环六肽化合物在制备抗炎药物中的应用

1.本发明属于天然药物技术领域，具体涉及环六肽化合物在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.微生物具有生长周期短、代谢易于调控、菌种较易选育和可通过大规模发酵实现工业化等特点，具备自然资源的可持续利用性，是药物研究的主要研究对象，海洋微生物多样性远超陆地微生物，海洋高压、高盐、低温、低光照、寡营养等特点，使海洋微生物产生于陆地生物不同的防御体系和代谢系统，能产生化学特异性、结构新颖性和活性多样性的代谢产物，是海洋药物的重要来源，也是研究的热点之一。
3.肽类小分子，具有多种生物活性、特异性强、易吸收、靶向性强和副作用小等特点，是近年来生物医药研究的热点之一，在临床上有着广泛的应用。海洋微生物也是肽类小分子的重要来源，近年来国内外学者从海洋微生物获得了多个具有开发潜力的小分子肽类化合物，部分化合物已经进入临床研究。抗炎活性是肽类小分子化合物的重要研究方向。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供环六肽化合物scleramide或其药用盐在制备抗炎药物中的应用，所述的化合物scleramide的结构式如式(ⅰ)所示：
[0005][0006][0007]
进一步的，所述的化合物scleramide是从曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的发酵培养物中分离获得的。具体步骤如下：制备曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的发酵培养物，将发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后得到乙酸乙酯相粗浸膏；粗浸膏经硅胶柱层析和半制备hplc纯化后，得到化合物scleramide。
[0008]
所述的发酵培养物是通过以下方法制备：将曲霉菌aspergillus sp.bh6-7接入种子培养基中，振荡培养，获得种子培养液，将种子培养液再接种到sws寡营养培养基中，静态发酵获得发酵培养物。
[0009]
所述的种子培养基的配方为：麦芽浸膏15g，精海盐10g，蒸馏水1000ml，ph 7.4-7.8；所述的sws寡营养培养基的配方为：淀粉10g，精海盐10g，蒸馏水1000ml。
[0010]
本发明的第二个目的是提供一种抗炎药物，其包含如式(ⅰ)所示的化合物scleramide或其药用盐作为活性成分，还包含药学上可以接受的辅料或载体。
[0011]
优选的，所述药物的剂型为注射给药剂型、透皮给药剂型或口服给药剂型。
[0012]
本发明具有以下有益效果：
[0013]
本发明从一株北部湾海洋珊瑚共附生真菌曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的发酵培养物中分离获得的一个环六肽化合物scleramide，该该化合物scleramide能够抑制no的释放，下调il-6、tnf-α和mcp-1，上调il-4、il-10等细胞因子，有效地抑制炎症表达，并且可明显上调m2型巨噬细胞标志arg1的表达，促进m2极化，且无细胞增毒性。在相同浓度下，对raw264.7细胞无细胞毒活性，表明该化合物scleramide可以作为抗炎药物开发的先导化合物，对开发利用我国海洋微生物药物资源具有重要意义。
[0014]
曲霉菌aspergillus sp.bh6-7于2020年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号：gdmcc no：61220。
附图说明
[0015]
图1为化合物scleramide的x-ray结构。
[0016]
图2为抗炎活性筛选结果；a：一氧化氮释放量数据结果；b：抗炎基因表达下调因子结果；c：抗炎基因表达上调因子结果；d：炎症因子elisa结果。图中的hte7表示化合物scleramide。
具体实施方式
[0017]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018]
实施例1:化合物scleramide的制备和结构鉴定
[0019]
一、化合物scleramide的制备
[0020]
1.微生物培养条件：
[0021]
将曲霉菌aspergillus sp.bh6-7接入到含有10ml种子培养基的三角瓶(100ml)中，25℃，178rpm摇床震荡培养3d获得种子液，将10ml种子液分别转接于装有sws寡营养培养基的锥形瓶(1000ml)中，自然光照下，于25℃静止培养3个月，共发酵60l，获得曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的发酵培养物。所述的种子培养基为ma培养基，其配方为：麦芽浸膏15g，精海盐10g，蒸馏水1000ml，ph 7.4-7.8，配制步骤为：将各成分溶于水，搅拌混匀，调节ph，灭菌即得。sws寡营养培养基的配方为：淀粉10g，精海盐10g，蒸馏水1000ml，配制步骤为：将各成分与水混合，搅拌混匀，灭菌即得。
[0022]
2.提取分离：
[0023]
菌株bh6-7在sws寡营养培养基中经过3个月长时间培养，hplc分析发现代谢产物主要以目标产物为主。发酵液经过等体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相粗浸膏，浓缩后合并以上乙酸乙酯部分得总粗浸膏(15.6g)，粗浸膏采用中压色谱进行分离，用100～200目硅胶拌样，正相柱硅胶为300～400目装填，流动相为二氯甲烷：甲醇(v:v＝99:1～0:100，流速30ml
·
min-1
)梯度洗脱，通过薄层色谱法(tlc)检识合并得6个馏分。其中fr.2(二氯甲烷：甲醇＝19:1～9:1洗脱馏分)经反相中压色谱(ods)以流动相为甲醇：水(v:v＝
40:60～100:0，流速15ml
·
min-1
)梯度洗脱，根据mplc-紫外检测器210nm波长出峰情况接取洗脱液，获得5个子馏分，子馏分fr.2-4(甲醇：水＝70:30～90:10洗脱馏分)经半制备柱高效液相(v
meoh
:v
h2o
＝70:30，流速3.0ml
·
min-1
)使用ymc ods半制备柱(ymc-pack ods-a,250
×
10mm i.d.,s-5μm,12nm)，柱温27℃，进一步纯化得到化合物1(344mg，tr＝23min)
[0024]
二、化合物的结构鉴定
[0025]
化合物1为白色固体，1h和
13
c nmr数据(表1)观察到的32个碳信号，显示化合物1含有7个酰胺碳基、6个酰胺nh质子、2个n-甲基和3个苯基信号，推测化合物1是一个多苯基环状肽类化合物。通过和文献(j.nat.prod.2000,63,1006-1009.)比对，确定化合物1为scleramide，并最终通过x-ray确定了化合物1的构型和结构。
[0026]
化合物scleramide的x-ray结构见图1所示。
[0027]
表1化合物scleramide的1h(500mhz)和
13
c(125mhz)nmr数据(dmso
3-d6)
[0028]
[0029][0030]
化合物scleramide的结构式如下式(ⅰ)所示：
[0031]
[0032]
实施例2：化合物scleramide的抗炎活性检测
[0033]
一、实验操作步骤
[0034]
1.griess法检测待测化合物对raw26.7细胞no的影响
[0035]
收集96孔板中生长状态良好的raw264.7细胞，计数106个细胞/ml，接种至六孔板。待细胞生长至80％融合，空白组(control)给予不完全培养基(dmem培养基)，lps组给予含lps(0.1μg/ml)的不完全培养基，给药组给予含lps(0.1μg/ml)及待测化合物(10μmol/l、5μmol/l、1μmol/l)的不完全培养基，对照组给予含lps(0.1μg/ml)及l-nmma(100μmol/ml)的不完全培养基，每孔100μl，设置8个复孔，培养细胞24h。培养结束后，按照griess试剂盒说明书检测上清液中no含量。
[0036]
2.elisa试剂盒检测待测化合物对raw264.7细胞促炎因子水平的影响
[0037]
收集12孔板中生长状态良好的raw264.7细胞，计数106个细胞/ml，接种至六孔板。待细胞生长至80％融合，空白组(control)给予不完全培养基，lps组给予含lps(0.1μg/ml)的不完全培养基，给药组给予含lps(0.1μg/ml)及待测化合物(10μmol/l)的不完全培养基，每孔1ml，设置2个复孔，培养细胞24h。培养结束后，收集上清，用合适的稀释倍数稀释上清，按照elisa试剂盒说明书检测上清中mcp-1、tnf-a、il-6的含量。
[0038]
3.rt-pcr检测巨噬细胞m1/m2极化状态相关子的基因表达水平
[0039]
收集生长状态良好的raw264.7细胞，计数106个细胞/ml，接种至六孔板。待细胞生长至80％融合，空白组(control)给予不完全培养基，lps组给予含lps(0.1μg/ml)的不完全培养基，给药组给予含lps(0.1μg/ml)及待测化合物(10μmol/l)的不完全培养基，每孔2ml，设置3个复孔，培养细胞24h。收集细胞，按trizol试剂盒说明书提取细胞总rna检测mrna转录水平。
[0040]
3.1总rna提取
[0041]
氯仿-酚抽提：六孔板每孔加入500μl trizol试剂，冰上静置5min。吹匀细胞使之充分裂解，收集至1.5ml ep管中，每管加100μl氯仿，涡旋30s以上，冰上孵育10min。离心，13000rpm，20min，4℃。此时1.5ml ep管中液体分为三层，rna存在于上层无色水相中。
[0042]
rna沉淀：收集上层无色水相于另一个干净的1.5ml ep管中，每管加入250μl异丙醇，-20℃孵育10min。离心，13000rpm，20min，4℃。此时rna沉淀在管底。
[0043]
rna清洗：弃上清，每管加入200μl depc water配制的75％乙醇清洗rna，离心7500rpm，5min；重复一次；室温晾5min。
[0044]
rna溶解：用80μl depc water溶解rna。
[0045]
浓度测定：取2μl rna于nanodrop2000紫外分光光度计中测rna浓度(μg/μl)。rna浓度在1.8～2.0μg/μl之间表示rna质量良好，可用于下面的实验。
[0046]
3.2反转录合成cdna
[0047]
严格按反转录试剂盒操作。20μl反应体系(5x anmix pcr 4μl；rna及depc water共16μl)：按照测定的rna浓度在八联管中加入相应体积的rna及depc water使rna质量在3～5μg范围内，总体积为16μl，再加入4μl 5x anmix pcr。反应条件为(42℃15min；85℃5s)。结束后用200μl ddh2o稀释cdna。
[0048]
3.3real-time pcr
[0049]
引物设计：
[0050]
表3raw264.7巨噬细胞胆固醇流出相关mrna oligo序列
[0051][0052]
3.4real-time pcr检测
[0053]
严格按照试剂盒说明书进行操作，用abi 7500system测定mrna的相对表达量。采用20.4μl反应体系(前置引物0.5μl；后置引物0.5μl；2x transtop qpcrmix 10μl；dyeii 0.4μl；ddh2o 6μl；cdna 3μl)进行测定。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，64℃退火延伸30s，共40个循环。循环基线设定值(ct值)为检测器软件默认值。每个样本重复测定3次。
[0054]
二、实验结果
[0055]
采用griess法检测化合物scleramide对raw264.7细胞no的影响，elisa试剂盒检测化合物scleramide对raw264.7细胞促炎因子水平的影响，rt-pcr检测化合物scleramide对巨噬细胞极化状态相关因子的基因表达水平。实验结果表明化合物scleramide能够抑制no的释放(图2a)，下调il-6、tnf-α和mcp-1(图2b)，上调il-4、il-10等细胞因子的水平(图2c)，有效地抑制炎症表达，并且可明显上调m2型巨噬细胞标志arg1的表达，促进m2极化，且无细胞增毒性(图2d)。在相同浓度下，对raw264.7细胞无细胞毒活性。以上结果表明化合物scleramide可以做为抗炎药物开发的先导化合物，对开发利用我国海洋微生物药物资源具有重要意义。
[0056]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.如式(ⅰ)所示的化合物scleramide或其药用盐在制备抗炎药物中的应用；2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物scleramide是从曲霉菌aspergillussp.bh6-7的发酵培养物中分离获得的。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的化合物scleramide的制备步骤具体为：制备曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的发酵培养物，将发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后得到乙酸乙酯相粗浸膏；粗浸膏经硅胶柱层析和半制备hplc纯化后，得到化合物scleramide。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养物是通过以下方法制备：将曲霉菌aspergillus sp.bh6-7接入种子培养基中，振荡培养，获得种子培养液，将种子培养液再接种到sws寡营养培养基中，静态发酵获得发酵培养物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基的配方为：麦芽浸膏15g，精海盐10g，蒸馏水1000ml，ph 7.4-7.8；所述的sws寡营养培养基的配方为：淀粉10g，精海盐10g，蒸馏水1000ml。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的曲霉菌aspergillus sp.bh6-7的保藏编号为gdmcc no：61220。7.一种抗炎药物，其特征在于，包含如式(ⅰ)所示的化合物scleramide或其药用盐作为活性成分；8.根据权利要求7所述的抗炎药物，其特征在于，还包含药学上可以接受的辅料或载体。
9.根据权利要求7所述的抗炎药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射给药剂型、透皮给药剂型或口服给药剂型。

技术总结
本发明公开了环六肽化合物在制备抗炎药物中的应用。本发明从曲霉菌Aspergillus sp.BH6-7的发酵培养物中分离得到如式(Ⅰ)所示的环六肽化合物scleramide。本发明证明，化合物scleramide能够抑制NO的释放，下调IL-6、TNF-α和MCP-1，上调IL-4、IL-10等细胞因子，有效地抑制炎症表达，并且可明显上调M2型巨噬细胞标志Arg1的表达，促进M2极化，且无细胞增毒性。在相同浓度下，对RAW264.7细胞无细胞毒活性，表明该化合物scleramide可以作为抗炎药物开发的先导化合物，对开发利用我国海洋微生物药物资源具有重要意义。药物资源具有重要意义。药物资源具有重要意义。药物资源具有重要意义。


技术研发人员：杨斌 周雪峰 陶华明 刘永宏 庞小艳 王俊锋 廖升荣
受保护的技术使用者：中国科学院南海海洋研究所
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/10/15