪碱注射组在大脑皮层和海马区均未见明显变化。与正常对照组(0)相比，组g2中海马体ca3区中发现显著(p《0.01)损伤(即，东莨菪碱疾病对照组平均分值为2.0)。与g2相比，多奈哌齐处理组g3中观察到非显著的降低，平均分值为1.33。此外，用0.25mg/kg的具有seq id no：1的重组凝集素蛋白处理的g5组表现出显著(p《0.05)降低(即，平均分值为0.60)，并且组g4(0.5mg/kg的seq id no：1)和组g6(0.125mg/kg的seq id no：1)表现出降低，平均分值分别为0.67和1.00。本领域技术人员已知的是，海马体是大脑中学习和记忆的关键区域。成人海马神经形成在记忆形成中起着重要作用，因此，受损的神经形成和神经元整合被认为是神经退行性疾病的病理特征。因此，具有seq id no：1的重组凝集素蛋白处理可以明显逆转ca3区海马结构中东莨菪碱诱导的神经形成的抑制。已知这种神经形成依赖于神经营养因子及其受体的活性。
151.根据本发明的实施方案，在疾病诱导的动物模型中，衍生自齐整小核菌凝集素的具有seq id no:1重组凝集素蛋白通过神经生长来预防兴奋性毒性引起的神经细胞的凋亡，并且恢复神经元的功能。兴奋性毒性可能由内源性或外源性有毒物质引起，它是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(als)、痴呆等神经退行性疾病的关键机理。兴奋性毒性是神经递质的过度激活，主要通过影响线粒体功能而导致神经细胞的严重损伤，进而导致氧化应激。钙离子的过度流入也可能是神经元缺失的机理之一。其结果是，神经细胞失去其功能并因细胞凋亡而退化。因此，具有seq id no：1的衍生自齐整小核菌凝集素的重组凝集素蛋白具有用于治疗或预防神经退行性疾病(诸如阿尔茨海默病、帕金森、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(als)、痴呆)的疗效，重组凝集素蛋白通过恢复线粒体膜电位、调节某些生物标志物的表达水平来防止神经细胞的凋亡，这些生物标志物在神经元的功能中发挥关键作用并有助于神经元生长。
152.在本发明实施方案的另一方面，衍生自齐整小核菌凝集素的凝集素蛋白表现出治疗有效性，并且在预防和治疗诸如阿尔茨海默氏症、帕金森症和痴呆或与痴呆相关的症状方面是有效的。在疾病诱导的模型中，凝集素进一步在神经突生长物和认知功能恢复方面表现出有效性。
153.实施例：
154.给出下面实施例以说明了本发明的最佳执行模式。实施例不以任何方式限制本发
明。
155.sh-sy5y-细胞系衍生自sk-n-sh人神经母细胞瘤细胞的亚克隆细胞系。它用作神经退行性疾病的模型，因为细胞可以通过添加特定的化合物来修改为各种类型的功能神经元。因此，sh-sy5y细胞系的这一属性使它们成为实验神经学研究的合适模型，这些研究包括分析与神经退行性变过程、神经毒性和神经保护相关的神经元分化、代谢和功能。人神经细胞系sh-sy5y购自普纳的国家细胞科学中心(national centre for cell science，nccs)。
156.sh-sy5y细胞系保持在dmem：ham's f12(1：1)+10％fbs生长培养基，在5％co2、37℃、95％湿度条件下生长。通过将细胞悬液分到新鲜烧瓶中并用新鲜的培养液补充来继代培养该细胞系。
157.pc-12，细胞肾上腺嗜铬细胞瘤(pc12)细胞系最初是从大鼠肾上腺髓质中分离的。pc12细胞具有合成和储存多巴胺和在神经生长因子(ngf)分化后类似交感神经节神经元的能力，这使其成为帕金森病的合适模型。大鼠嗜铬细胞瘤细胞pc12购自美国的美国菌种保藏中心(american type culture collection，atcc)。
158.pc12细胞系保持在ham's f12+10％fbs生长培养基，在5％co2、37℃、95％湿度条件下生长。通过将细胞悬液胰蛋白酶化并分到新鲜烧瓶中、以及用新鲜的培养液补充来继代培养该细胞系。
159.提供了具有seq id no：1序列的重组凝集素蛋白的水溶液。将原液在无血清培养基(serum free medium，sfm)中稀释，以达到最终浓度。
160.实施例1：评价seq id no：1对神经元细胞的细胞保护作用对帕金森病的有益作用
161.使用以下试验进行seq id no：1对sh-sy5y神经元细胞的细胞保护作用。
162.人神经元sh-sy5y细胞用血细胞计数仪计数、以25,000个细胞/孔的密度接种于96孔板中并在37℃温育24小时。在温育后，用浓度为0.001μg/ml至50μg/ml的具有seq id no：1的重组凝集素蛋白处理细胞24小时。在处理24小时后，将细胞暴露于神经毒素(mpp+碘化物，1mm)24h。用mpp+碘化物单独处理的细胞作为阴性对照。温育未处理的细胞作为对照。用丙炔苯丙胺(1μm-100μm)处理的细胞为阳性对照。处理后，seq id no：1对细胞活力的细胞保护作用通过用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(mtt)测定来评估：取出孔板，向所有孔中加入20μl的5mg/ml的mtt 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物溶液。将sh-sy5y细胞在37℃下温育3h，抽吸上清液，向各孔中加入150μl的dmso以溶解形成甲瓒晶体。使用synergy ht微孔板检测仪在540nm处读取各孔的吸光度。seq id no：1对sh-sy5y细胞针对mpp+碘化物诱导损伤的保护作用如下测定：细胞活力如下测定：
163.细胞活力％＝(100-％细胞毒性)；
164.其中，每种处理对应的细胞毒性百分比如下计算：
165.细胞毒性％＝[(r-x)/r]*100
[0166]
x＝用mpp+碘化物/具有seq id no:1的重组凝集素+mpp+碘化物处理的细胞的吸光度
[0167]
r＝对照细胞(未处理)的吸光度
[0168]
保护百分比如下计算：
[0169]
[(seq id no:1+mpp+碘化物的吸光度)-(mpp+碘化物的吸光度)/(未处理的吸光
度)-(仅mpp+碘化物的吸光度)]*100
[0170]
表1
–
具有seq id no：1的重组凝集素对神经元细胞(sh-sy5y)针对神经毒素(mpp+)诱导损伤的细胞保护作用
[0171][0172][0173]
实施例2：评价具有seq id no:1的重组凝集素在神经元细胞中的抗凋亡作用对帕金森病的有益作用
[0174]
使用以下试验测定评价具有seq id no:1的重组凝集素在神经元细胞中的抗凋亡作用对帕金森病的有益作用：
[0175]
实施例2a：具有seq id no: 1的重组凝集素对线粒体膜电位的作用的测定
[0176]
用血细胞计数仪计数细胞并将细胞以密度为25000个细胞/孔接种于黑孔、96孔板中的完整培养基。将接种的细胞在37℃下5％co2的温育箱中温育过夜。24小时后，用浓度为1μg/ml至50μg/ml范围内的具有seq id no:1的重组凝集素处理细胞24小时。处理24h后，将细胞暴露于损伤(mpp+碘化物1mm)中24h。仅用mpp+碘化物处理的细胞作为阴性对照。温育未处理的细胞作为对照。用丙炔苯丙胺处理的细胞作为阳性对照。mpp+碘化物暴露后，具有seq id no:1的重组凝集素蛋白对线粒体膜电位的保护作用通过如下jc-1试验测定；温育后丢弃上清液，向各孔加入100μl的jc1-染液(通过将1mm dmso原液稀释至10μm的1xpbs制备)。然后将细胞与染料在37℃的co2温育箱中温育15min。温育15min后，去除上清液，用1xpbs(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞两次。最后，向各孔加入100μl的1xpbs。用biotek synergy ht板检测仪测量红色荧光(激发波长550nm，发射波长600nm)和绿色荧光(激发波长485nm，发射波长535nm)。如下通过红色荧光强度与绿色荧光强度的比计算线粒体膜电位(δψm)：
[0177]
δψm＝红色荧光强度/绿色荧光强度
[0178]
针对mpp+碘化物损伤的线粒体膜电位的增加/恢复百分比如下计算：
[0179]
增加％＝[(r-x)/r]*100
[0180]
其中x＝对应于seq id no:1+mpp+碘化物处理的细胞的δψm
[0181]
r＝对应于对照细胞(仅mpp+碘化物损伤)的δψm
[0182]
表2-针对mpp+碘化物损伤seq id no：1在神经元细胞(sh-sy5y)中通过恢复线粒体膜电位的抗凋亡作用
[0183][0184]
实施例2b：具有seq id no：1的重组凝集素对膜联蛋白-v染色的作用的测定
[0185]
温育后，用浓度为0.001μg/ml至1μg/ml范围内的具有seq id no：1的重组凝集素处理细胞24小时。处理24h后，将细胞暴露于损伤(mpp+碘化物1mm)中24h。仅用mpp+碘化物处理的细胞作为阴性对照。温育未处理的细胞作为对照。用丙炔苯丙胺处理的细胞作为阳性对照。处理后，通过胰酶消化获取细胞并如下处理细胞以用于膜联蛋白v试验：将细胞轻轻地收到预先标记的无菌离心管中，在300x g下离心5-7min。处理24h后，将细胞暴露于损伤(mpp+碘化物1mm)中24h。仅用mpp+碘化物处理的细胞作为对照。未处理的细胞作为阴性对照。用丙炔苯丙胺处理的细胞作为阳性对照。处理后，通过胰酶消化获取细胞并如下处理细胞以用于膜联蛋白v试验：将细胞轻轻地收到预先标记的无菌离心管中，在300x g下离心5-7min。弃去上清液并将沉淀物重悬浮在200μl的新鲜培养基中。将100μl的细胞悬液转入预先标记的无菌离心管中，向各管加入100μl的膜联蛋白-v试剂，在黑暗中rt下温育30min。然后将膜联蛋白-v染色的细胞转移到96孔板上，并在流式细胞仪(guava technologies)上获得。测定膜联蛋白-v阳性细胞百分比。
[0186]
凋亡细胞抑制百分比＝[(仅mpp+碘化物中膜联蛋白阳性细胞％)-(具有seq id no:1的重组凝集素+mpp+碘化物中膜联蛋白阳性细胞％)/仅mpp+碘化物中膜联蛋白阳性细胞％]*100
[0187]
表3
–
针对mpp+碘化物损伤seq id no：1在神经细胞(sh-sy5y)中通过减少膜联蛋白阳性细胞群数量的抗细胞凋亡作用
[0188][0189]
实施例2c：针对mpp+碘化物诱导损伤seq id no：1在神经元细胞(sh-sy5y)
[0190]
中通过减少亚(g0/g1)细胞群数量的抗细胞凋亡作用
[0191]
在如实施例2a和实施例2b中温育后，通过胰酶消化获得细胞并如下处理以用于细胞周期分析：细胞周期试剂含有pi染色剂，该pi染色剂对处于细胞周期的不同阶段的细胞进行dna染色；亚(g0/g1)阶段的亚(g0/g1)、g1、s、g2和m细胞对应于凋亡细胞。
[0192]
将细胞轻轻地收到预先标记的无菌离心管中，在室温(低制动)下、在450x g下离心5min。将上清液小心地去除并丢弃。向沉淀物加入1ml的1x pbs，轻轻重悬浮、以制成均一悬浮液。在rt(低制动)下、在450g下离心细胞5min。将上清液小心地去除，留下约100μl的pbs。细胞被轻轻但彻底地重悬浮在残留的pbs中。向各管的细胞中滴加冰冻的70％乙醇(100μl)来固定细胞，同时低速旋转细胞，在4℃下保存24h，然后染色。
[0193]
乙醇固定的细胞在450g下离心5min，在室温(低制动)下，将上清液小心去除(不要接触沉淀物)并丢弃。向沉淀物加入1ml的1x pbs，且轻轻悬浮。在rt下温育细胞1min。在rt(低制动)下、在450g下离心细胞5min。(洗涤步骤)将上清液小心地去除，留下约20μl-50μl的pbs。向各管中加入200μl的细胞周期试剂。将细胞轻轻地重悬浮并混合。在室温下、黑暗中将细胞温育30min。将染色的细胞转移到96孔板上并在流式细胞仪(guava technologies)上获得。测定亚(g0/g1期)阶段细胞百分比。
[0194]
凋亡细胞抑制百分比＝[(仅mpp+碘化物中亚(g0/g1)细胞％)-(seq id no:1+mpp+碘化物中亚(g0/g1)细胞％)/仅mpp+碘化物中亚(g0/g1)细胞％]*100
[0195]
表4
–
针对mpp+碘化物诱导损伤seq id no：1在神经元细胞(sh-sy5y)中通过减少亚(g0/g1)细胞群数量的抗细胞凋亡作用
[0196][0197]
实施例3：通过体外神经突生长物测试评价seq id no:1对帕金森病的认知健康的作用
[0198]
采用以下方法研究神经突生长物对帕金森病的认知健康的作用：
[0199]
实施例3a：在基础模型中seq id no:1对神经元细胞(pc12)中神经突形成的作用
[0200]
用血细胞计数仪计数细胞，将细胞以密度相当于1
×
104个细胞/孔/500μl培养液接种于24孔板中。然后将细胞在37℃的5％co2温育箱中温育48h。在基础损伤诱导模型和mpp+损伤诱导模型中评价具有seq id no：1的重组凝集素对神经突形成的作用。
[0201]
对于基础模型，神经突形成的百分比增加如下测定
[0202]
增加％＝[(经处理的细胞中神经突的数量-未处理细胞中神经突的数量)/未处理的细胞中神经突的数量]x 100
[0203]
表5：在基础模型中seq id no：1的重组凝集素蛋白对神经元细胞(pc12)中神经突形成的作用
[0204][0205]
实施例3b：针对mpp+诱导损伤seq id no：1对神经元细胞(pc12)中神经突形成的保护作用
[0206]
神经突形成过程中对mpp+诱导损伤的保护百分比如下测定：
[0207]
{(a-b)/(c-b)}*100
[0208]
其中，
[0209]
a＝用ngf+seq id no：1+mpp+处理的细胞中的神经突数量：
[0210]
b＝用ngf+mpp+处理的细胞中神经突数量
[0211]
c＝仅用ngf处理的神经突细胞数
[0212]
表6：针对mpp+诱导损伤具有seq id no：1的重组凝集素蛋白对神经元细胞(pc12)中神经突形成的保护作用
[0213][0214]
实施例4：通过细胞系的多重分析培养和维持来说明具有seq id no：1的重组凝集素蛋白在帕金森和阿尔茨海默病中的作用机理
[0215]
a.通过多重分析/elisa检测标志物
[0216]
与前面的实施例一样，在过夜温育后，对于帕金森病，在0.001μg/ml至1μg/ml的不同浓度范围、用具有seq id no：1的重组凝集素蛋白处理细胞24小时；对于阿尔兹海默病，在0.01μg/ml至25μg/ml的不同浓度范围、用具有seq id no：1的重组凝集素蛋白处理细胞24小时。
[0217]
·
帕金森病：在用具有seq id no：1的重组凝集素蛋白预处理24小时后，将细胞暴露(mpp+)24小时。用mpp+碘化物处理的细胞作为对照。以丙炔苯丙胺处理的细胞作为阳性对照。
[0218]
·
阿尔茨海默病：在用具有seq id no：1的重组凝集素蛋白预处理24小时后，将细胞暴露于东莨菪碱(4mm)24小时。用东莨菪碱处理的细胞作为对照。用加兰他敏处理的细胞作为阳性对照。
[0219]
如下通过多重分析确定标志物水平：用标准稀释液稀释(1：2)细胞培养上清液。向各孔加入50μl的标样或样品。向微孔板的各孔中加入50μl的微粒混合物，并用锡箔板密封器覆盖。该孔板在水平轨道微板振动器上室温温育2小时。使用专门为容纳微板而设计的磁性装置清洗孔板。通过将磁铁施用到微板底部、等待1min后去除液体，用洗涤缓冲液(100μl)填充在各孔、等待1min后再次去除液体完成洗涤。向各孔加入50μl稀释生物素抗体混合物。用锡箔板密封器覆盖孔板，在振动器上在室温下温育1小时。重复了洗涤步骤。向各孔加
入50μl稀释的链霉亲和素-pe。用箔板密封器牢牢地覆盖孔板并在振动器上在室温温育30分钟。重复洗涤步骤。通过向各孔加入100μl的洗涤缓冲液，将微粒重新悬浮。将孔板在振动器上温育2分钟，并使用多重机器(multiplex machine)在90分钟内读取。使用多重机器评估帕金森病和阿尔茨海默病的生物标志物水平。
[0220]
对于帕金森病，每个样本中的调节百分比如下确定：
[0221]
[{seq id no:1+mpp+碘化物处理的细胞中生物标志物浓度(pg/ml))-对照细胞(仅mpp+碘化物处理)中生物标志物的浓度(pg/ml)}/对照细胞(mpp+碘化物处理)中生物标志物的浓度(pg/ml)]*100
[0222]
对于阿尔兹海默病，每个样本中的调节百分比如下确定：
[0223]
变化％＝[(对照细胞中的生物标志物的浓度-对照细胞中生物标志物的浓度)/对照细胞中分析物的浓度]x 100
[0224]
结果：
[0225]
表7：具有seq id no：1的重组凝结素蛋白对神经元细胞系(sh-sy5y)中阿尔茨海默病相关生物标志物表达的作用
[0226][0227]
表8：具有seq id no：1的重组凝结素蛋白对神经元细胞系(sh-sy5y)中帕金森病相关的生物标志物表达的作用
[0228]
[0229][0230]
体内研究：
[0231]
实施例5：具有seq id no:1的重组凝集素蛋白：
[0232]
在无菌tris缓冲液(tbs)中将具有seq id no:1的重组凝集素蛋白所需的量稀释以获得所需的最终浓度(即，在0.50mg/kg、0.25mg/kg和0.025mg/kg的剂量下分别为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.125mg/kg)。制剂是每天新鲜准备的。
[0233]
将参考药物-盐酸多奈哌齐悬浮在0.5％na-cmc中，以得到最终浓度为0.25mg/ml(剂量：2.5mg/kg；剂量体积：10ml/kg)
[0234]
用tbs缓冲液和0.5％cmc作为载体分别制备测试项，具有seq id no：1的重组凝集素和参考项制剂。
[0235]
雄性小鼠(瑞士白化)，8-10周龄，购自海得拉巴gentox bio services pvt公司。动物分为6组，驯化2周。动物通过笼标记和尾巴标记进行识别并根据它们的体重进行随机化。
[0236]
选取健康雄性swiss albino小鼠48只，根据体重随机分为6组，每组8只，如表1所述。对照组g1每天静脉注射载体，直至实验结束。组g2为阴性对照，用载体处理。组g3以2.5mg/kg剂量口服标准复方盐酸多奈哌齐。组g4、g5和g6动物分别以0.50mg/kg、0.25mg/kg和0.125mg/kg剂量、用测试项具有seq id no：1的重组凝集素蛋白来处理。所有测试项均以5ml/kg剂量每日静脉(i.v.)滴注14天。在整个实验期间每天记录体重。在整个研究过程中观察所有动物的临床体征。测试项最后一次给药后1h(第14天)，除正常对照组g1外，其余所
有动物均以2.5mg/kg(i.p.)的剂量注射氢溴酸东莨菪碱。注射东莨菪碱30min进行被动避免测试。
[0237]
表9：动物的分配
[0238][0239]
实施例5a：被动避免测试
[0240]
学习和记忆测试是在两个室进行的，这两个室具有方形盒、相同大小、并置有照明和黑暗。灯被放置在一个室的上方以供照明。每项测试包括两个独立的试验，一个是训练试验，一个是测试试验。
[0241]
在训练试验中，小鼠最初被放在照明室里。当小鼠进入暗室时，通过不锈钢棒递送0.5ma的电击3秒。用内置计时器记录小鼠从亮室进入暗室的延迟时间。在训练试验后进行测试试验24小时，并测量重新进入暗室的延迟时间长达5分钟
[0242]
表10：平均转移延迟时间(秒)
[0243][0244]
实施例5b：脑的收集及脑生物标志物的评价
[0245]
经被动避免测试筛选记忆模型后，动物被人道处死。整个大脑被小心地从头骨上取出并称重。大脑被解剖成两部分
[0246]
大脑的一部分：
[0247]
将10％w/v(100mg/ml)脑匀浆通过在冰冻的磷酸盐缓冲液中匀浆来制备。匀浆随后用冷冻离心机以3000rpm的速度离心10分钟，并分离上清液用于生化评估。
[0248]
下列生物标志物按生产厂家说明书用elisa试剂盒进行评估。
[0249]
·
脑ngf(神经生长因子)，cusabio，目录号csb-e04684m
[0250]
·
乙酰胆碱酯酶，cusabio，目录号csb-e17521m
[0251]
·
tnfα，cusabio，目录号csb-e04741m
[0252]
表11：seq id no:1对脑神经生长因子(ngf)(pg/ml)的影响
[0253]
组平均semg1；正常对照；载体74.223.29g2；氢溴酸东莨菪碱(s)+载体34.492.38g3；s+盐酸多奈哌齐572.38g4；s+seq id no:1；0.5mg/kg71.597.44g4；s+seq id no:1；0.25mg/kg61.962.6g4；s+seq id no:1；0.125mg/kg38.622.3
[0254]
表12：seq id no:1对脑乙酰胆碱酯酶(mu/ml)的影响
[0255]
组平均semg1；正常对照；载体4.190.29g2；氢溴酸东莨菪碱(s)+载体6.740.36g3；s+盐酸多奈哌齐4.380.4g4；s+seq id no:1；0.5mg/kg4.470.45g4；s+seq id no:1；0.25mg/kg6.270.44g4；s+seq id no:1；0.125mg/kg6.590.26
[0256]
表13：seq id no:1对tnf-α(pg/ml)的影响
[0257]
组平均semg1；正常对照；载体61.026.72g2；氢溴酸东莨菪碱(s)+载体143.9925.05g3；s+盐酸多奈哌齐155.8114.99g4；s+seq id no:1；0.5mg/kg121.7323.65g4；s+seq id no:1；0.25mg/kg67.655.91g4；s+seq id no:1；0.125mg/kg79.5311.63
[0258]
实施例5c：组织病理学
[0259]
人道处死后收集小鼠脑，并将其固定于10％中性缓冲福尔马林中。然后，脑组织被修剪、处理并包埋在石蜡中。在载玻片上制作5微米切片以作为用于苏木精-伊红(h&e)染色的样本。通过显微镜以100x放大率评估海马区损伤。
[0260]
结果：
[0261]
通过h&e染色的脑组织执行详细的组织学观察。根据神经元损伤进行评分。组织病理学评估结果显示，除ca3区外，大鼠大脑皮层和海马区中所有处理组和东莨菪碱注射组均没有观察到明显变化。组织病理学评分的分级标准为：正常或无损伤-0；罕见神经元损伤(《5簇)-1；偶发性神经元损伤(5
–
15簇)-2；频繁神经元损伤(》15簇)-3；弥漫性神经元损伤-4。
[0262]
表14：组织病理学(平均分值)
[0263]

技术特征：
1.一种用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，所述重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。2.根据权利要求1所述的重组凝集素蛋白，其中，所述重组凝集素蛋白选自seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、或具有与seq id no.4至少70％同源性的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的重组凝集素蛋白，其中，所述氨基酸序列具有与seq id no.4至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。4.根据权利要求1所述的重组凝集素蛋白，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍、与痴呆相关的症状、亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症、如肌萎缩侧索硬化症(als，又称卢伽雷病)的运动神经元疾病、原发性侧索硬化症(pls)、进行性球麻痹(pbp)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫，所述进行性球麻痹为als的变型。5.根据权利要求4所述的重组凝集素蛋白，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。6.根据前述权利要求中任一项所述的重组凝集素蛋白，其中，用于治疗或预防所述神经退行性疾病而施用的重组凝集素蛋白的有效量为0.01mg/kg至1000mg/kg受试者体重的范围内。7.一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的重组凝集素蛋白和药学上可接受的赋形剂，所述重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。8.根据权利要求7所述的用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。9.一种治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组凝集素蛋白或根据权利要求7所述的药物组合物，所述重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌且具有seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3的序列。10.根据权利要求11所述的治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中，所述氨基酸序列具有与seq id no.4至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。11.根据权利要求11所述的治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍、与痴呆相关的症状、亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症、如肌萎缩侧索硬化症(als，又称卢伽雷病)的运动神经元疾病、原发性侧索硬化症(pls)、进行性球麻痹(pbp)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫，所述进行性球麻痹为als的变型。12.根据权利要求11所述的治疗或预防受试者中的神经退行性疾病的方法，其中，所述
神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。13.根据权利要求10所述的治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括以0.01mg/kg至1000mg/kg的剂量施用重组凝集素蛋白。14.重组凝集素蛋白在制备用于治疗或预防神经退行性疾病的药物中的用途，其中，所述重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌凝集素。15.根据权利要求20所述的用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，所述氨基酸序列具有与seq id no.4至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。16.根据权利要求20所述的用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍、与痴呆相关的症状、亨廷顿病、诸如克雅氏病的朊病毒病、路易体病、弥漫性路易体病(dlbd)、聚谷氨酰胺(polyq)-重复病、大脑退行性疾病、脊髓和延髓肌肉萎缩(sbma)、共济失调、皮克病、原发性进行性失语症、多系统萎缩、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(pank)、脊髓退行性疾病/运动神经元退行性疾病、海马硬化症、皮质基底节变性、贝敦氏症、如肌萎缩侧索硬化症(als，又称卢伽雷病)的运动神经元疾病、原发性侧索硬化症(pls)、进行性球麻痹(pbp)、假性球麻痹和遗传性痉挛性截瘫，所述进行性球麻痹为als的变型。17.根据权利要求20所述的用于治疗或预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。18.一种用于在受神经退行性疾病影响的受试者中诱导神经元生长物的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的重组凝集素蛋白，所述重组凝集素蛋白具有seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3的序列，其中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、认知障碍和与痴呆相关的症状。

技术总结
本发明涉及一种用于治疗和预防神经退行性疾病的凝集素蛋白。本发明还涉及一种用于治疗和预防神经退行性疾病的重组凝集素蛋白，该重组凝集素蛋白衍生自齐整小核菌、且具有与SEQ ID NO:4的60％同源性的序列。本发明具体涉及一种用于治疗或预防帕金森症、阿尔茨海默病、痴呆以及痴呆症状的凝集素蛋白及其变体，该凝集素蛋白及其变体衍生自齐整小核菌凝集素、具有与SEQ ID NO:4的60％的同源性。NO:4的60％的同源性。


技术研发人员：萨万纳库玛
受保护的技术使用者：联合化学实验室有限公司
技术研发日：2022.01.05
技术公布日：2023/10/11