鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体及其制备方法。


背景技术：

2.血管内皮生长因子（英文：vascular endothelial growth factor，简称：vegf），早期亦称作血管通透因子（英文：vascular permeability factor，简称：vpf)，是对血管内皮细胞具有特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。
3.人的vegf蛋白是于1989年由美国的两间生物科技公司分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明vpf与vegf是同一基因编码的同一蛋白。vegf有六个等型（isoforms）：vegf-a，
ꢀ‑
b，
ꢀ‑
c，
ꢀ‑
d， 及-e；其分子量从35至44kda不等，每个等型特异性地与三个“血管内皮生长因子受体”（vegfr-1，
ꢀ‑
2， 及-3)的特定组合相结合。其中每种因子作用各不相同，但都与促进血管及淋巴管等人体脉管的生成与分化相关。
4.vegf是高度保守的同源二聚体糖蛋白。二条分子量各为24kda的单链以二硫键组成二聚体。vegf分解的单体无活性，去除n 2糖基对生物效应无影响，但可能在细胞分泌中起作用。由于mrna不同的剪切方式，分别产生出vegf121、vegf145、vegf165、vegf189、vegf206等至少5种蛋白形式，其中vegf165 作为血管生成的直接效应分子，在血管系统的収育和分化中起至关重要的作用，在多种实体瘤中高表达，介导其丰富的血管形成。
5.vegf检测的临床意义：1. 肿瘤的早期筛查：肿瘤的生长、转移十分迅速，当肿瘤细胞团向实体肿瘤转化过程中，肿瘤细胞会产生大量vegf，促进新生血管的生成，此时多为肿瘤tis期和t1期，是肿瘤早期筛查的最佳时期，并可通过现有的临床手段予以确诊。早期筛查可提高肿瘤患者的生存率，延长生存时间。
6.2. 肿瘤的广谱性筛查：只要有血管新生趋势变化，就伴随vegf浓度变化。vegf可筛查几乎所有实体肿瘤，它的广谱性是其他检测指标不可代替的。
7.3. vegf可用于肿瘤临床诊断和预后评估：临床上很多恶性肿瘤疾病缺乏特异性的肿瘤标志物，例如肾癌等。而由于vegf的广谱性、敏感性使得通过血液检测vegf就可辅助诊断这类恶性肿瘤疾病。同时，根据vegf的水平变化可反映肿瘤的发展程度，对肿瘤的预后可作出判断。一般而言，同一种恶性肿瘤，vegf水平越高，肿瘤恶性程度也越高，预后相对较差。
8.vegf作为肿瘤检测标志物有如下优势：vegf在癌症发生的早期即可发现，对肿瘤早期发现具有重要意义；vegf是广谱性肿瘤标志物，适用于各种肿瘤的筛查和检测；vegf可联合其他肿瘤标志物检测提高诊断的准确性；灵敏度高，vegf的最低检测限为pg级，分析灵敏度为目前肿瘤标志物中最高。
9.人血管内皮生长因子vegf165和小鼠血管内皮生长因子同源性为64.4%，具有很高的免疫原性，可以用于制备诊断用单克隆抗体。
10.开发性能优异的vegf免疫诊断试剂的核心原料是鼠抗vegf单克隆抗体，单克隆抗体以vegf165为免疫原，其他四种亚型vegf121、vegf145、vegf189、vegf206蛋白作为筛选原，筛选高亲和力的单克隆抗体同时，还需要确保单克隆抗体不仅能识别vegf165，也能识别其他四种亚型，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度，对于肿瘤早期筛查，临床诊断和预后评估具有很大的临床意义。


技术实现要素：

11.为解决市面上鼠抗vegf单克隆抗体质量良莠不齐的问题，本发明提供了高亲和力的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体。能够识别免疫原，还能识别其他亚型的筛选原，该抗体性能优异、准确性高。
12.同时提供抗体的人血管内皮生长因子化学发光测定试剂盒，通过血液检测vegf，为肿瘤的早期筛查提供依据。
13.本发明提供如下技术方案：鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体，包括vegfa-clone1和vegfa-clone2，vegfa-clone1的重链可变区氨基酸序列：evqlqqsgpelvkpgasvemsckasgytftsyvmhwvkqkpgqglewigyinpynydtkynekfkgkasltsdkssstaymelssltsedsavyyctrggdfdywgqgttltvssvegfa-clone1的轻链可变区氨基酸序列：qavviqesalttspgetvtltcrsstgavttsnyanwvqekpdhlftgliggsnnrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcgllysnnwvfgggtkltvlvegfa-clone2的重链可变区氨基酸序列：evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftlyvihwvkqkpgqglewigyinpyidgtkynekfkgkatltsdkssstafmelssltsedsavyycarsgygnyglawlaywgqgtlvtvsavegfa-clone2的轻链可变区氨基酸序列：qivltqspaimsaslgervtmtctasssvypsylywyqqkpgsspklwiyttsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrsrtfgggtkleik鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体的制备方法，将亲和纯化后的人血管内皮生长因子vegf165与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，酶联免疫吸附测定抗体效价，筛选免疫好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过hat筛选培养基筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，筛选出能识别vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206所有亚型的阳性细胞株，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株，用无血清培养和发酵细胞株，收集培养上清。
14.人血管内皮生长因子的亲和纯化：菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用预装柱进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗杂和洗脱，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐 缓冲液中，0.22um滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度。
15.vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206所有亚型的人血管内皮生长因子的表达生产：将pet30a-vegf165 、pet30a-vegf121、pet30a-vegf145、pet30a-vegf189、
pet30a-vegf206表达质粒，分别转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落分别进行诱导表达，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养至od600nm至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达后分别收集菌体。
16.鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体在制备人血管内皮生长因子化学发光检测试剂盒中的应用。
17.人血管内皮生长因子化学发光检测试剂盒。试剂盒使用vegfa-clone1和vegfa-clone2分别作为包被抗体和检测抗体。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体，包括vegfa-clone1和vegfa-clone2，能够识别免疫原，还能识别其他亚型的筛选原，此抗体组合具有特异性和高亲和力的特点，同时也提供了基于上述抗体的化学发光检测试剂盒，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度，对于肿瘤的早期发现具有很大的临床意义。
附图说明
19.图1为本发明试剂盒与其他试剂盒检测结果相关性图。
实施方式
20.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1人血管内皮生长因子表达载体的构建 在ncbi官网上查找vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206氨基酸序列，在蛋白氨基酸的n端或者c端加上组氨酸标签，利用密码子优化软件在大肠杆菌表达系统中优化密码子，基因合成后利用ndei&xhoi限制性内切酶酶切位点，将基因克隆至pet30a表达载体中，构建pet30a-vegf165、pet30a-vegf121、pet30a-vegf145、pet30a-vegf189、pet30a-vegf206表达质粒，并测序验证基因序列。
22.实施例2人血管内皮生长因子的表达生产分别将pet30a-vegf165、pet30a-vegf121、pet30a-vegf145、pet30a-vegf189、pet30a-vegf206表达质粒，转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落进行诱导表达，在含有50ug/ml的卡那霉素的lb培养基中培养，培养温度区间为20℃，220rpm条件下培养至od600nm至0.6-0.8时，加入0.2mmiptg进行诱导表达，诱导15-18小时，8000g，离心10min，分别收集五种亚型的菌体。
23.实施例3人血管内皮生长因子的亲和纯化菌体用20mmpb，300mmnacl，10%甘油，ph8.0的缓冲液重悬，用800bar压力进行高压均质后，12000g，离心30min，取上清，用预装柱nismart-6ffbeads进行亲和纯化，20mmpb，300mmnacl，10%甘油，50mm咪唑，ph8.0溶液进行洗杂，20mmpb，300mmnacl，10%甘油，250mm咪唑，ph8.0溶液进行洗脱，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至20mmpb，300mmnacl，10%甘油，ph8.0缓冲液中，0.22um滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度。
24.实施例4单克隆抗体的制备将vegf165蛋白与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，皮下多点注射，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，皮下多点注射，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，elisa检测抗体效价，筛选免疫较好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过10天左右的hat筛选培养基筛选培养后，取上清进行elisa检测，包被抗原选择vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206，筛选出性能较优的阳性细胞株，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株，用无血清培养和发酵细胞株，收集培养上清，进行抗体纯化，将纯化后的抗体进行诊断性能分析。
25.此步骤能确保本发明不仅能识别vegf165蛋白，也能识别其他四种亚型的筛选原。
26.实施例5单克隆抗体性能分析vegf化学发光检测试剂盒的制备基于双抗体夹心法和吖啶酯发光法原理制备试剂盒。
27.1、制备链霉亲和素磁微粒使用磁微粒缓冲液（50mmpb、150mmnacl、3%trehalose、0.1%proclin300）将购买的赛默飞公司链霉亲和素磁微粒稀释至固含量0.02%，作为r1试剂。
28.2、吖啶酯标记抗体将吖啶酯和vegf抗体按照分子摩尔比3：1的比例在pbs中标记反应2h；反应结束后用30kda超滤离心管进行超滤离心以去除游离吖啶酯；离心结束后，收集超滤管中的标记物并使用bca法检测吖啶酯-抗体浓度；将吖啶酯-抗体使用r2配制液稀释至1.5ug/ml，稀释后的溶液即为r2试剂，上述r2配制液配方为20mmtris、200mmkcl、2%bsa、0.1%tween20、0.1%proclin300。
29.3、生物素标记抗体将nhs酯化的生物（赛默飞，ez-linknhs-peg4-biotin）与本发明的抗vegf抗体按照摩尔比5：1比例在pbs中反应标记1h；反应结束后用30kda超滤离心管进行超滤离心，离心结束后在超滤管上部加入pbs再次离心，重复两次；收集超滤管中的生物素-抗体标记产物，并使用bca法检测抗体浓度；使用r3配制稀释液稀释上述产物至抗体浓度2ug/ml作为r3试剂，r3配制稀释液的配方为20mmtris、50mmkcl、2%casein、0.1%tween20、0.1%proclin300。
30.4、配制校准品和质控品使用抗原稀释液将vegf抗原分别稀释至0、8、20、100、600、6000pg/ml，分装至校准品管中。
31.使用抗原稀释液将vegf抗原稀分别释液至20、600pg/ml，分装至质控品管中。
32.上述抗原稀释液配方为1
×
pbs、1%bsa。
33.检测试剂盒与同类产品对比实施例中的vegf化学发光检测试剂盒与英国abcam公司的人vegfelisa试剂盒在120例临床标本上进行了相关性对比，数据如图1所示。相关系数r2为0.992。说明本发明的试剂盒能准确检测vegf含量，为临床诊断提供依据，能够充分满足临床体外诊断检测需求。
34.检测试剂盒灵敏度和精密度考察按照临床和实验室标准协会灵敏度验证分析指南文件clsi:ep17-a2对本发明中
的试剂盒的空白限和检测限进行了研究，结果表明空白限和检测限分别为4 pg/ml和8 pg/ml。
35.按照临床和实验室标准协会精密度验证分析指南文件clsi:ep5-a3对本发明的试剂盒进行精密度研究，使用3个批号的试剂和校准品，对2个水平的质控品进行了检测，每天上下午各检测两次，连续考察5天，结果表明各批次室内总精密度小于5%。
36.检测试剂盒抗干扰能力分析在vegf浓度约为20 pg/ml和600 pg/ml浓度水平的两个血清样本中分别添加不同浓度的干扰物，以未添加组为对照，添加组和对照组两者相对偏差小于5%为干扰可接受标准，研究不同干扰物的最大浓度水平（不超过临床可见最高浓度）。
37.表1 检测试剂盒抗干扰能力分析数据
38.结果表明：如表1中的浓度时对检测结果干扰不明显。
39.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体，其特征在于：包括vegfa-clone1和vegfa-clone2，所述vegfa-clone1的重链可变区氨基酸序列如seq id no.1所示，vegfa-clone1的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示；所述vegfa-clone2的重链可变区氨基酸序列如seq id no.3所示，vegfa-clone2的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。2.一种权利要求1所述的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将亲和纯化后的人血管内皮生长因子vegf165与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，酶联免疫吸附测定抗体效价，筛选免疫好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过hat筛选培养基筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，筛选出能识别vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206所有亚型的阳性细胞株，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株，用无血清培养和发酵细胞株，收集培养上清。3.根据权利要求2所述的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：人血管内皮生长因子的亲和纯化：菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用预装柱进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗杂和洗脱，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐 缓冲液中，0.22um滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度。4.根据权利要求3所述的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：vegf165、vegf121、vegf145、vegf189、vegf206所有亚型的人血管内皮生长因子的表达生产：将pet30a-vegf165 、pet30a-vegf121、pet30a-vegf145、pet30a-vegf189、pet30a-vegf206表达质粒，分别转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落分别进行诱导表达，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养至od600nm至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达后分别收集菌体。5.权利要求1所述的鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体在制备人血管内皮生长因子化学发光检测试剂盒中的应用。6.人血管内皮生长因子化学发光检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1中的vegfa-clone1和vegfa-clone2。7.根据权利要求6所述的人血管内皮生长因子化学发光检测试剂盒，其特征在于：试剂盒使用vegfa-clone1和vegfa-clone2分别作为包被抗体和检测抗体。

技术总结
本发明公开了鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体及其制备方法和应用，包括VEGFA-Clone1和VEGFA-Clone2，VEGFA-Clone1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；VEGFA-Clone2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。制备方法：将亲和纯化后的人血管内皮生长因子VEGF165与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，采集小鼠血液分离血清，筛选免疫好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，筛选出能识别VEGF165、VEGF121、VEGF145、VEGF189、VEGF206所有亚型的阳性细胞株，克隆出单克隆细胞株。此抗体组合具有特异性和高亲和力的特点，同时也提供了上述抗体的诊断检测试剂盒，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度。特异性和灵敏度。特异性和灵敏度。


技术研发人员：芮兵
受保护的技术使用者：南京佰抗生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.06
技术公布日：2023/10/15