LASP1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用

lasp1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医用领域，尤其涉及一种lasp1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用。


背景技术：

2.脊髓损伤的病理过程极为复杂，重建神经元之间缺失的联系是损伤修复的核心问题，也是神经科学领域一直以来的备受困扰的难题。目前治疗策略研发方向主要围绕在保护幸存神经元及促进再生修复两方面进行。但发育成熟后的中枢神经系统轴突再生十分困难，一直是制约中枢神经损伤修复的难点。现有解剖学证据表明：在非完全性脊髓损伤动物模型中，部分脊髓固有神经元损伤后断裂的轴突可发出新的侧枝绕过损伤区域与下游靶细胞建立联系；此外，幸存的皮质脊髓束、网状脊髓束及红核脊髓束可在一定程度上通过发出新的侧枝（出芽）与下游靶细胞建立连接，在一定程度上促使运动及感觉功能的恢复。而且由于亚急性期及慢性期胶质细胞反应性增生形成胶质瘢痕以及非神经细胞（包括周细胞及成纤维细胞等）增生，在损伤中心形成致密的空间屏障，断裂轴突继续生长直接跨越损伤部位十分困难。因此，断裂轴突或幸存轴突发出新的侧枝与损伤下游靶细胞重新建立联系是脊髓损伤修复的重要方式。迄今为止，人们仍不能充分理解轴突侧枝形成过程中关键的分子活动。阐明轴突侧枝形成的关键分子机制，可为实现对轴突侧枝形成的可控提供精细的干预靶点，以充分发挥轴突再生潜能，促进脊髓损伤后神经环路重塑及功能的恢复。
3.lasp1最先是在乳腺癌患者液淋巴结中鉴定出的表达上调的基因，对多种肿瘤细胞的迁移及侵袭至关重要。lasp1是典型的结构域蛋白，含有lim、neubulin repeat及sh3三个结构域。其蛋白n端为lim结构域，由八个半胱氨酸和组氨酸形成特有的锌指结构。紧接其后为伴肌动蛋白（neubulin repeat，nr）结构域，介导其与f-actin（纤维肌动蛋白）结合，其对微丝稳定性的影响目前尚不明确。蛋白c端为sh3结构域，对细胞运动变形至关重要。在神经系统中，lasp1发育中及成熟的大脑组织中均有表达。lasp1在轴突中主要定位于生长锥与轴突侧枝形成处，过表达lasp1可显著促进轴突侧枝的形成及轴突生长。需要注意，轴突生长及再生过程的结构基础为细胞骨架的运动，但目前为止lasp1在脊髓损伤中的作用尚未报道，且lasp1如何介导轴突生长的作用机制仍不清楚。
4.spastin是从遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia，hsp）病人皮质脊髓束中所发现的突变基因。spastin是一类微管切割蛋白，spastin功能缺失导致hsp病人皮质脊髓束退变，使病人下肢运动功能障碍，行走步态呈“剪刀状”。spastin是一类微管切割蛋白，在生理条件下通过适当切割微管增强微管动态性，促进神经元轴突生长及再生。明确spastin在生理状态下的作用功能模式对其应用于脊髓损伤十分关键。lasp1蛋白是否通过调控spastin的微管切割能力介导轴突生长及脊髓损伤修复目前尚不清楚。
5.目前为止，虽已有证据表明脊髓损伤后幸存轴突可通过发出新的侧枝绕过损伤部位与损伤下游神经元建立突触联系，但神经元轴突侧枝形成的机制尚不清楚。lasp1可有效促进轴突侧枝形成，但其在脊髓损伤修复过程中的作用仍尚未明确，并且其如何促进轴突
侧枝形成的机制也尚未可知。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提出一种lasp1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用，以解决现有技术中脊髓损伤修复治疗过程中轴突侧枝难以形成的问题，同时提供了一种新的脊髓损伤修复的治疗靶点。
7.本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：本发明一方面提供了一种lasp1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复或促进脊髓损伤修复的药物或药物组合物中的应用。
8.本发明另一方面提供了一种lasp1蛋白在制备促进神经元轴突侧枝形成的药物或药物组合物中的应用。
9.本发明另一方面提供了一种lasp1蛋白在制备提高轴突侧枝形成处spastin微管切割能力的药物或药物组合物中的应用。
10.本发明另一方面提供了一种lasp1蛋白在制备提高spastin蛋白治疗敏感性的药物中的应用，所述治疗敏感性为对脊髓损伤修复的治疗敏感性。
11.进一步的，所述脊髓损伤为急性脊髓损伤。
12.进一步的，所述spastin为m87 spastin。
13.本发明另一方面提供了一种用于检测脊髓损伤或评估脊髓损伤严重程度的检测试剂或检测试剂盒，包括检测lasp1蛋白表达水平的试剂。
14.进一步的，所述检测lasp1蛋白表达水平的检测试剂包括检测lasp1蛋白含量的试剂，所述检测lasp1蛋白含量的试剂选自lasp1的单克隆抗体和/或多克隆抗体。所述单克隆抗体和/或多克隆抗体可通过市售获得。
15.本发明另一方面提供了一种筛选用于治疗脊髓损伤修复的药物的方法，包括如下步骤：（1）将候选药物作用于脊髓损伤动物模型；（2）通过检测脊髓损伤动物模型体内lasp1蛋白的表达水平，从而获得目标药物；当候选药物使得lasp1蛋白表达水平增加时，即为目标药物。
16.本发明的突出效果为：本发明通过研究发现lasp1为脊髓损伤修复过程中的重要蛋白。首先通过免疫印迹及免疫荧光等试验，发现lasp1蛋白在脊髓损伤急性期内的神经元内表达显著上调。lasp1蛋白在神经元轴突内定位于轴突侧枝形成处并招募spastin至轴突侧枝形成处以促进轴突侧枝进一步生长。进一步通过免疫共沉淀实验发现lasp1与spastin相互作用形成蛋白复合体。而且，在神经元中过表达lasp1可明显促进神经元轴突侧枝的形成，而此时需要spastin的参与。本发明明确了lasp1蛋白是脊髓损伤修复过程中的关键蛋白，主要作用为促进脊髓损伤后神经元轴突侧枝形成处的微管切割，促进轴突侧枝进一步生长以修复脊髓损伤，为临床治疗脊髓损伤提供了切实的科学依据。
17.以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中脊髓损伤后不同时期时损伤部位lasp1的蛋白水平结果图；图2为本发明实施例1中脊髓损伤后不同时期时损伤部位lasp1的蛋白水平的定量分析结果图；图3为本发明实施例1中脊髓损伤后组织切片lasp1抗体及βiii-tubulin抗体进行孵育的荧光染色结果图；图4为本发明实施例2中lasp1招募spastin至轴突侧枝形成处的结果图；图5为本发明实施例3中lasp1与spastin相互作用的结果图；图6为本发明实施例4中lasp1通过招募spastin促进神经元轴突侧枝形成的结果图；图7为本发明实施例4中lasp1通过招募spastin促进神经元轴突侧枝形成的侧枝数量的定量分析图。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限本发明。
20.本发明上下文中所使用的的试剂均可通过市售获得。本发明所提及的有关lasp1蛋白及spastin蛋白的基因序列均可通过常规手段获得（如ncbi、genebank）获得。本发明所使用的实验方法如分子克隆、western blot、细胞实验及动物实验等均为本领域的常规方法和技术。对于动物实验，相关程序及方法符合医学伦理要求。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。
21.生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的均数
±
标准差展示。所有实验至少重复三次。实验数据采用graphpad prism 8.4进行统计分析。采用卡方检验、方差分析等常规医学统计方法比较各组的平均值差异。检验值p＜0.05表明差异具有统计学意义。
22.实施例1：lasp1蛋白在脊髓损伤修复中的作用首先建立小鼠脊髓损伤模型构建，具体包括以下步骤：（1）实验小鼠（c57bl/6n）采用2,2,2-三溴乙醇（0.2 ml/10 g）腹腔注射进行麻醉，待充分麻醉后进行俯卧位固定；（2）以 t10棘突为中心剪除毛发，常规消毒铺巾切开皮肤，分离肌肉，暴露 t9-11 棘突和椎板。在体视显微镜下，咬除 t10棘突及椎板，暴露该节段脊髓；（3）用稳定器将t10切面双边固定，控制冲击头的氮气罐设置为18psi或124kpa。将u型稳定器装载至路易斯维尔损伤系统设备（lisa）的平台上，并直接在撞击器下方调节硬脊膜/（脊髓上界）高度，同时通过激光束进行监测；（4）将碰撞深度调整为1.8mm，时间设置为0.5 s，启动撞击程序；（5）损伤后，将稳定器从平台上拆下，将小鼠从稳定器中移出，评估受伤部位，并抑制出血，最后使用3.0丝线缝合小鼠的肌肉和皮肤。
23.通过观察小鼠双下肢活动情况初步筛选造模成功的脊髓损伤模型。假手术的动物接受t10全椎板切除术，但未损伤脊髓。
24.利用上述构建的小鼠t10脊髓损伤模型，在损伤1 d, 3 d, 7 d, 14 d及30 d时再次打开椎管，取出受伤节段（1 cm）进行western blot实验，分析lasp1蛋白水平，结果如图1所示。图2为图1的lasp1蛋白水平变化的定量分析结果，结果表明脊髓损伤后组织中lasp1蛋白表达水平在急性期显著上调。
25.应用上述模型，在脊髓损伤急性期（7 d）时获取脊髓样品，逐步脱水后制成石蜡切片（横切），并用lasp1抗体及βiii-tubulin抗体进行孵育，随后用荧光二抗及dapi进行染色，随后置于激光共聚焦下进行观察，检测结果如图3所示，脊髓损伤后组织切片中lasp1蛋白升高，并且升高的部分与神经元分布具有高度的一致性。该实验结果进一步说明lasp1蛋白在脊髓损伤急性期蛋白表达水平增加。
26.实施例2：lasp1在轴突内定位于侧枝形成处并招募spastin至该部位 （1）在显微镜下分离海马组织后，采用2 mg/ml木瓜酶（溶于dmem-f12）进行消化；（2） 加入10% fbs的dmem-f12培养基中终止消化，轻柔翻转5次，静置1 min；（3）加入2 ml 10%fbs的dmem-f12培养基，震荡海马组织10次，随后静置1 min后收取上清；（4）重复操作2-3次，充分收集神经元；（5）将神经元接种至pdl包被的玻片上，培养箱37℃下孵育30 min；（6）缓慢加入500 ul含有10%fbs的dmem-f12培养基；（7）4 h后洗去培养基，加入nb27神经元培养液；（8）待细胞长至2 d时进行免疫荧光染色；（9）采用快速封闭液对玻片进行封闭，随后采用lasp1及spastin抗体进行过夜孵育。
27.（10）洗去一抗后用相应的荧光二抗进行染色。
28.（11）采用带有荧光的鬼笔环肽对神经元进行孵育2 h。
29.（12）在载玻片上滴上荧光封片剂，将玻片倒置扣于封片剂上，晾干。
30.（13）于激光共聚焦显微镜下观察lasp1及spastin的蛋白分布情况，并摄取图片。其中鬼笔环肽（蓝色）可示踪f-actin，以标记新生的侧枝。结果如图4所示，lasp1在轴突内集中分布于侧枝形成处，而spastin分布在轴突干内，且集中分布于lasp1所在的轴突侧枝形成处。
31.实施例3 ：lasp1与spastin在体外发生相互作用为进一步明确lasp1是通过招募spastin促进轴突侧枝形成处的微管动态，进一步在体外验证lasp1与spastin是否发生相互作用。首先我们构建lasp的真核表达质粒，并转染至hek293t细胞中进行免疫共沉淀实验验证lasp1与spastin在细胞内发生相互作用。具体实施步骤如下：1、构建gfp-lasp1与flag-spastin的真核表达质粒：（1）从genebank获取lasp1及spastin的基因序列；（2）设计相关引物并采用pcr以小鼠cdna为模板，通过pcr获得lasp1及spastin的基因片段；
（3）采用琼脂糖凝胶对lasp1及spastin基因进行纯化；（4）将基因片段及已经酶切好的pegfp-c1及pcmv-tag-2b载体进行连接（同源重组）；（5）将基因片段转化至bl21/dh5α细菌中，扩增后收集细菌并纯化质粒。
32.2、将gfp-lasp1与flag-spastin分别或同时转染至hek293t细胞中，并获取细胞蛋白裂解液进行western blot检测。具体步骤如下：（1）培养hek293t细胞，待细胞密度为80%-90%，对细胞进行传代，并种植与六孔板中，继续培养24h；（2）将纯化好的gfp-lasp1及flag-spastin等质粒通过lipofectamine 2000转染试剂将其转染至hek293t细胞中，并继续表达48 h；（3）转染后在荧光显微镜下观察gfp荧光的亮度，以判断蛋白表达的含量及转染是否成功。确认蛋白充分表达后获取细胞；（4）采用细胞裂解液（碧云天）冰上裂解细胞，充分裂解后进行离心，15000 rpm，15min，取上清即为蛋白裂解液，用于后续的免疫共沉淀实验；（5）本例中免疫共沉淀的实施采用gfp-trap beads进行。将gfp标签抗体加入细胞裂解液中4℃翻转孵育过夜；（6）首先采用细胞裂解液（lysis buffer）清洗gfp-trap beads，随后将gfp-trap beads与蛋白裂解液进行孵育，2 h，离心（2000 rpm，2min）获取沉淀，沉淀加入loading buffer后进行煮沸（100℃，10 min），得到gfp-lasp1相互作用蛋白。沉淀物经western blot检测。结果如图5所示，结果表明，lasp1蛋白能与spastin发生相互作用。
33.实施例4：lasp1显著促进轴突形成新侧枝并且需要spastin的参与将实施例2中的方法获取原代海马神经元进行体外培养，待神经元生长至第2天采用钙磷转染法将lasp1质粒及spastin sirna单独或共同导入神经元内，观察神经轴突侧枝的生长情况。具体步骤如下：（1）原代神经元培养步骤参照实施例2；（2）待神经元生长至第2天时，使用磷酸钙转染试剂盒将lasp1及spastin sirna导入至神经元内。首先将钙磷转染试剂盒中的b溶液及c溶液进行解冻，向ep管中分别加入1 μg gfp、gfp-spastin质粒和25 μl cacl2溶液，另取一个ep管加入bbs溶液；（3）按每孔25μl b溶液及25 μl c溶液的标准进行磷酸钙溶液配置。在c溶液中加入lasp1、gfp或si-spastin等基因，充分混匀；（4）将c溶液在旋涡震荡的情况下逐滴加入b溶液中，轻柔摇晃数次，避光静置15 min；（5）将配置好的磷酸钙溶液加入至neurobasal培养的神经元中，培养箱孵育40 min；（6）用1
×
sa溶液清洗钙磷颗粒2次后，加入原培养基（250 μl），并加入新鲜的nb27培养基，孵育24 h。
34.（7）在荧光显微镜下观察神经元的转染情况，并使用4% 多聚甲醛固定细胞，于激光共聚焦显微镜下观察gfp信号，并摄取图片；结果如图6所示，lasp1可显著促进神经元轴突侧枝的形成，并且此过程需要spastin的参与，表明lasp1通过spastin促进神经元轴突侧
枝的形成及进一步生长。图7为图6轴突侧枝形成数量的定量分析，其中*为p＜0.05，具有统计学意义。
35.由于脊髓损伤至致残的主要原因，修复脊髓损伤引起的神经组织缺陷对现代再生医学至关重要。因此，基于本发明的研究可以设计出多种药物及干预措施以协助脊髓损伤的修复。
36.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种lasp1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复或促进脊髓损伤修复的药物或药物组合物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脊髓损伤为急性脊髓损伤。3.一种lasp1蛋白在制备促进神经元轴突侧枝形成的药物或药物组合物中的应用。4.一种lasp1蛋白在制备提高轴突侧枝形成处spastin微管切割能力的药物或药物组合物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述spastin为m87 spastin。6.一种用于检测脊髓损伤或评估脊髓损伤严重程度的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于：包括检测lasp1蛋白表达水平的试剂。7.根据权利要求6所述的一种用于检测脊髓损伤或评估脊髓损伤严重程度的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于：所述检测lasp1蛋白表达水平的检测试剂包括检测lasp1蛋白含量的试剂，所述检测lasp1蛋白含量的试剂选自lasp1的单克隆抗体和/或多克隆抗体。8.一种筛选用于治疗脊髓损伤修复的药物的方法，包括如下步骤：（1）将候选药物作用于脊髓损伤动物模型；（2）通过检测脊髓损伤动物模型体内lasp1蛋白的表达水平，从而获得目标药物；当候选药物使得lasp1蛋白表达水平增加时，即为目标药物。

技术总结
本发明公开了一种LASP1蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用。本发明首先通过免疫印迹及免疫荧光等试验，发现LASP1蛋白在脊髓损伤急性期内的神经元内表达显著上调。LASP1蛋白在神经元轴突内定位于轴突侧枝形成处并招募spastin至轴突侧枝形成处以促进轴突侧枝进一步生长。进一步通过免疫共沉淀实验发现LASP1与spastin相互作用形成蛋白复合体。而且，在神经元中过表达LASP1可明显促进神经元轴突侧枝的形成，而此时需要spastin的参与。本发明明确了LASP1蛋白是脊髓损伤修复过程中的关键蛋白，主要作用为促进脊髓损伤后神经元轴突侧枝形成处的微管切割，促进轴突侧枝进一步生长以修复脊髓损伤，为临床治疗脊髓损伤提供了切实的科学依据。了切实的科学依据。了切实的科学依据。


技术研发人员：林宏生 柳求灵 陈天俊 纪志盛
受保护的技术使用者：暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）
技术研发日：2023.09.06
技术公布日：2023/10/15